Кристаллография, 2020, T. 65, № 1, стр. 79-86

ВВЕДЕНИЕ

Бактериальные фосфопантетеинаденилилтрансферазы (PPAT) участвуют в пятистадийном биосинтезе кофермента А (CoA) из пантотената (витамин В5), цистеина и аденозинтрифосфата (АТФ) [1]. РРАТ катализируют четвертую, предпоследнюю стадию этого процесса – образование дефосфокофермента А (dPCoA) из 4'-фосфопантетеина и АТФ (обратимый перенос аденилильной группы с АТФ на 4'-фосфопантетеин с освобождением пирофосфата и образованием dPCoA [2]). Фосфорилирование dPCoA на последней стадии процесса приводит к образованию СоА. Катализируемая PPAT реакция является ключевой; при избыточной концентрации СоА образует комплекс с РРАТ и тем самым ингибирует дальнейшее течение процесса. Поскольку биосинтез кофермента А в бактериях и в организмах млекопитающих протекает различно, РРАТ из патогенных организмов могут служить мишенями для разработки лекарств против болезней, вызываемых патогенами.

Пространственная структура одного из таких ферментов-мишеней – РРАТ из Mycobacterium tuberculosis (РРАТMt) – была установлена как для свободного фермента, так и для ряда его комплексов с функционально важными лигандами (АТФ, CoA, dPCoA, PhP), отражающими состояние фермента на разных стадиях катализируемой реакции [3–8]. По результатам исследования был предложен структурный механизм катализируемой реакции [7].

Кристаллы РРАТMt, использованные для рентгеновского исследования, были выращены в разных условиях и относились к разным пространственным группам симметрии: R32 и Р3₂. Кристаллы апо-фермента и комплексов с функционально важными лигандами (СоА, dРСоА, АТФ), выращенные в присутствии осадителя 1-метил-4-пентандиола (МПД), относились к пр. гр. R32. Кристаллы, полученные с сульфатом аммония в качестве осадителя, принадлежали пр. гр. Р3₂ и, несмотря на присутствие в кристаллизационном растворе функционального лиганда (например, АТФ), содержали молекулу фермента только в апо-форме.

В настоящей работе проведено сравнение упаковок молекул фосфопантетеинаденилилтрансферазы из M. tuberculosis (РРАТMt) в двух кристаллических структурах (пр. гр. R32, P3₂, PDB_ID: 4E1A, 4R0N соответственно). На основе анализа внутримолекулярных и межмолекулярных контактов рассмотрены возможные причины, препятствующие связыванию функциональных лигандов в активном центре кристаллической модификации P3₂.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рекомбинантный фермент РРАТMt получен и очищен по методике [6]. Кристаллы РРАТMt выращены методом встречной диффузии в капилляре в условиях невесомости, как описано в [5, 9, 10]. Кристаллы модификации R32 получены при использовании в качестве осадителя МПД в следующих условиях. Раствор белка (концентрацией 12 мг/мл) в буфере HEPES концентрацией 10 мM, pH 8.0, содержал 0.15 M NaCl, 1 мМ дитиотреитола. Состав осадителя: какодилатный буфер концентрацией 40 мМ, pH 5.5, содержащий 10 мМ MgCl₂, 0.15 мМ NaCl, 20 мМ гексамина кобальта и 15% МПД. При получении комплекса с АТФ в раствор белка добавляли 14 мМ АТФ. Кристаллы модификации Р3₂ получены из раствора белка, содержащего 10 мг/мл PPATMt, 10 мM HEPES, pH 8.0, 0.15 M NaCl и 14 мM АТФ. В раствор осадителя (0.1 M NaAc, pH 5.0, 10 мM MgCl₂, 5 мM HEPES, pH 8.0, 0.075 M NaCl, 14 мM АТФ) добавляли 1.1 M сульфата аммония в качестве осаждающего агента [8].

Координаты атомов пространственных структур, установленных с использованием кристаллов модификации R32 – апо-форма РРАТMt, комплексы с СоА, АТФ, dРСоА – представлены в банке данных белков (PDB_ID: 4E1A, 3RHS, 3UC5, 3RBA соответственно). Пространственная структура РРАТMt, установленная с использованием кристаллов модификации Р3₂, представляет апо-форму фермента (PDB_ID: 4R0N). При той же концентрации АТФ в растворах, что и при выращивании кристаллов комплекса фермента с АТФ (пр. гр. R32) [5], молекулы АТФ не вошли в активный центр, в нем был локализован ион сульфата (PDB_ID: 4R0N).

Сравнение структур выполнено посредством их совмещения по Сα-атомам с использованием программы Lsqkab комплекса ССР4 [11]. Анализ кристаллической упаковки, межмолекулярных и внутримолекулярных контактов в молекуле РРАТMt проводили с использованием программы PISA [12].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллы РРАТMt, использованные при рентгеновском исследовании свободного фермента и его комплексов, принадлежали двум кристаллическим модификациям (пр. гр. R32 и Р3₂). Было обнаружено, что при использовании полиэтиленгликоля в качестве осадителя методом сокристаллизации комплексы РРАТMt с функциональными лигандами кристаллизуются только в пр. гр. R32, в то время как сокристаллизация в присутствии соответствующих лигандов с осадителем – сульфатом аммония – позволяет вырастить кристаллы, относящиеся к модификации Р3₂ и представляющие собой апо-форму фермента. Для изучения особенностей упаковки молекул фермента в обеих кристаллических модификациях были проанализированы строение молекулы РРАТMt, внутримолекулярные и межмолекулярные контакты молекул в обеих пространственных группах.

Биологически активной формой фермента является гексамерная молекула РРАТ, состоящая из одинаковых субъединиц [6, 13]. Точечная группа симметрии молекулы 32; субъединицы связаны попарно осями второго порядка, а осью третьего порядка объединены в два тримера. В центре гексамерной молекулы фермента имеется заполненный растворителем канал диаметром более 20 Å (оценка проведена по расстояниям между Сα-атомами остатков, формирующих канал) у поверхности молекулы и 10 Å в зоне контакта тримеров гексамерной молекулы. Активный центр в каждой субъединице занимает большую полость, обращенную внутрь заполненного растворителем канала и несколько удаленную от области контакта тример–тример. Широкий вход в канал со стороны растворителя обеспечивает беспрепятственный доступ субстрата к связывающему участку активного центра. По периметру вход в канал ограничен подвижными петлями 36–46 и аминокислотными остатками спирали 128–136 каждой из субъединиц тримера [6]. В независимой части ячейки кристалла в пр. гр. R32 находится одна субъединица; гексамерная молекула фермента формируется операторами симметрии этой группы. В кристаллической структуре с пр. гр. P3₂ независимая часть ячейки содержит всю гексамерную молекулу, сохраняющую точечную псевдосимметрию 32 (рис. 1).

Рис. 1.

Гексамерная независимая молекула в структуре РРАТМt (4R0N).

Cравнение молекул апо-фермента в двух кристаллических модификациях (пр. гр. R32 и P3₂, структуры 4E1A и 4R0N соответственно) проведено путем совмещения Сα-атомов. Среднеквадратичное отклонение составило 0.406 Å. Сравнение межсубъединичных взаимодействий в молекулах позволяет предположить, что нарушение симметрии молекулы в модификации Р3₂ связано с разными характерами этих взаимодействий в обеих группах. Межсубъединичные контакты в молекулах апо-формы фермента в обеих кристаллических структурах приведены в табл. 1.

Молекулы фермента в апо-форме в обеих пространственных группах кроме молекул воды содержат молекулы глицерина (4E1A) или ионы SO₄ (4R0N). Молекула глицерина (Gol) в структуре 4E1A, расположенная вблизи активного центра, попадает в фермент из криораствора, используемого при замораживании кристаллов в процессе съемки. В кристаллах модификации Р3₂ каждая субъединица молекулы содержит ион SO₄, координированный аминокислотными остатками активного центра Arg90, His17, Ser127. Кроме того, в субъединицах G и C, принадлежащих разным тримерам молекулы, локализованы ионы SO₄, контактирующие с остатком Arg121. Эти ионы связаны между собой псевдоосью второго порядка и расположены вблизи друг друга (рис. 2). Связывание дополнительных ионов сульфата, входящих в состав осадителя в высокой концентрации, нарушает симметрию молекулы и может способствовать изменению характера кристаллической упаковки. Кроме того, ионы сульфата, являющиеся структурными аналогами фосфата, занимают в активном центре положение, которое в комплексе РРАТMt с АТФ занимают ионы фосфата [5] (рис. 3). Конкуренция между ионами сульфата из осадителя и фосфатами молекулы АТФ также затрудняет связывание функционального лиганда.

Рис. 2.

Ион SO₄, расположенный в активном центре субъединицы G, и ионы SO₄, дополнительно локализованные в субъединицах G (черный цвет) и C (серый цвет), находящихся в разных тримерах молекулы РРАТMt (4R0N) и связанных псевдоосью симметрии 2.

Рис. 3.

Совмещение пространственных структур 4R0N и комплекса PPATMt с АТФ (PDB_ID: 3UC5) по Сα-атомам. Ион SO₄ (4R0N) показан черным цветом, молекула АТФ (3UC5) – серым, одну из фосфатных групп этой молекулы координируют те же аминокислотные остатки Arg90 и His17, что и ион сульфата в 4R0N.

В кристаллической модификации R32 при межмолекулярных взаимодействиях все субъединицы молекулы имеют одинаковые контакты с соседями, так как молекула имеет точечную симметрию 32, элементы которой совпадают с элементами симметрии пр. гр. R32. В кристаллической модификации Р3₂, когда в независимой части ячейки содержится асимметричная гексамерная молекула, все субъединицы молекулы вовлечены в межмолекулярные контакты в разной степени. Межмолекулярные полярные контакты в двух кристаллических модификациях представлены в табл. 2. Наибольшее количество межмолекулярных полярных связей образуется между субъединицами молекулы (x, y, z) и субъединицами, связанными с ней следующими преобразованиями симметрии: –y + 1, x – y + 1, z – 1/3 (K–E*, A–I*, K–I*, звездочкой отмечены субъединицы соседней молекулы); –y, x – y, z – 1/3 (A–G*, C–G*) (табл. 2). Субъединицы I и C* исходной молекулы и молекулы, связанной с ней оператором симметрии –y, x – y + 1, z + 2/3, образуют две пары антипараллельных водородных связей (табл. 2). На рис. 4 представлена независимая молекула фермента кристаллической модификации Р3₂ в окружении молекул, связанных с ней преобразованиями симметрии: –y + 1, x – y + 1, z – 1/3; –y, x – y, z – 1/3; –y, x – y + 1, z + 2/3. По одной H-связи (табл. 2) формируется также между субъединицей G молекулы (x, y, z) и A*, связанной с исходной преобразованием симметрии –y, x – y, z + 2/3, и субъединицами E (x, y, z) и K* (–y + 1, x – y + 1, z + + 2/3). В межмолекулярных контактах преимущественно участвуют аминокислотные остатки спиралей 15–28, 46–58, 72–80, концевой спирали 147–156, остатки ленты 65–69, петель 36–46, 68–72, 135–140. На рис. 5а представлена независимая молекула кристаллической модификации P3₂, на которой выделены аминокислотные остатки, способные образовывать полярные и гидрофобные контакты с соседними молекулами в кристаллической ячейке. В табл. 3 приведены некоторые величины, отражающие разную степень взаимодействия между субъединицами независимой молекулы PPATMt и молекулами из ее ближайшего окружения, сформированного в результате преобразований симметрии, приведенных в табл. 3.

Рис. 4.

Независимая молекула фермента кристаллической модификации Р3₂ в окружении молекул, связанных с ней преобразованиями симметрии: –y + 1, x – y + 1, z – 1/3; –y, x – y, z – 1/3; –y, x – y + 1, z + 2/3. Водородные и гидрофобные контакты с соседними молекулами выделены темными сферами.

Рис. 5.

Области молекулы: а – 4R0N, аминокислотные остатки которой могут образовывать водородные и гидрофобные контакты с соседними молекулами; б – 4E1A, образующие водородные и гидрофобные контакты с соседними молекулами. Зоны контактов выделены темными сферами.

В кристаллах модификации R32, в которых независимая часть кристаллической ячейки содержит только одну субъединицу, гексамерная молекула фермента, построенная с помощью операторов симметрии пр. гр. R32, контактирует с соседними молекулами в области ленты 64–69, петли 70–72, нерегулярного участка 139–146, спирали 72–81, концевой спирали 147–156 (рис. 5б). Молекула PPATMt (пр. гр. R32) образует контакты с соседними молекулами, связанными с исходной преобразованиями симметрии x – y, –y, ‒z и y, x, –z. В полярные и гидрофобные межмолекулярные взаимодействия вовлечены по 16 остатков каждой субъединицы, два из которых образуют водородные связи (табл. 2). Сравнение полярных контактов (табл. 2) для двух кристаллических модификаций показывает, что в кристаллах фермента, принадлежащих разным пространственным группам, в межмолекулярные полярные взаимодействия вовлечены два общих остатка Asp75 и Ser79, но эти аминокислотные остатки образуют разные межмолекулярные контакты.

Упаковки молекул в обеих кристаллических модификациях представлены на рис. 6. В кристаллах R32, в которых тройная ось симметрии гексамерной молекулы совпадает с кристаллографической осью симметрии 3 (параллельна оси 3₁), а двойные ее оси – с кристаллографическими двойными осями, гексамерные молекулы фермента уложены вдоль оси третьего порядка кристаллической ячейки. В результате внутренние каналы молекул образуют сплошные каналы вдоль оси c кристаллической решетки (гексагональная установка ромбоэдрической ячейки кристалла), и доступ лигандов в активный центр остается открытым (рис. 6а). В кристаллах модификации P3₂ псевдоось симметрии третьего порядка молекулы наклонена к оси 3₂ кристаллической ячейки. Гексамерные молекулы уложены таким образом, что входы во внутренний канал молекулы оказываются частично перекрытыми из-за межмолекулярных контактов, в которых участвуют некоторые аминокислотные остатки подвижной петли, расположенной по периметру канала (рис. 6б). В структуре 4R0N в гидрофобных взаимодействиях между молекулами, связанными преобразованиями симметрии x, y, z – 1, участвуют остатки Lys41, Thr42, принадлежащие подвижной петле 36–46, по периметру ограничивающей вход в канал молекулы [6]. Другие преобразования симметрии вовлекают в межмолекулярные взаимодействия Asp46 из той же петли и Leu136 спирали 128–136, которая также ограничивает вход в молекулярный канал [6].

Рис. 6.

Упаковка молекул в кристаллических структурах: а – 4E1A, пр. гр. R32; б – 4R0N, пр. гр. P3₂.

Упаковка молекул в кристаллах модификации Р3₂ (4R0N) более компактная, чем в модификации R32 (4E1A). Коэффициенты Метьюса [14] для структур 4R0N и 4E1A соответственно равны 2.28 и 3.08 ų/Да, что свидетельствует о большей доли растворителя в ромбоэдрической структуре 4E1A – 59.27%. Доля растворителя в структуре 4R0N составляет 46.16%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кристаллы фосфопантетеинаденилилтрансферазы Mycobacterium tuberculosis (РРАТMt), выращенные с использованием в качестве осадителя 2-метил-2,4-пентандиола, принадлежат пр. гр. R32, а выращенные в присутствии осадителя сульфата аммония – пр. гр. Р3₂. Сравнение строения молекул апо-формы РРАТMt в двух кристаллических модификациях показало различия между молекулами, которые могут привести к изменению упаковки, например нарушению точечной симметрии молекулы 32 из-за связывания молекулой иона сульфата. Сравнение упаковок молекул РРАТMt в разных кристаллических модификациях показало, что в кристаллах пр. гр. P3₂ молекулы упакованы более плотно, а доступ к активному центру молекулы ограничен межмолекулярными контактами. Независимая гексамерная молекула в кристаллах пр. гр. P3₂ образует большее количество полярных межмолекулярных контактов (табл. 2), чем симметричная молекула в кристаллической структуре 4E1A (пр. гр. R32). Количество остатков, вовлекаемых в межмолекулярные взаимодействия, также разное (102 в кристаллической модификации Р3₂, 96 в R32).

Работа выполнена в рамках Федеральной космической программы 2016-2025 (ОКР “МКС (Наука)”) в части решения и уточнения структуры белка, а также при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках Государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части сравнения упаковок белковых молекул.