Кристаллография, 2020, T. 65, № 4, стр. 605-607

ВВЕДЕНИЕ

Пространственная организация генома имеет критическое значение в регуляции процессов, связанных с реализацией генетической информации. Известно, что в процесс регуляции транс-крипции у эукариот вовлечены многочисленные элементы генома, зачастую расположенные на значительном расстоянии друг от друга [1]. В последние несколько лет была сформирована концепция, согласно которой существует особый класс архитектурных белков, участвующих в организации общей архитектуры хромосом, а также в локальном контроле энхансер-промоторных взаимодействий [2–5].

Предполагается, что данные белки способны устанавливать дистанционные взаимодействия, а также привлекать различные белковые многокомпонентные комплексы, которые, в частности, могут менять статус окружающего хроматина, однако соответствующие механизмы действия архитектурных белков до сих пор не выяснены [6, 7].

Исходя из этого, особый интерес для изучения представляют архитектурные белки, способные напрямую или путем привлечения других белков-партнеров формировать белковые комплексы. За счет такого свойства возможно специфичное и эффективное сближение дистанционно разделенных регуляторных элементов генома либо выпетливание хроматиновых доменов.

К числу таких архитектурных белков относятся, в частности, широко распространенные у членистоногих мультидоменные транскрипционные факторы, содержащие на N-конце ZAD-домены (Zinc-finger Associated Domain). Несмотря на широкое распространение ZAD-доменов в составе транскрипционных факторов (в геноме дрозофилы аннотированы 95 различных ZAD-доменов), их функциональная роль остается почти неизученной, хотя и показано, что они играют ключевую роль в организации специфических дистанционных взаимодействий в трансгенной модельной системе [8]. Несмотря на достаточно большой объем молекулярно-биологических данных в этой области, к настоящему моменту имеется существенный недостаток структурных данных, которые могли бы способствовать идентификации структурных мотивов, обеспечивающих некоторым представителям ZAD-доменов способность образовывать как гомо-, так и гетеродимеры. Так, к настоящему моменту известны лишь две пространственные структуры ZAD-домена белков Grauzone (код PDB – 1PZW) и CG2712 (6FP5). Показано, что эти домены имеют атипичный фолд, содержащий две альфа-спирали и подвижные петли, координированные атомом цинка.

В настоящей работе получены кристаллы не описанного ранее ZAD-домена белка Serendipity-d из Drosophila melanogaster. Проведено предварительное рентгеноструктурное исследование полученных кристаллов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очистка и выделение ZAD-домена белка Serendipity-d из D. melanogaster, получение кристаллов. ZAD-домен белка Serendipity-d (1–90 ак), слитый с GST, экспрессировали в клетках E. coli штамма BL21 (DE3) в течение ночи при +18°C. Клетки E. coli, содержащие рекомбинантный ZAD-домен белка Serendipity-d, разрушали ультразвуком в буфере: 20 мМ Tris, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 20 мM KCl, 5 мМ MgCl₂, 0.1% NP40, 0.1 мM ZnCl₂, 1 мМ DTT. Лизат центрифугировали при 20 000 g в течение 1 ч при +4°C и наносили на предварительно уравновешенную 2 мл колонку с глутатион-агарозой. Затем колонку промывали 20 мл буфера: 20 мМ Tris, pH 7.5, 500 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 0.1% NP40, 0.1 мМ ZnCl₂, 1 мМ DTT, а затем 20 мл буфера: 20 мМ Tris, pH 7.5, 200 мМ NaCl, 0.1 мМ ZnCl₂, 5 мМ цитрата натрия, 1 мМ DTT. Белок элюировали с колонки, отрезая от GST, для этого добавляли 0.5 мг TEV-протеазы в 10 мл буфера: 20 мМ Tris, pH 7.5, 200 мМ NaCl, 0.1 мМ ZnCl₂, 5 мМ цитрата натрия, 1 мМ DTT, колонку закрывали и инкубировали на ротаторе в течение ночи при +4°C. Фракцию проскока собирали и переводили в предварительно дегазированный буфер: 20мМ Tris, pH 7.4, 0.1 мМ ZnCl₂, 1 мМ DTT, при помощи колонки HiPrep Desalting (GE Healthcare). Полученный препарат наносили на предварительно уравновешенную тем же буфером колонку Source 15Q (GE Healthcare) и собирали проскок, содержащий белок, концентрировали до 10 мг/мл при помощи концентраторов Millipore для последующей кристаллизации.

Предварительный скрининг условий кристаллизации проводили с использованием роботизированной системы кристаллизации Rigaku (США) [9] и стандартных наборов для кристаллизации глобулярных белков компании Hampton Research (США): Crystal Screen HT, Crystal Screen Cryo HT, Index HT, PEG/Ion HT, PEGRx HT и SaltRx HT. Кристаллизацию проводили в 96-луночных пластиковых планшетах Art Robbins Instruments (США) при температуре 15°С. Использовали белковый препарат с концентрацией 10 мг/мл. Кристаллы белка появились в ряде условий, а для последующей оптимизации были выбраны условия, в которых кристаллы имели наилучший внешний вид (отдельные кристаллы призматической формы) и наибольшие размеры – порядка 50 × 50 × 50 мкм. В этих условиях кристаллы росли в течение 5–7 дней. Оптимизацию кристаллов ZAD-домена проводили методом диффузии в парах (вариант “висячая капля”) с использованием ранее найденных предварительных условий кристаллизации. В процессе оптимизации варьировались концентрации осадителя и белка, а также температура кристаллизации. Финальные условия кристаллизации содержали: 0.1 M хлорида натрия, 0.1 M ХЕПЕС, pH 7.5, 1.5 M сульфата лития. Кристаллы максимального размера росли в течение 7 дней.

Сбор и обработка дифракционных данных. Решение структуры. Перед сбором рентгенодифракционных данных кристаллы ZAD-домена вылавливали петлей и переносили в криораствор, содержащий кроме компонентов, входящих в противораствор, 25% глицерина, после чего кристалл в петле замораживали в парах азота. Дифракционные наборы собирали при температуре 100 K на станции BL41XU синхротронного источника SPring-8 (Япония). Дифракционную картину фиксировали детектором Pilatus6M-F. Для расчета стратегии сбора данных использована программа HKL2000 [10], предложившая следующие параметры: длина волны 1.0 Å, угол вращения 720°, угол качания 0.5°, расстояние кристалл–детектор 700 мм. Набор дифракционных данных обработан с использованием программы iMosflm [11]. Характеристики кристалла и статистика набора данных приведены в табл. 1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Использованные в рентгеноструктурном эксперименте кристаллы ZAD-домена белка Serendipity-d из D. melanogaster имели форму призмы (рис. 1) и размеры порядка 200 × 200 × 300 мкм.

Рис. 1.

Кристаллы ZAD-домена белка Serendipity-d из D. melanogaster, выросшие в оптимизированных условиях.

Кристаллы дифрагировали до разрешения 3.67  Å (рис. 2) и принадлежали пр. гр. P4₁2₁2 c параметрами ячейки a = b = 97.79, с = 92.69 Å. Оценка содержания растворителя в элементарной ячейке по методу Мэттьюса [12], проведенная с помощью программы из пакета CCP4 [13], показала, что в независимой части содержатся две субъединицы белка.

Рис. 2.

Дифракционная картина от кристаллов ZAD-домена белка Serendipity-d из D. melanogaster, визуализированная в iMosflm.

Решение структуры методом молекулярного замещения (программа MOLREP [14]) с использованием в качестве модели известных структур ZAD-доменов (коды PDB – 6FP5, 1PZW), а также их фрагментов, не дало результата. Возможной причиной является относительно низкое разрешение полученных структурных данных. В дальнейшем планируется провести оптимизацию других условий кристаллизации, полученных для данного белка, с целью улучшения качества кристаллов и снять набор данных для аномального рассеяния на атоме цинка, входящем в состав данного белка, для решения структуры методом аномального рассеяния.

Работы по экспрессии и выделению белка выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-10099), кристаллизация и рентгеноструктурный эксперимент выполнены при поддержке Федерального космического агентства (проект КЭ (ЦР) “Кристаллизатор”), работы по анализу полученных данных выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ.