Кристаллография, 2020, T. 65, № 2, стр. 271-280

Структура комплекса уридинфосфорилазы из Vibrio Cholerae с 2,2'-ангидроуридином и его исследование методами молекулярной динамики

П. А. Эйстрих-Геллер 1, С. В. Рубинский 1, И. И. Прокофьев 1, А. Г. Габдулхаков 1, А. С. Миронов 2, А. А. Лашков 1*

1 Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН
Москва, Россия

2 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Москва, Россия

* E-mail: alashkov83@gmail.com

Поступила в редакцию 17.06.2019
После доработки 17.06.2019
Принята к публикации 29.08.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Методом рентгеноструктурного анализа определена пространственная структура высокого разрешения комплекса уридинфосфорилазы из патогенной бактерии Vibrio cholerae с конкурентным ингибитором – 2,2'-ангидроуридином (RCSB IDPDB: 6RCA). Проведено сравнение пространственной структуры этого комплекса с ранее определенными структурами комплексов уридинфосфорилазы V. cholerae с субстратом (уридином) и уридинфосфорилазы S. typhimurium с 2,2'-ангидроуридином. Методом возмущения свободной энергии проведен расчет свободной энергии связывания ингибитора и субстрата с белком. Молекула 2,2'-ангидроуридина образует с активным центром фермента меньше устойчивых водородных связей, а их длина больше, чем в случае с природным субстратом фермента – уридином. Однако в расчетах, учитывающих энергию сольватации молекул и энтропийные эффекты, связывание ингибитора (2,2'-ангидроуридина) с активным центром белка оказалось энергетически выгоднее, чем нативного субстрата (уридина). Полученные результаты могут быть полезны при разработке новых ингибиторов с более высокой селективностью для сайтов связывания уридинфосфорилаз.

ВВЕДЕНИЕ

В клетках многих видов опухолей человека при развитии заболевания увеличивается потребность в азотистых пиримидиновых основаниях, что вызывает увеличение уровня экспрессии уридинфосфорилазы (UPh) – фермента, катализирующего реакцию фосфоролитического расщепления пиримидиновых нуклеозидов и обратную реакцию синтеза нуклеозидов из (дезокси-)рибозо-1-фосфата и азотистых оснований [15]. Поэтому в терапии онкологических заболеваний применяют фармакологические препараты, влияющие на процессы метаболизма азотистых оснований и их производных. Такими препаратами являются среди прочих ингибиторы UPh. Они являются сильными антипаразитическими и антимикробными препаратами, так как у большинства простейших в отличие от млекопитающих нет тимидинселективного фермента, необходимого для ресинтеза тимидина [6].

В настоящее время разработанные ингибиторы UPh (за исключением фосфанов) – это всевозможные производные пиримидиновых оснований. Снижение концентрации таких ингибиторов приводит к восстановлению активности UPh Таким образом, они являются обратимыми конкурентными ингибиторами [79].

Для разработки новых лекарственных препаратов – лигандов уридинфосфорилазы – необходимо детальное исследование методом рентгеноструктурного анализа (РСА) с высоким разрешением пространственной организации макромолекулярных комплексов UPh (в том числе, с существующими ингибиторами). В [10, 11] показано, что химические производные 2,2'-ангидроуридина (ANU) являются наиболее эффективными ингибиторами для большинства UPh клеток бактерий.

В [1214] описана структура комплексов уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (StUPh) с ANU, а также предложены модифицированные на основе 2,2'-ангидроуридина лиганды, имеющие более высокое сродство к UPh как про-, так и эукариот. В настоящей работе приведены результаты РСА с разрешением 1.34 Å комплекса ANU с уридинфосфорилазой из другого бактериального источника – холерного вибриона. Проведено сравнение пространственной структуры этого комплекса с ранее определенными структурами комплексов уридинфосфорилазы V. cholerea (VchUPh) с субстратом – уридином (URI) и уридинфосфорилазы S. typhimurium с 2,2'-ангидроуридином. Комплексы исследованы методами классической молекулярной динамики. Методом возмущения свободной энергии проведен расчет свободной энергии связывания белок–лиганд. Полученные результаты можно рассматривать как основу для химических модификаций 2,2'-ангидроуридина при разработке новых ингибиторов фермента с более высокой селективностью для сайтов связывания уридинфосфорилаз как про-, так и эукариот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и очистка VchUPh. Очистка препарата VchUPh проведена методом двухэтапной ионообменной хроматографии с использованием наполнителя бутил-сефароза на первом этапе и Q-сефароза (Amersham Pharmacia Biotech) – на втором. По результатам SDS-гель-электрофореза гомогенность препарата VchUPh составляла 96%. Методики наработки биомассы продуцента, выделения и очистки VchUPh описаны в [1517].

Кристаллизацию комплекса VchUPh с 2,2'-ангидроуридином проводили методом диффузии паров в варианте “висячей капли” при температуре 293 K. Кристаллизационные капли содержали 1.5 мкл раствора VchUPh концентрацией 15 мг/мл в буфере трис-HCl, 1.5 мкл противораствора (0.2 M МgCl2 · 6H2O, 15% (в/о) ПЭГ 4000, 0.1 M трис-HCl, pH 8.5) и 1 мкл водного раствора 0.2 М 2,2'-ангидроуридина. Кристаллы комплекса (рис. 1) росли в течение одной недели.

Рис. 1.

Кристаллы комплекса уридинфосфорилазы из V. cholerae с 2,2'-ангидроуридином.

Регистрация и обработка рентгенодифракционных данных. Рентгенодифракционный набор экспериментальных интенсивностей молекулы комплекса VchUPh c 2,2'-ангидроуридином в кристаллическом состоянии получен при температуре 100 K на линии BL14.1 синхротрона BESSYII (Берлин, Германия). С помощью программ комплекса XDS [18] проведена обработка экспериментального набора интенсивностей отражений. Параметры съемки и итоговая статистика рентгенодифракционного набора интенсивностей приведены в табл. 1.

Таблица 1.  

Характеристики получения экспериментального набора интенсивностей, обработки данных, решения и уточнения структуры

Получение экспериментального набора интенсивностей
Синхротрон, белковая станция BESSY, Beamline 14.1
Длина волны, Å 0.886
Детектор PSI PILATUS 6M
Пространственная группа P31
а = b; c, Å 93.25; 152.93
α = β; γ, град 90.00; 120.00
CC1/2** 99.9 (81.1)*
Диапазон разрешения при сборе данных, Å 44.60–1.34 (1.43–1.34)*
Полное число отражений 3 388 833 (515 634)*
Число независимых отражений 329 624 (52 973)*
Полнота набора, % 99.7 (99.0)*
RmeasF, % 14.7 (127.0)*
Среднее значение 〈I/σ(I)〉 11.52 (1.90)*
Общий температурный фактор Вильсона, Å2 16.61
Уточнение структуры
Диапазон разрешения при уточнении, Å 44.59–1.34 (1.36–1.34)*
Срезка набора, min(σ(|F |/|F |) 1.93
Число рефлексов в рабочем наборе 329 397 (12 720)*
Число рефлексов в тестовом наборе 3456 (135)*
Rwork, % 13.5 (26.6)*
Rfree, % 16.9 (29.1)*
Cruickshank DPI, Å 0.04
Число уточняемых неводородных атомов
белка 11480
неорганических ионов 6
лигандов 172
воды 2004
R.m.s.d. от “идеальной” геометрии
по длинам валентных связей, Å 0.017
по валентным углам, град 1.76
Среднее значение B-фактора для всех атомов, Å2 17.12
Статистика Рамачандрана
число а.о. в наиболее благоприятных областях, % 98.13
число а.о. в разрешенных областях, % 1.47
IDPDB 6RCA

  * В скобках приведены значения для последней зоны высокого разрешения.

** CC1/2 – коэффициент корреляции Пирсона между двумя случайно выбранными группами измеренных интенсивностей отражений, составляющих по половине от всего набора.

Решение и уточнение структуры. Для получения набора начальных фазовых компонент структурных факторов проведена процедура молекулярного замещения в программе Phaser [19, 20]. В качестве стартовой модели использована структура комплекса VchUPh с 6-метилурацилом (IDPDB: 4K6O) [21], из которой предварительно были удалены все лиганды, включая молекулы связанной ферментом воды. В дальнейшем при помощи программы phenix.refine были проведены циклы уточнения структуры [22, 23] как твердого тела (“rigid-body”), а затем уточнения с ограничениями (“restrain”). Коррекция структуры с визуальным контролем параметров стереохимии осуществлялась в программе Coot [24, 25]. При анализе σА-взвешенных карт электронной плотности с коэффициентами FoFc и 2FoFc выявлено положение молекулы ингибитора – 2,2'-ангидроуридина в активном центре фермента VchUPh. В структуре были локализованы и другие лиганды: глицерол, 1,2-этандиол, ионы хлора, магния, натрия и молекулы связанной воды. Температурные факторы атомов рассчитывали в анизотропном приближении. Корректность результатов уточнения структуры оценивали в программах Coot [24, 25], MolProbity [26] и PDB Validation Server (http://validate.rcsb.org). Основные значения параметров уточненной структуры приведены в табл. 1. Структура комплекса депонирована в RCSB PDB (IDPDB: 6RCA). Рисунки 3D-структур выполнены в программе PyMOL [27].

Молекулярное моделирование методом классической молекулярной динамики. Для исследования устойчивости связывания ANU c VchUPh проводили молекулярно-динамическое (МД) моделирование этого комплекса в пакете программ GROMACS (версия 2018.6) [28] с использованием набора полно-атомных силовых полей CHARMM [29, 30] версии C36m [31]. Обработка моделей лигандов с расстановкой частичных электрических зарядов атомов, параметров Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, констант жесткости для валентных связей, валентных и двугранных углов осуществлена с помощью WEB-сервиса CGenFF [32]. Молекулы воды задавались явно и описывались трехцентровой моделью TIP3P. Расчет дальних электростатических взаимодействий проводили методом частица–сетка (Partical-mesh Ewald, PME [23]), используя функцию кубической интерполяции. Для описания Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий использована функция сглаживания “force-switch” в интервале от 10 до 12 Å. Давление в системе контролировалось баростатом Паринелло–Рахмана [33] на уровне 1 бар. Температура МД-системы поддерживалась постоянной с помощью термостата V-rescale [34] на уровне 300 K. МД-процедуре предшествовала оптимизация атомных параметров моделей с использованием выбранного силового поля в виртуальной ячейке методом градиентного спуска, а также моделирование системы с ограничениями, накладываемыми на положения тяжелых атомов белка и лиганда в NVT- и NPT-ансамблях в течение 200 пс. Длина МД-траектории задавалась равной 10 нс. Для интегрирования с шагом 2 фс уравнений движения Ньютона использовался алгоритм с перескоками (“leapfrog”) [35].

Определение относительной аффинности связывания лиганда методом расчета линейной энергии взаимодействия (LIE, [36, 37]) осуществляли в программе gmx_lie программного пакета GROMACS. Для этого предварительно рассчитывали средние энергии силового поля Ван-дер-Ваальсовых ($E_{{vdw}}^{{solv}}$) и электростатических ($E_{{coul}}^{{solv}}$) взаимодействий лиганда с водой в системе лиганд–вода при МД-симуляции в течение 10 нс. Эмпирические константы α и β, определяющие вклад Ван-дер-Вальсовых и электростатических взаимодействий в оценку энергии связывания, выбраны в соответствии с [37] и для рассматриваемых в работе лигандов α = 0.18 и β = 0.33.

Расчет свободной энергии связывания лиганда с белком методом возмущения свободной энергии (FEP). Расчет свободной энергии связывания лиганда с белком (ΔGbind) проводили, используя термодинамический цикл, описанный в [38]. Первый этап заключался в сборе отсчетов разностей потенциальной энергии в зависимости от параметра связи Кирквуда (λ-параметр [39]). Для систем белок–лиганд и белок–вода МД-симуляцию проводили в течение 2 нс, используя алгоритм интегрирования с перескоками уравнения Ланжевена для каждого набора λ-параметров. В случае системы белок–лиганд наряду с параметрами для кулоновских и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий лиганда с белком вводили дополнительные ограничения с целью удержания лиганда в сайте связывания, при этом параметр λ менялся последовательно в диапазоне [0–1]. В случае системы лиганд–вода параметры связи меняли лишь для кулоновских и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий лиганда с водой. Необходимую для вычисления ΔGbind поправку на энергию введенных ограничений для системы лиганд–вода считали аналитически по формуле

$\begin{gathered} \Delta G_{{rest}}^{{solv}} = - RT\ln \left[ {\frac{{8\pi {{V}_{0}}}}{{{{r}_{{\text{A}}}}^{2}\sin {{{\theta }}_{{\text{A}}}}\sin {{{\theta }}_{{\text{B}}}}}}} \right. \times \\ \times \;\left. {\frac{{\surd {{K}_{r}}{{K}_{{{{{\theta }}_{{\text{A}}}}}}}{{K}_{{{{{\theta }}_{{\text{B}}}}}}}{{K}_{{{{{\varphi }}_{{\text{A}}}}}}}{{K}_{{{{{\varphi }}_{{\text{B}}}}}}}{{K}_{{{{{\varphi }}_{{\text{C}}}}}}}}}{{{{{(2\pi RT)}}^{3}}}}} \right], \\ \end{gathered} $
где ${{r}_{{\text{A}}}}$ – длина псевдосвязи (нм), ${{{\theta }}_{{\text{A}}}}$, ${{{\theta }}_{{\text{B}}}}$ угловые ограничения, ${{K}_{r}}$, ${{K}_{{{{{\theta }}_{{\text{A}}}}}}}$, ${{K}_{{{{{\theta }}_{{\text{B}}}}}}}$, ${{K}_{{{{\phi }_{{\text{A}}}}}}}$, ${{K}_{{{{\phi }_{{\text{B}}}}}}}$, ${{K}_{{{{\phi }_{{\text{C}}}}}}}$ – константы жесткости, ${{V}_{0}}$ – объем стандартного состояния (1.66 нм3), R – универсальная газовая постоянная, T – температура (K) [40]. До проведения МД-симуляций при каждом значении параметра связи λ проводили процедуры оптимизации геометрии и уравновешивания системы с ограничениями, накладываемыми на положения неводородных атомов белка и лиганда в NVT- и NPT-ансамблe в течение 100 пс. Для учета как дальних кулоновских, так и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий использовали PME [23], что позволило исключить дополнительный этап вычисления поправок на влияние дальних взаимодействий. Собранные с шагом 0.02 пс отсчеты ΔU обрабатывали в программе alchemical-analysis [41] с использованием метода множественного отношения вероятности принятия шага Беннетта (MBAR) [42].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пространственная организация структуры комплекса фермента VchUPh с 2,2´-ангидроуридином. Структурная организация комплекса фермента VchUPh с 2,2'-ангидроуридином аналогична рассмотренным ранее структурам VchUPh [15, 21, 43]. Каждая субъединица биологической молекулы VchUPh, представляющей собой тороидальный гомогексамер диаметром ∼106 Å, включает в себя 253 аминокислотных остатка (а.о.) (молекулярная масса = 27.5 кДа). Восемь β-тяжей (28% а.о.) и восемь α-спиралей (32% а.о.) формируют мономер по данным программы DSSP [44]. В межмономерной области каждого гомодимера гексамерной молекулы локализован ион Na+, координирующий три пары одноименных а.о. из смежных субъединиц гомодимера. В каждом димере находятся по два идентичных активных центра фермента, образованных а.о. обеих субъединиц гомодимера [4547]. Активный центр помимо сайта связывания включает в себя “петлю-шлагбаум” (L11). Во всех субъединицах гексамера структуры комплекса VchUPh c 2,2'-ангидроуридином определена открытая конформация L11 [43].

Активный центр комплекса VchUPh с 2,2'-ангидроуридином. 2,2'-ангидроуридин, связываясь с молекулой VchUPh, занимает весь нуклеозидсвязывающий сайт (рис. 2). Молекулы ингибитора локализованы во всех шести активных центрах гексамерной молекулы UPh. На примере активного центра субъединицы A гомодимера AB, где молекула лиганда в сайте связывания характеризуется полной заселенностью, видно, что ANU в нуклеозидсвязывающем сайте взаимодействует посредством водородных связей с консервативными а.о. нуклеозидсвязывающего сайта: NE2_Gln165/A – 3.33 Å – N3_ANU; OE1_Gln165/A – 2.95 Å – O4_ANU, NE2_His7/B – 2.64 Å – O5'_ANU; OE2_Glu197/A – 2.56 Å – O3'_ANU, OE1_Glu197/A – 3.33 Å – O3'_ANU. Значимое электростатическое взаимодействие (3.37 Å) также имеется между атомом N1_ANU и атомом кислорода основной цепи Thr93/A, формирующим подвижную стенку активного центра [21, 43]. Кроме того, ANU связывается с а.о. фермента через молекулу воды: NH2_Arg222/A – 2.88 Å – H2O – 3.49 Å – O4_ANU.

Рис. 2.

Пространственная организация ферментативного центра комплекса VchUPh с 2,2'-ангидроуридином (ANU; IDPDB: 6RCA). Показан фрагмент карты электронной плотности 2FoFc. Пунктиром показаны полярные контакты доноров и акцепторов водородных связей. Разными цветами показаны некоторые а.о. и элементы вторичной структуры разных субъединиц гомодимера AB.

Рис. 3.

Альтернативные конформации участка (92–95 а.о.) тяжа β5 комплекса VchUPh с 2,2'-ангидроуридином (ANU) (а); а.о. Arg167/A в структурах комплексов VchUPh с 2,2'-ангидроуридином (темный оттенок) и с уридином (URI) (светлый оттенок).

В описываемой структуре Arg167, являющийся также ключевым а.о. для связывания нуклеозидов и свободных гетероциклических оснований [21, 43], находится в двух альтернативных конформациях (рис. 2, 3б) (заселенность этих положений для A-субъединицы: 0.53 и 0.47). В обеих конформациях Arg167 не связан непосредственно с ANU, а связывается с ним через молекулу структурированной воды: NH2_Arg167/A – 3.01 Å – H2O – 2.60 Å – O4_ANU – для A-конформации (заселенность атомов – 0.47); NH1_Arg167/A – 2.85 Å – H2O – 2.60 Å – O4_ANU для B-конформации (заселенность атомов – 0.53). Отметим, что впервые обнаружено двойное положение консервативного а.о. активного центра при полной заселенности связанного, хоть и опосредованно, с ним лиганда. Кроме того, позиция молекулы воды, через которую Arg167 связывается с ANU, оказалась более стабильна (заселенность = 1.00; температурный фактор = 24.55 Å2), чем позиции атомов боковой цепи Arg167.

Боковая цепь Met196/A стабилизирует положение рибозной компоненты 2,2'-ангидроуридина посредством Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с атомами фуранозного кольца (C1'–C2'–C3'–C4'–O4') (рис. 2). Вблизи атома углерода С5 ароматического гетероцикла ANU находится гидрофобный карман, образованный Ilе220 и Ilе221 (рис. 2).

Влияние связывания 2,2'-ангидроуридина на конформацию структурно функциональных элементов VchUPh. Как и в рассмотренных ранее структурах высокого разрешения комплексов VchUPh с субстратами [43] и псевдосубстратом – 6-метилурацилом [21], в исследованной структуре наблюдаются двойные положения β5- и β8-тяжей при связывании фермента с лигандом, имеющим неполную заселенность. При этом одно из двойных положений фрагментов элементов вторичной структуры соответствует лигандированному состоянию, а второе – нелигандированному. Так, в рассматриваемой структуре в активных центрах C-, D-, E- и F-субъединиц молекулы ANU характеризуются неполной заселенностью. При этом в субъединицах наблюдается двойное положение участка (92–95 а.о.) тяжа β5 (рис. 3а), участвующего в формировании активного центра, а также параллельного ему участка β8-тяжа (217–219 а.о.). R.m.s.d. координат атомов а.о. 92–95 и 217–219 С-субъединицы между одним из двойных положений участка исследуемой структуры и соответствующих а.о. A-субъединицы структуры, нелигандированной VchUPh (IDPDB: 6EYP, разрешение – 1.22 Å), равно 0.18 Å. R.m.s.d. между а.о. 92–95 и 217–219 второго из двойных положений участков исследуемой структуры и соответствующими участками структуры, лигандированной субстратом фермента – уридином (IDPDB: 5M2T, [43]), равно 0.19 Å. R.m.s.d. между координатами атомов а.о. 92–95, 217–219, имеющих двойные положения в С-субъединице исследуемой структуры, равно 0.6 Å. Для D-, E- и F-субъединиц наблюдается аналогичная ситуация. Таким образом, двойные положения β5- и β8-тяжей могут свидетельствовать о крайних положениях этих структурных элементов VchUPh в процессе связывания фермента с ингибитором. Смещение β5-тяжа, возможно, обусловлено слабой водородной связью и электростатическим взаимодействием атомов ингибитора как с атомами основной, так и боковой цепи Thr93 (O_Thr93/C – 3.38 Å –N1_ANU; OG1_Thr93 – 3.70 Å – O4') (рис. 3а).

Сравнение структур комплексов VchUPh с 2,2'-ангидроуридином и уридином. При сравнении сайтов связывания структур комплексов VchUPh c уридином [42] (IDPDB: 5M2T; субъединица B, заселенность URI равна 1.00) и 2,2'-ангидроуридином (IDPDB: 6RCA; субъединица A) установлено, что среднеквадратичное отклонение между координатами атомов а.о. главной цепи нуклеозидсвязывающего сайта этих комплексов равно 0.60 Å, а боковых групп атомов а.о. – 0.71 Å. Наибольшие различия наблюдаются для положения и конформации остатков Thr93 и Phe6 из окружения лиганда (ANU либо URI).

При сравнении координат атомов а.о. Thr93, входящего в рибозосвязывающую часть активного центра, выявлено, что этот остаток располагается ближе к лиганду на ∼0.5 Å в структуре комплекса VchUPh с уридином [43] по сравнению со структурой VchUPh с ANU. Таким образом, активный центр структуры комплекса VchUPh с уридином является более компактным в сравнении со структурой VchUPh + ANU. Остаток Phe6 соседней субъединицы, хотя и не входит в сайты связывания VchUPh, находится в непосредственной близости от His8, входящего в рибозосвязывающую часть активного центра. Боковая цепь Phe6 представляет собой объемный фенильный радикал, который может ограничивать прохождение лигандов в активный центр фермента. По-видимому, различие в положении боковой цепи Phe6 в структурах комплекса VchUPh с ANU и URI (r.m.s.d. координат атомов = 3.61 Å) обусловлено взаимодействием Ван-дер-Ваальса c атомами боковой цепи Ile227 петли-шлагбаума L11 [21, 43]. Петля L11 в структуре комплекса VchUPh с уридином в субъединице B находится в закрытом положении в отличие от структуры комплекса VchUPh с ингибитором.

Основное различие в формируемых лигандами водородных связях (рис. 4) обусловлено прежде всего конфигурацией лигандов (уридина и 2,2'-ангидроуридина) и относительным расположением их функциональных групп по отношению к а.о. активного центра. Среднеквадратичное отклонение между координатами всех аналогичных атомов уридина и 2,2'-ангидроуридина равно 1.01 Å, координат атомов пиримидиновой компоненты – 1.11 Å, рибозной – 0.80 Å. Фуранозный цикл молекулы уридина находится в напряженной твист-конформации – C1'-endo/O4'-exo [42], а молекулы ANU – в конформации “конверт” – С4'-exo. Таким образом, уридин, деформируясь под влиянием а.о. сайта связывания, находится в высокоэнергетической конформации [43]. Кроме того, ANU, имея дополнительную ковалентную связь O2–C2', обладает большей жесткостью в сравнении с молекулой уридина. В отличие от уридина атом N3 2,2'-ангидроуридина оказался не связанным водородной связью с атомом OE1 боковой цепи а.о. Gln165; расстояние между этими атомами во всех лигандированных субъединицах превышает 3.40 Å. Объясняется этот факт другим по сравнению с уридином положением пиримидинового кольца в молекуле 2,2'-ангидроуридина. Лиганд 2,2'-ангидроуридин в отличие от уридина не формирует устойчивую водородную связь и с другим консервативным а.о. урацилсвязывающей части активного центра – Arg167, а связывается с ним через молекулу структурированной воды (рис. 4).

Рис. 4.

Совмещение а.о. активных центров структур комплексов VchUPhc 2,2'-ангидроуридином (IDPDB: 6RCA, ANU) и уридином (IDPDB: 5M2T; URI).

Различия имеются и в связывании рассматриваемых лигандов рибозосвязывающей частью активного центра VchUPh. Glu197 взаимодействует посредством водородных связей с O2´ и O3´ гидроксигруппами рибозной компоненты уридина (OE1_Glu197/B – 2.66 Å – O2'_URI, OE1_Gln197/B – 3.10 Å – O3'_URI, OE2_Gln197/B – 2.70 Å – O3'_URI), в то же время этот а.о. взаимодействует лишь с гидроксигруппой O3' 2,2'-ангидроуридина (OE2_Glu197/A – 2.56 Å – O3'_ANU, OE1_Glu197/A – 3.33 Å – O3'_ANU). O2'-гидроксигруппа уридина также взаимодействует с атомом азота основной цепи Met196 (N_Met196/B – 3.00Å – O2'_URI). Гидроксигруппа O2' в ингибиторе отсутствует, а атом кислорода O2' входит в алкоксильную группу, которая не образует водородных связей с молекулой белка, а, возможно, лишь взаимодействует электростатически с атомом азота основной цепи Met196 (N_Met196/A – 3.42 Å – O2'_ANU).

Молекула 2,2'-ангидроуридина образует с активным центром фермента меньше устойчивых водородных связей, а их длина в целом больше, чем в комплексе с уридином, что вместе с открытой конфомацией петли-шлагбаума L11 и менее плотным расположением стенок сайта связывания говорит о меньшей энтальпии связывания ингибитора в сравнении с нативным субстратом – уридином. В то же время молекула 2,2'-ангидроуридина более жесткая, чем молекула уридина, что уменьшает энтропийную составляющую свободной энергии связывания.

Остаток Arg167 B-субъединицы структуры комплекса VchUPh с уридином имеет единственную конформацию. Однако в A-субъединице боковая цепь Arg167 находится в трех альтернативных конформациях (заселенность: 0.44, 0.33, 0.23). В активном центре A-субъединицы в отличие от активного центра субъединицы B наблюдается неполная заселенность уридина (0.75): можно считать, что в 25% случаев а.о. Arg167 находится в свободном от лиганда состоянии. По-видимому, существует взаимосвязь между подвижностью боковой цепи Arg167 и связыванием его с лигандом: в свободном состоянии боковая цепь этого а.о. более подвижна, чем в связанном водородной связью с атомами лиганда.

МД-симуляция показала бóльшую стабильность связывания VchUPh с нативным субстратом (уридином) по сравнению с ингибитором. Среднее значение среднеквадратичного отклонения координат неводородных атомов уридина от начального положения (RMS) по траектории длиной 10 нс составляло 0.97 Å (σ = 0.16 Å), атомов 2,2'-ангидроуридина – 2.44 Å (σ = 0.55 Å) (табл. 2). Кроме того, уридин в среднем по МД-траектории образует значительно больше водородных связей (4.39) с атомами а.о. VchUPh по сравнению с 2,2'-ангидроуридином (0.76), что согласуется с данными РСА комплексов. Молекулы 2,2'-ангидроуридина и уридина не покидают область активного центра в течение всей МД-симуляции. Относительная аффинность связывания уридина с белком ($\Delta {{G}_{{bind}}}$), рассчитанная методом LIE, в ∼2.6 раза больше, чем $\Delta {{G}_{{bind}}}$ для 2,2'-ангидроуридина (табл. 2).

Таблица 2.  

Результаты исследования комплексов белок-лиганд методами молекулярной динамики

Комплекс VchUPh + ANU VchUPh + URI
Среднее значение среднеквадратичного отклонения координат атомов лиганда от начального положения, Å 2.44 ± 0.55 0.97 ± 0.16
Среднеквадратичное отклонение расстояния между центрами масс белок–лиганд, Å 0.47 0.25
Среднее число водородных связей белок–лиганд 0.76 ± 0.94 4.39 ± 0.77
Расчет относительной аффинности связывания лиганда методом линейной энергии взаимодействия
$E_{{vdw}}^{{solv}}$, кДж/моль –66.8 –67.5
$E_{{coul}}^{{solv}}$, кДж/моль –191.9 –257.9
$\Delta {{G}_{{bind}}}$, кДж/моль –5.8 –14.8
Расчет $\Delta {{G}_{{bind}}}$ белок–лиганд методом возмущения свободной энергии
$\Delta G_{{vdw + coul}}^{{solv}}$, кДж/моль 71.518 ± 0.450 103.835 ± 0.722
$\Delta G_{{rest}}^{{solv}}$, кДж/моль 29.969 30.078
$\Delta G_{{vdw + coul + rest}}^{{prot}}$, кДж/моль 134.404 ± 0.793 147.205 ± 1.077
$\Delta {{G}_{{bind}}}$, кДж/моль –32.917 ± 0.912 –13.292 ± 1.297

Свободная энергия связывания белок–лиганд, рассчитанная более точным [36, 37], но и более ресурсоемким методом возмущения свободной энергии, для уридина равна –13.292 ± ± 1.297 кДж/моль, а для 2,2'-ангидроуридина составляет –32.917 ± 0.912 кДж/моль в расчете на один активный центр фермента (табл. 2). Отметим, что слагаемое свободной энергии связи белок–лиганд ($\Delta G_{{vdw + coul + rest}}^{{prot}}$) для ингибитора меньше, чем для субстрата, что говорит о меньшей энтальпии связывания ингибитора, но разница в энергии сольватации для ингибитора и субстрата больше разницы в $\Delta G_{{vdw + coul + rest}}^{{prot}}$. Поэтому, несмотря на меньшее количество водородных связей, связывание ингибитора – 2,2'-ангидроуридина с активным центром VchUPh энергетически выгоднее, чем нативного субстрата – уридина. Константа ингибирования Ki, рассчитанная по свободной энергии связывания 2,2'-ангидроуридина (Ki = eG/RT)), для одного активного центра равна 1.9 мкМ, при условии действия шести активных центров Ki = 11.4 мкМ, что по порядку величины соответствует экспериментальным данным, полученным для схожей уридинфосфорилазы из E. coli [7]. Метод LIE для системы белок–лиганд оказался неподходящим, по-видимому, из-за высокой подвижности 2,2'-ангидроуридина в активном центре фермента по сравнению с уридином, а также из-за использования в методе эмпирических констант, правильный подбор которых без дополнительных исследований затруднен.

Отметим также относительно низкое значение свободной энергии связывания белок–лиганд для природного субстрата – уридина. По-видимому, малая энергия связывания белок–лиганд в расчете на один активный центр in vivo компенсируется мультимерной структурой бактериальных UPh.

Сравнение структур комплексов VchUPh и StUPh с 2,2'-ангидроуридином. Проведено сравнение высококонсервативных сайтов связывания структур комплексов уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium: StUPh + ANU (IDPDB: 3FWP) и VchUPh + ANU (IDPDB: 6RCA). Среднеквадратичное отклонение между координатами всех атомов а.о., входящих в активный центр структур комплексов, равно 0.20 Å, между координатами атомов ANU в сайтах связывания – 0.26 Å. Наибольшее смещение наблюдается для координат атомов кислорода O4_ANU (0.55 Å) и координат атомов пиримидинового кольца N3 и C4 (0.33 и 0.26 Å соответственно). Различие в положениях молекул ANU в сайтах связывания структур VchUPh и StUPh, возможно, обусловлено дополнительным взаимодействием ANU в сайте связывания VchUPh с молекулой воды, которая в свою очередь образует водородную связь с а.о. фермента (O4_ANU – 2.68 Å – H2O – 2.88 Å – NH2_Arg167). Относительно объемный фосфат-ион, связанный с фосфатсвязывающим сайтом в структуре комплекса StUPh с ANU и фосфат-ионом (3FWP), может помешать молекуле ANU проникнуть глубже в активный центр фермента. Однако при рассмотрении структуры комплекса StUPh с ANU, определенной при разрешении 2.36 Å (IDPDB: 3C74) (рис. 5б), эта гипотеза не подтвердилась. В этой структуре ни один из активных центров не связан с ортофосфат-ионом, как и в структуре комплекса VchUPh c ANU. Однако положение и конформация ингибитора в комплексе StUPh с ANU значительно ближе к его конформации в комплексе 3FWP, лигандированном кроме ANU ионом фосфата, чем к конформации в комплексе VchUPh с ANU (рис. 5б).

Рис. 5.

Совмещения а.о. активных центров структуры комплекса VchUPh с 2,2'-ангидроуридином (IDPDB: 6RCA, ANU темный оттенок) и двух комплексов уридинфосфорилазы: StUPh с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата (Pi) (IDPDB: 3FWP, разрешение – 1.86 Å, активный центр гомодимера BD, светлый оттенок) (а); StUPh с 2,2'-ангидроуридином (IDPDB: 3С74, разрешение – 2.36 Å, активный центр гомодимера BD, светлый оттенок) (б). Звездочкой обозначены а.о. субъединицы, внесшей меньший количественный вклад в образование сайтов связывания (B – для VchUPh, D – для StUPh).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулы ингибитора – 2,2'-ангидроуридина локализованы во всех нуклеозидсвязывающих сайтах шести одинаковых активных центрах молекулы уридинфосфорилазы из холерного вибриона.

При сравнении сайтов связывания структур комплексов VchUPh c 2,2'-ангидроуридином и уридином установлено, что наиболее сильно различаются положения и конформации остатков Thr93 и Phe6, координирующих лиганды. Thr93 располагается ближе к лиганду на ∼0.5 Å в структуре комплекса VchUPh с уридином в сравнении со структурой VchUPh с ANU. Таким образом, активный центр структуры комплекса VchUPh с уридином является более компактным в сравнении со структурой VchUPh + ANU. Различие в положении боковой цепи Phe6 в структурах комплекса VchUPh с ANU и URI обусловлено взаимодействием Ван-дер-Ваальса c боковой цепью Ile227 петли-шлагбаума L11. Петля L11 находится в разных конформациях: в структуре комплекса VchUPh с ANU – в открытой, а с уридином – в закрытой конформации. В целом молекула 2,2'-ангидроуридина образует с активным центром фермента меньше устойчивых водородных связей, а их длина больше, чем в случае с природным субстратом фермента – уридином. Вместе с открытой конфомацией петли-шлагбаума и менее плотным расположением стенок сайта связывания это приводит к меньшей энтальпии связывания ингибитора в сравнении с нативным субстратом – уридином. В то же время молекула 2,2'-ангидроуридина более жесткая, чем уридина, что уменьшает энтропийную составляющую свободной энергии связывания.

Молекулярно-динамическая симуляция показала большую стабильность связывания VchUPh с нативным субстратом – уридином по сравнению с ингибитором. Однако свободная энергия связывания белок–лиганд, рассчитанная методом возмущения свободной энергии, для уридина равна –13.292 ± 1.297 кДж/моль, а для 2,2'-ангидроуридина составляет –32.917 ± 0.912 кДж/моль в расчете на один активный центр фермента. Слагаемое свободной энергии связи белок–лиганд для ингибитора меньше, чем для субстрата, что говорит о меньшей энтальпии связывания ингибитора, но разница в энергии сольватации намного перекрывает разницу в энергии связи белок–лиганд. Поэтому, несмотря на меньшее количество водородных связей, связывание ингибитора – 2,2'-ангидроуридина с активным центром VchUPh оказалось энергетически выгоднее, чем нативного субстрата – уридина.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН. Для выполнения расчетов был использован гибридный высокопроизводительный вычислительный комплекс ФИЦ ИУ РАН [48].

Список литературы

  1. Katsumata K., Tomioka H., Sumi T. et al. // Cancer Chemother Pharmacol. 2003. V. 51. P. 155.

  2. Finan P.J., Koklitis P.A., Chisholm E.M. et al. // Br. J. Cancer. 1984. V. 50. P. 711.

  3. Leyva A., Kraal I., Lankelma J. et al. // Anticancer Res. 1983. V. 3. P. 227.

  4. Kanzaki A., Takebayashi Y., Bando H. et al. // Int. J. Cancer. 2002. V. 97. P. 631.

  5. Luccioni C., Beaumatin J., Bardot V. et al. // Int. J. Cancer. 1994. V. 58. P. 517.

  6. el Kouni M.H., Naguib F.N., Niedzwicki J.G. et al. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 6081.

  7. Drabikowska A.K., Lissowska L., Veres Z. et al. // Biochem. Pharmacol. 1987. V. 36. P. 4125.

  8. Veres Z., Neszmelyi A., Szabolcs A. et al. // Eur. J. Biochem. 1988. V. 178. P. 173.

  9. Watanabe S., Hino A., Wada K. et al. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 12191.

  10. el Kouni M.H., Naguib F.N., Chu S.H. et al. // Mol. Pharmacol. 1988. V. 34. P. 104.

  11. Naguib F.N., Niedzwicki J.G., Iltzsch M.H. et al. // Leuk Res. 1987. V. 11. P. 855.

  12. Лашков А.А., Жухлистова Н.Е., Сотниченко С.Е. и др. // Кристаллография. 2010. Т. 55. № 1. С. 44.

  13. Lashkov A.A., Zhukhlistova N.E., Gabdoulkhakov A.G. et al. // Acta Cryst. D. 2010. V. 66. P. 51.

  14. Timofeev V.I., Lashkov A.A., Gabdoulkhakov A.G. et al. // Acta Cryst. F. 2007. V. 63. P. 852.

  15. Lashkov A.A., Gabdulkhakov A.G., Prokofev I.I. et al. // Acta Cryst. F . 2012. V. 68. P. 1394.

  16. Prokofev I.I., Lashkov A.A., Gabdulkhakov A.G. et al. // Acta Cryst. F. 2014. V. 70. P. 60.

  17. Zolotukhina M., Ovcharova I., Eremina S. et al. // Res. Microbiol. 2003. V. 154. P. 510.

  18. Kabsch W. // Acta Cryst. D. 2010. V. 66. P. 125.

  19. Mccoy A.J., Grosse-Kunstleve R.W., Adams P.D. et al. // J. Appl. Cryst. 2007. V. 40. P. 658.

  20. McCoy A.J. // Acta Cryst. D. 2007. V. 63. P. 32.

  21. Прокофьев И.И., Лашков А.А., Габдулхаков А.Г. и др. // Кристаллография. 2018. Т. 63. № 3. С. 415.

  22. Adams P.D., Afonine P.V., Bunkoczi G. et al. // Acta Cryst. D. 2010. V. 66. P. 213.

  23. Afonine P.V., Grosse-Kunstleve R.W., Echols N. et al. // Acta Cryst. D . 2012. V. 68. P. 352.

  24. Emsley P., Cowtan K. // Acta Cryst. D. 2004. V. 60. P. 2126.

  25. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G. et al. // Acta Cryst. D. 2010. V. 66. P. 486.

  26. Davis I.W., Leaver-Fay A., Chen V.B. et al. // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 375.

  27. DeLano W.L. // Abstracts of Papers American Chem. Soc. 2004. V. 228. P. 313.

  28. Van Der Spoel D., Lindahl E., Hess B. et al. // J. Comput. Chem. 2005. V. 26. P. 1701.

  29. MacKerell A.D., Bashford D., Bellott M. et al. // J. Phys. Chem. B. 1998. V. 102. P. 3586.

  30. MacKerell A.D. // Abstracts of Papers American Chem. Soc. 1998. V. 216. P. 696.

  31. Huang J., Rauscher S., Nawrocki G. et al. // Nature Methods. 2016. V. 14. P. 71.

  32. Vanommeslaeghe K., Hatcher E., Acharya C. et al. // J. Comput. Chem. 2010. V. 31. V. 671.

  33. Parrinello M., Rahman A. // J. Appl. Phys. 1981. V. 52. P. 7182.

  34. Bussi G., Parrinello M. // Comput. Phys. Commun. 2008. V. 179. P. 26.

  35. Leimkuhler B.J., Reich S., Skeel R.D. // Mathematical Approaches to Biomolecular Structure and Dynamics / Eds. Mesirov J.P. et al. The IMA Volumes in Mathematics and its Applications. V. 82. N.Y.: Springer, 1996. P. 161.

  36. Aqvist J., Marelius J. // Combinatorial Chem. High Throughput Screening. 2001. V. 4. P. 613.

  37. Hansson T., Marelius J., Aqvist J. // J. Comput. Aided Mol. Des. 1998. V. 12. P. 27.

  38. Aldeghi M., Heifetz A., Bodkin M.J. et al. // Chem. Sci. 2016. V. 7. P. 207.

  39. Kirkwood J. // J. Chem. Phys. 1935. V. 3. P. 300.

  40. Boresch S., Tettinger F., Leitgeb M. et al. // J. Phys. Chem. B. 2003. V. 107. P. 9535.

  41. Klimovich P.V., Mobley D.L. // J. Comput. Aided Mol. Des. 2015. V. 29. P. 1007.

  42. Shirts M.R., Chodera J.D. // J. Chem. Phys. 2008. V. 129. P. 124105.

  43. Прокофьев И.И., Габдулхаков А.Г., Балаев В.В. и др. // Кристаллография. 2016. Т. 61. С. 919.

  44. Touw W.G., Baakman C., Black J. et al. // Nucl. Acids Res. 2015. V. 43. P. 364.

  45. Caradoc-Davies T.T., Cutfield S.M., Lamont I.L. et al. // J. Mol. Biol. 2004. V. 337. P. 337.

  46. Lashkov A.A., Zhukhlistova N.E., Gabdoulkhakov A.H. et al. // Acta Cryst. D. 2010. V. 66. P. 51.

  47. Mikhailov A.M., Smirnova E.A., Tsuprun V.L. et al. // Biochem Int. 1992. V. 26. P. 607.

  48. Федеральный исследовательский центр Информатика и управление РАН Москва: ФИЦ ИУ РАН. http://hhpcc.frccsc.ru.

Дополнительные материалы отсутствуют.