Кристаллография, 2019, T. 64, № 1, стр. 95-98

ВВЕДЕНИЕ

Ферменты семейства фосфорибозилпирофосфатсинтетаз (PRPP-синтетазы, КФ 2.7.6.1) катализируют образование 5-фосфорибозилпирофосфата (5-PRPP) из аденозинтрифосфата и рибозо-5-фосфата (Р5Ф) [1]. Продукт катализируемой реакции является промежуточным соединением в ряде важных метаболических процессов, приводящих к синтезу пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, коферментов, а также аминокислот гистидина и триптофана [2–6]. В некоторых бактериях 5-PRPP является субстратом более чем десяти ферментов. Поэтому 5-PRPP является важнейшим клеточным метаболитом, а PRPP-синтетазы относятся к ключевым ферментам, необходимым для жизни организма [7].

Некоторые ферменты, участвующие в нуклеотидном обмене, широко применяются в биотехнологии для химико-ферментативного синтеза аналогов природных нуклеотидов, многие из которых используются как противовирусные и противоопухолевые препараты [8]. Показано, что ферменты нуклеотидного обмена представляют интерес как кандидаты для использования в новой стратегии биосинтеза биологически важных нуклеотидов, так называемом каскадном методе биосинтеза [8]. Новая стратегия состоит в мультиферментном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды c использованием определенных ферментов нуклеинового обмена. Каскадный синтез включает в себя последовательное превращение в “одной колбе” D-пентоз сначала в 5-фосфопентозы под действием рибокиназы, затем под действием PRPP-cинтетазы в 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты (5-PRPP); присоединение 5-фосфорибозильной группы к гетероциклическому пуриновому основанию в присутствии аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает конечные нуклеотиды. PRPP-синтетаза катализирует вторую стадию каскада.

Для биотехнологического применения предпочтительны ферменты, имеющие высокий температурный оптимум активности. Таким требованиям отвечают ферменты из термофильных организмов. Не менее важна и субстратная специфичность используемых ферментов. Меньшая степень селективности по отношению к пуриновому основанию и к углеводному субстрату дает возможность расширить круг синтезируемых соединений. Поэтому весьма актуален поиск мутантных форм ферментов, имеющих более широкую специфичность.

Показано, что в геноме бактерии Thermus thermophilus, принадлежащей к группе термофилов, белки с PRPP-синтетазной активностью кодируются двумя генами [9]. Оба гена были клонированы и экспрессированы, обе PRPP-синтетазы, Th. thermophilus PRPP-синтетазы I и II, выделены и охарактеризованы [9]. Оба фермента несколько различаются по длине полипептидной цепи. PRPP-синтетаза I содержит 307, а PRPP-синтетаза II 310 аминокислотных остатков, степень сходства между ними достигает 89%. Высокая степень сходства обеих аминокислотных последовательностей с PRPP-синтетазой из E. coli, более 75%, говорит об их принадлежности к первому классу PRPP-синтетаз. Оба фермента имеют максимальную активность при высокой температуре (75 и 85°С) и в этом отношении подходят для биотехнологического применения. В связи с перспективой биотехнологического применения, особый интерес представляет изучение особенностей структуры данных ферментов в комплексе с функциональными лигандами.

Отметим, что для PRPP-синтетазы из Th. thermophilus имеется пространственная структура фермента в комплексе с аденозиндифосфатом (АДФ) [10], что значительно упрощает построение стартовой модели для молекулярно-динамического эксперимента.

В настоящей работе методом молекулярной динамики получен комплекс PRPP c АТФ и 5-PRPP. На основе полученных данных выбраны аминокислотные остатки, замена которых может привести к изменению субстратной специфичности фермента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения молекулярно-динамических экспериментов в качестве исходной модели использованы координаты PRPPS из Th. thermophilus в комплексе с АДФ, взятые из банка данных RCSD PDB(PDB ID:5T3O). Данный комплекс получен в [10] с разрешением в 2.2 Å методом РСА (Р5Ф).

Для добавления в систему необходимых лигандов (АТФ и Р5Ф) при помощи программы Coot [11] получены координаты АТФ путем наложения его на АДФ. Стартовые координаты Р5Ф получены при наложении координат исследуемой структуры на координаты структуры PRPP-синтетазы из Thermoplasma volcanium в комплексе с Р5Ф(PDBID: 3MBI) по Cα-атомам основной цепи. Структура, содержащая Р5Ф, получена методом РСА при разрешении в 1.8 Å.

Для моделирования молекулярной динамики атомы белка и лигандов были параметризованы в силовом поле Charmm36 [12]. Построение топологии белка проведено при помощи встроенной в программу GROMACS [13] утилиты pdb2gmx, построение топологии лигандов – при помощи веб-сервиса Charmmgui [14].

В качестве ячейки для моделируемой системы выбран куб, минимальное расстояние до ребер которого составляло 1 Å. Затем ячейка была заполнена водой типа TIP3P и добавлено 12 ионов Na для компенсации заряда в системе.

Затем была проведена минимизация энергии для релаксации возможных напряжений, возникших при сольватации. После минимизации энергии на атомы системы были наложены ограничения и установлены давление в 1 атмосферу и температура в 330 K. После установления всех необходимых параметров ограничения были сняты и проведен молекулярно-динамический эксперимент, в результате которого получены траектории движения всех атомов системы на временном интервале в 50 нс. Протокол молекулярной динамики описан в таблице.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полученная траектория проанализирована при помощи наложения атомов углерода основной цепи системы на их исходное положение и построен график среднеквадратичного отклонения молекулы белка и лигандов от своего положения (рис. 1). Полученные данные показывают, что система пришла в состояние равновесия.

Рис. 1.

Среднеквадратичное отклонение положений атомов белка (а), АТФ и 5-рибозофосфата (б).

Положение лигандов уточнено методом молекулярной динамики. После симуляции молекулярной динамики получены и проанализированы траектории движения атомов системы. Определены аминокислотные остатки, участвующие в связывании лигандов в активном центре HisB-Mt. Данные об окружении каждого из лигандов получены и проанализированы с помощью программы LigPlot.

Окружение R5P представлено на рис. 2. Фосфат образует водородные связи с карбоксильной группой Asp220 и Ala226, Ser228, Leu229. Аминокислотные остатки Ser228 и Gly227 связаны с атомом кислорода углеводного цикла. Гидроксильная группа С1 атома цикла образует водородные связи с атомами азота и кислорода гидроксильной группы Thr225 и атомами азота Ala226 и Gly227.

Рис. 2.

Окружение рибозо-5-фосфата в активном центре PRPP-синтетазы.

На рис. 3 показано, что АТФ образует водородные связи с белковыми цепями B и F, а также с R5P. Первые выражены связыванием трифосфата с аминокислотными остатками Arg196 и Lys100 цепи B и Arg183 и Lys176 цепи F. С R5P связывание осуществляется посредством образования водородной связи между гидроксильной группой С₃-рибозы и NH₂-группой аденозина.

Рис. 3.

Окружение АТФ в активном центре PRPP-синтетазы.

Временная модель комплекса PRPPS + R5P + + АТФ проанализирована с использованием программ VMD и GROMACS. Лиганды имеют стабильное положение в активном центре фермента, следовательно, модель может позволить судить об окружении лигандов. Далее с использованием программ VMD и GROMACS был получен файл с координатами модели на второй наносекунде молекулярно-динамической траектории. Файл преобразован в формат .pdb и проанализирован с использованием программы PyMol. За положение рибозного кольца R5P могут отвечать боковые группы аминокислотных остатков Ser-228 и Thr225 как наиболее близких к нему. Следующим этапом работы предполагается экспериментально проверить следующие мутанты: Ser228-Ala и Thr225-Ala, чтобы определить влияние данных аминокислотных остатков на активность и специфичность фермента.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 14-50-00131) в части молекулярного моделирования и Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части анализа данных молекулярного моделирования.