Кристаллография, 2019, T. 64, № 4, стр. 632-637

ВВЕДЕНИЕ

Лекарственный препарат “Фосфолиповит” (разработка Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва) представляет собой композицию соевых фосфолипидов, оказывающую терапевтическое воздействие на человеческий организм [1, 2]. Одновременно “Фосфолиповит” может использоваться как переносчик не растворимых в воде лекарств. Основной лекарственной субстанцией “Фосфолиповита” являются соевые фосфолипиды, терапевтическая эффективность которых доказана клинически. Препарат представляет собой лиофильно высушенный порошок, стабильный при комнатной температуре, хранящийся в порошке мальтозы в отношении 1 : 4. Молекулы мальтозы обеспечивают химическую стабильность лекарства. При регидратации “Фосфолиповита” образуется наноэмульсия с частицами очень малого размера. Подобные структуры (нанолекарства) составляют большую часть современного рынка бионанотехнологий, поэтому их изучение актуально не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения.

Для успешного применения везикул и мицелл фосфолипидов как лекарственных препаратов и переносчиков нанолекарств, а также для детального понимания механизма их прохождения в организм человека необходимо знать их размеры и структуру. Ввиду малого размера данных объектов (менее 100 нм) методы малоуглового рассеяния тепловых нейтронов (МУРН) и рентгеновских лучей (в том числе синхротронного излучения) наиболее информативны для прояснения структурной организации ассоциатов (пространственных объединений) фосфолипдов как в модельных [3, 4], так и непосредственно в практических препаратах [5]. В настоящей работе приведены результаты изучения структуры “Фосфолиповита” в виде раствора методом МУРН. Для обеспечения достаточного контраста и уменьшения некогерентного фона исследуемые растворы приготавливали на основе тяжелой воды (D₂O). Наличие дополнительного компонента (мальтозы) в практической системе усложняет структурный анализ. В частности, это потребовало дополнительного независимого определения плотности длины рассеяния (ПДР) буферных растворов мальтозы в D₂O. Для этой цели использовали два подхода. Сначала применяли нейтронную рефлектометрию зеркального отражения на границе раздела раствора с кристаллическим кремнием. Пучок нейтронов направлялся через кремний на границу раздела с жидкой средой, которая из-за тяжелой воды как основного компонента является оптически более плотной для нейтронов. Такое сочетание позволяет наблюдать полное отражение нейтронного пучка от границы раздела, а из наблюдаемого критического значения проекции вектора рассеяния на перпендикулярное направление находить ПДР жидкой среды. Также ПДР определена из прецизионных измерений массовой плотности растворов при варьировании содержания мальтозы. В результате анализа данных МУРН изучены морфология и форма ассоциатов в растворе “Фосфолиповита”, а также характер их взаимодействия, и исследована чувствительность параметров формы к концентрации.

ОЦЕНКИ ПЛОТНОСТИ ДЛИНЫ РАССЕЯНИЯ РАСТВОРОВ МАЛЬТОЗЫ В ТЯЖЕЛОЙ ВОДЕ

Измерения ПДР растворов мальтозы (C₁₂H₂₂O₁₁) в тяжелой воде необходимы для точной обработки данных малоуглового эксперимента по определению структуры ассоциатов лекарственного препарата “Фосфолиповит”, образующих взвесь в таком растворе. При приготовлении раствора порошок мальтозы добавляли в тяжелую воду, варьируя его массовую долю, которая составляла 4, 10 и 20%. Эксперимент по нейтронной рефлектометрии проводили на рефлектометре ГРЭИНС на импульсном реакторе ИБР-2 ЛНФ ОИЯИ (Дубна, Россия) [6]. Установка с горизонтальной ориентацией плоскости образца работает в режиме времени пролета. Коллимированный плоский пучок нейтронов направлялся в специальную ячейку через блок-подложку с низким поглощением (кристаллический кремний) и попадал на плоскую границу раздела с раствором мальтозы. Наклон пучка (~5 мрад) по отношению к поверхности контакта подложки с раствором обеспечивали с помощью отклоняющего нейтронного зеркала (длина зеркала 1 м, расстояние зеркало–образец 3 м). Зеркально отраженный пучок регистрировал двумерный позиционно-чувствительный детектор (размер 20 × 20 см, разрешение 2 × 2 мм, расстояние образец–детектор 3 м), усредняя отраженный пучок вдоль горизонтального направления. Интенсивность рассеяния измеряли как функцию проекции вектора рассеяния на перпендикулярное направление q_z = = (4π/λ)sin θ ≈ 4πθ/λ, где θ – фиксированный (5 мрад) угол скольжения, а λ – длина волны нейтронов в диапазоне 0.1–0.6 нм (тепловой режим замедлителя на ИБР-2). Кривую отражения получали делением на спектр пустого пучка, измеряемого отдельно (без ячейки). Полученные кривые отражения обрабатывали с помощью программы Sasview 3.0.0. [7]. Калибровку установки проводили с использованием многослойных пленок-стандартов, которые предварительно были откалиброваны с помощью рентгеновской рефлектометрии (установка Bruker D8 DISCOVER, Центр рентгенодифракционных исследований СПбГУ, Санкт-Петербург, Россия). Также был откалиброван кремниевый кристалл-подложка, используемый в нейтронных экспериментах.

Для границы раздела двух полубесконечных сред (кремниевая подложка и жидкость) кривая зеркального отражения следует закону Френеля:

где k_c,12 – критические значения проекции вектора рассеяния на направление, перпендикулярное границе раздела двух сред c соответствующими плотностями длины рассеяния ρ₁, ρ₂, которые определяются как

При известной ПДР первой среды (кремний) из экспериментально найденных значений k_c,12 оценивали плотность ρ₂. Такая оценка не требует никаких допущений и является наиболее “прямым” способом определения искомой ПДР. На рис. 1 для сравнения представлены экспериментальные кривые отражения нейтронов и расчетные кривые Френеля; величины ρ₂, полученные с использованием (2), даны на рис. 2 и собраны в табл. 1.

Альтернативный предыдущему способ оценки ПДР растворов при различных концентрациях мальтозы – измерение массовой плотности раствора ρ с последующим расчетом ПДР по формуле

где n_i, b_i, μ_i – соответственно массовая концентрация, длина рассеяния и молярная масса i-го компонента раствора, N_A – число Авогадро. В случае раствора мальтозы в тяжелой воде имеем где ${{n}_{{\text{м }}}}$, ${{n}_{{{{{\text{D}}}_{2}}{\text{O}}}}}$ = (1 – ${{n}_{{\text{м }}}}$) – массовые концентрации мальтозы и тяжелой воды; ${{b}_{{\text{м }}}}$, ${{b}_{{{{{\text{D}}}_{2}}{\text{O}}}}}$ – длины рассеяния компонентов раствора; ${{{\mu }}_{{\text{м }}}}$, ${{{\mu }}_{{{{{\text{D}}}_{2}}{\text{O}}}}}$ – молярная масса компонентов; ρ(${{n}_{{\text{м }}}}$) – функция зависимости массовой плотности раствора от концентрации мальтозы.

Для получения зависимости ρ(${{n}_{{\text{м }}}}$) на плотномере DMA 5000M (ЛНФ ОИЯИ) были измерены массовые плотности растворов с концентрациями 4, 8 и 20%, которые составили соответственно 1.118043, 1.131589, 1.173363 г/см³ (ошибка плотномера 10^–6 г/см³). В результате получили зависимость

Зная ρ(${{n}_{{\text{м }}}}$) и молярные массы/длины рассеяния молекул раствора (${{{\mu }}_{{{{{\text{D}}}_{2}}{\text{O}}}}}$ = 20, ${{{\mu }}_{{\text{м }}}}$ = 342.3 г/моль, ${{b}_{{{{{\text{D}}}_{2}}{\text{O}}}}}$ = 1.92 × 10^–12, ${{b}_{{\text{м }}}}$ = 6.28 × 10^–12 см), получили зависимость плотности длины рассеяния раствора от концентрации мальтозы (рис. 2), которая соответствует формуле (4). Сравнение двух видов оценки зависимостей показывает, что отклонение результатов не превышает 5%, что с учетом разрешения экспериментальной установки (нейтронный рефлектометр) ~5% является достаточно надежным результатом.

АНАЛИЗ ДАННЫХ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ НЕЙТРОНОВ

Ниже приведены результаты анализа структуры лекарства “Фосфолиповит” в растворах по данным малоуглового рассеяния нейтронов. Эксперименты проводили на времяпролетной малоугловой установке ЮМО на импульсном реакторе ИБР-2 ЛНФ ОИЯИ (Дубна, Россия) [8]. Интенсивность рассеяния (дифференциальное сечение рассеяния, приведенное к единичному объему образца), изотропную по радиальному углу φ на детекторе большой площади (размер ~90 см), получали как функцию модуля вектора рассеяния, q = (4π/λ)sin(θ/2), где θ – угол рассеяния, λ – длина волны нейтронов в диапазоне 0.05–0.5 нм. Для получения кривых рассеяния в диапазоне q = 0.08–4.0 нм^–1 использовали два детектора, расположенные за образцом на расстояниях 4 и 16 м. Для калибровки интенсивности применяли ванадиевый стандарт. Все жидкие образцы помещали в кварцевые кюветы Hellmа (оптический путь 2 мм). Температуру на образце (диапазон 20–37°C) во время эксперимента поддерживали с помощью термостата с автоматическим контролем. Рассеяние на буферных растворах измеряли отдельно и вычитали из рассеяния на растворах. Первичную обработку данных выполняли с использованием программы SAS и режима сглаживания [9].

Интенсивность малоуглового рассеяния на ассоциатах в растворах моделировали стандартным образом [3, 4]:

где F(q) – формфактор ассоциата, S(q) – структурный фактор, определяемый характером взаимодействия ассоциатов между собой, A – объемная концентрация ассоциатов (число частиц в 1 см³), B – остаточный фон после вычитания рассеяния на буферном растворе.

Формфактор ассоциата моделировали в однородном приближении, предполагая ПДР постоянной и рассматривая две возможные формы: анизотропную мицеллу и сферическую везикулу. В первом случае мицеллы представляли собой эллипсоиды вращения с формфактором рассеяния [10]:

Здесь J(x) = $3\frac{{\sin (x) - x{\;cos}(x)}}{{{{x}^{2}}}}$, Δρ – разность ПДР мицеллы и раствора, V – объем мицеллы, a – малая полуось эллипсоида, $v$ – отношение большой и малой полуосей.

Формфактор сферической везикулы, когда растворитель с мальтозой свободно проникает в ее полость при сборке, имеет вид

где V₁, R₁, V₂, R₂ – объемы и радиусы внутренней и внешней сфер везикулы, Δρ – разность ПДР бислоя и раствора.

Зная значения ПДР раствора, можно с большей точностью определять параметры форм. В случае малой концентрации структурный фактор принимали равным единице. В случае больших концентраций (более 5%) для структурного фактора пробовали модель жестких сфер Hard Sphere Structure [11] и модель средней сферической аппроксимации Hayter MSA Structure [12, 13], представляемые программой Sasview 3.0.0. В первом случае потенциал взаимодействия описывается следующим образом:

Во втором случае между сферическими объектами, находящимися в диэлектрической среде, действует кулоновское отталкивание из-за заряда на поверхности:

Здесь φ₀ = $\frac{Z}{{{\pi \varepsilon }{{{\varepsilon }}_{0}}2(1 + kR)}}$ – поверхностный потенциал, k = ${{\left( {\frac{{z{{e}^{2}}\bar {N}}}{{{{k}_{{\text{B}}}}T}}} \right)}^{{1/2}}}$, ε₀ – диэлектрическая постоянная, ε – диэлектрическая проницаемость среды, R – внешний радиус везикулы, z – заряд, $\bar {N}$ – количество везикул в единице объема. Структурный фактор S(q) находится путем фурье-преобразования радиальной функции распределения g(r), рассчитываемой по программе SASview исходя из заданных параметров потенциалов взаимодействия.

Изменения кривой МУРН с ростом концентрации прослеживаются на рис. 3. Дополнительно проверяли температурную стабильность раствора. Относительные изменения кривых рассеяния при концентрациях лекарства 5 и 25% при температурах 20 и 37°С не превышают 5%, что говорит о том, что исследуемые объекты стабильны при изменении температуры в биологическом диапазоне. Сравнение подгоночных кривых с экспериментальными данными (рис. 4) для разных формфакторов с большой степенью достоверности позволяет говорить, что препарат находится в растворе в форме везикул.

Тип взаимодействия определяли, используя кривую рассеяния концентрированного раствора (концентрация препарата 25%), где эффект структурного фактора наибольшим образом проявляется в области малых значений q. Из двух обозначенных ранее моделей взаимодействия в используемой программе обработки (Hard Sphere Structure и Hayter MSA Structure) наилучшим образом экспериментальную кривую описывает вторая модель (рис. 5), которая учитывает дополнительное кулоновское отталкивание везикул из-за заряда, аккумулирующегося на поверхности ассоциатов. Экспериментальные и расчетные кривые рассеяния для всех концентраций представлены на рис. 6 для сравнения. Параметры везикул собраны в табл. 2. Видно, что везикулы имеют критически малый размер, когда внутренний радиус везикулы (~40 Å) сопоставим с толщиной липидного бислоя (~31 Å). Оба структурных параметра везикул слабо меняются с ростом концентрации препарата в растворе. В то же время точность определения толщины липидного бислоя везикулы позволяет говорить о ее слабом (~4%), но различимом увеличении с ростом концентрации. Четкое указание на то, что везикулы “Фосфолиповита” взаимодействуют между собой как заряженные шарообразные частицы, говорит о наличии заряда на поверхности везикул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом малоуглового рассеяния нейтронов исследованы растворы лекарственного препарата “Фосфолиповит” в тяжелой воде с дополнительно содержащейся в них мальтозой, что необходимо в практических применениях. Показано, что “Фосфолиповит” в диапазоне концентраций до 25 мас. % образует в таких растворах устойчивые к температуре (диапазон 20–37°C) везикулы с критически малым размером: внутренний радиус (~40 Å) везикул сопоставим с толщиной липидного бислоя (~31 Å). Толщина липидного бислоя везикул слабо увеличивается с ростом концентрации препарата. Выявлен зарядовый характер взаимодействия везикул в растворе, который предполагает наличие заряда на внешней поверхности везикул.