Кристаллография, 2020, T. 65, № 6, стр. 900-906

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что белковая кристаллография и рентгеноструктурный анализ активно используются для создания таргетных, направленных на определенную белковую мишень, лекарств. В данном процессе используют методы виртуального скрининга и молекулярного докинга, а также пространственную структуру белка-мишени, полученную с высоким разрешением [1, 2]. Кроме того, чтобы подтвердить взаимодействие найденной in silico молекулы с белком-мишенью, проводят кристаллизацию белка в комплексе с ингибитором. Если закристаллизовать комплекс не удается, то используют методы моделирования и молекулярной динамики (МД). На основании структурных данных, полученных для белка-мишени в свободной форме, сначала моделируют комплекс белка с ингибитором, а затем анализируют поведение комплекса с помощью МД-эксперимента.

Данная работа является наглядным примером использования описанного выше подхода для разработки химических ингибиторов гистоноподобных HU-белков, которые являются глобальными регуляторами топологии бактериального генома [3]. Ингибиторы HU-белков могут стать основой для получения новых антибиотиков [4]. Гистоноподобные HU-белки выполняют свою функциональную роль путем связывания и изгибания геномной ДНК бактерий [5]. Они участвуют в регуляции транскрипции и, как следствие, транскриптомного и протеомного профиля бактериальной клетки [6]. HU-белки необходимы для выживания простейших микроорганизмов класса Mollicutes [7], а также ряда других патогенных бактерий, включая Mycobacterium tuberculosis [8] и Streptococcus pneumonia [9].

Ранее найденные ингибиторы ДНК-связывающей способности HU-белков были направлены на ДНК-связывающий сайт [4]. Однако большой размер и подвижность ДНК-связывающего сайта, а также высокая аффинность HU-белков к ДНК существенно затрудняли поиск таких ингибиторов. Поэтому в данной работе использовали альтернативный подход, основанный на поиске молекул, взаимодействующих с границей между двумя мономерами HU-белка. Перспективность данного подхода и его преимущества по сравнению с разработкой ингибиторов, направленных на ДНК-связывающий сайт, была исследована ранее [10, 11].

Пространственная структура HU-белка из Spiroplasma melliferum (HUSpm) (PDB ID 5L8Z), полученная на синхротронном источнике НИЦ “Курчатовский институт” с разрешением 1.36 Å [12, 13], была использована в качестве мишени для виртуального скрининга химической библиотеки компании Vitas-M laboratory (https://vitasmlab.biz/), содержащей 1 400 000 соединений. Способность выявленных соединений подавлять ДНК-связывающую способность HUSpm была исследована in vitro методом торможения в геле [5]. Комплекс найденного ингибитора с HUSpm построен и изучен в МД-эксперименте, параметры которого были подобраны ранее при исследовании конформационной динамики микоплазменных HU-белков в свободной форме [14, 15].

Анализ МД-траектории показал, что связывание ингибитора в межграничной области димеров приводит к изменению конформационной динамики ДНК-связывающего домена, что в свою очередь влияет на эффективность ДНК-связывания. Снижение эффективности ДНК-связывания приводит к нарушению нормального функционирования HU-белка. Данный подход может быть использован при разработке низкомолекулярных ингибиторов целого ряда ДНК-связывающих мультимерных белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Виртуальный скрининг химической библиотеки. В качестве мишени для поиска химических ингибиторов, направленных на границу между двумя мономерами HU-белка, выбрана пространственная структура HUSpm (PDB ID 5L8Z), полученная методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1.36 Å [12, 13]. Библиотека химических соединений, содержащая 1 400 000 молекул, была получена от компании VitasM laboratories (http://www.vitasmlab.com/). Основные этапы скрининга: подготовка мономера HUSpm, скрининг библиотеки и структурная фильтрация результатов. Для моделирования по гомологии неразрешенных участков белка использовали программу Modeller [16], для оптимизации боковых радикалов – программу Mutate [17]. Молекулярный докинг проводили с помощью программы LeadFinder [18], структурную фильтрацию – с помощью программы dock_filter [19]. Визуализацию результатов моделирования проводили в программе VMD [20].

Валидация результатов виртуального скрининга методом торможения в геле. Метод основан на разности молекулярных масс комплекса белок–ДНК и свободной ДНК, которая обусловливает различную подвижность в не денатурирующем полиакриламидном геле при проведении электрофореза. При проведении анализа использовали два микоплазменных HU-белка HUSpm и HU-белок Mycoplasma gallisepticum (HUMgal), полученные как описано в [13, 21, 22], а также короткий двухцепочечный олигонуклеотидный дуплекс, полученный из олигонуклеотидов CrJ_A3 (5'-Cy3-CCGTCGTAGCAA GAAAGACTCAACTGCACT-3') и cr_D (5'-AGTGCAGTTGAGTCCTT GCTACGACGG-3'), Cy3 – флуоресцентная метка.

Электрофорез проводили в не денатурирующем полиакриламидном 10%-ном геле и 100 мМ Трис-боратном буфере. Детекцию результатов проводили на BIO RAD Faros FX Molecular Imager (532 nm EX, 605 nm BP), а анализ результатов с помощью программ Quantity One и GraphPad Prism 5.

Моделирование комплекса ингибитора с димером HUSpm и его исследование с помощью методов молекулярной динамики. Приготовление ДНК-белкового комплекса осуществляли с помощью интерактивной графической программы COOT [23]. Модель HUSpm была наложена на структуру HU-белка Borrelia burgdorferi в комплексе с ДНК (PDB ID 2NP2) [24], координаты ДНК были перенесены на модель HUSpm. После этого провели замену и удаление избытка олигонуклеотидов.

Параметризацию ингибитора проводили при помощи программного пакета ACPYPE [25].

Полученные комплексы изучены в МД-эксперименте. Для проведения МД-расчетов использовали программный пакет GROMACS [26]. В качестве силового поля выбрано поле AMBER99SB [27]. Комплексы были помещены в кубическую ячейку, заполненную водой с добавлением ионов в количестве, необходимом для того, чтобы суммарный заряд систем оставался нулевым. В качестве модели молекулы воды выбрана TIP3P.

На первом этапе МД-эксперимента провели минимизацию энергии комплекса для релаксации любых возможных искажений. Затем на подвижность атомов системы были наложены ограничения, при помощи симуляции системы в баростате и термостате установлены температура в 300 K и давление 1 атм. После снятия всех ограничений провели МД-эксперимент, параметры которого представлены в табл. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

HU-белки представляют собой димеры. Каждый мономер в димере можно разделить на два домена: α-спиральный димеризационный домен и β-ленточный седлообразный ДНК-связываюший домен (рис. 1). В ДНК-связывающем домене можно выделить подвижные в отсутствие ДНК “руки”, состоящие из β-слоев 4 и 5 и примыкающих к ним петель, и стабильную ДНК-связывающую платформу, включающую в себя β-слои 3 и 6 и α-спираль 3, тогда как β-слой 2 и петля между β-слоями 2 и 3 участвуют в формировании границы между мономерами [5, 14, 15].

Рис. 1.

Модели мономера и димера HUSpm. На левой панели показаны элементы вторичной структуры, в центре – разделение мономера на домены. Окружностями обозначены функционально важные участки белка: димеризационный сигнал (ДС) и петля, интеркалирующая в малую бороздку ДНК.

Целью работы был поиск ингибиторов, взаимодействующих с границей между двумя мономерами. В связи с прочностью границы HUSpm [13] из результатов виртуального скрининга и докинга отобрали соединения, прочность связывания которых превосходила 10 ккал/моль. В результате анализа отобрали четыре молекулы, для которых структуры предсказанных комплексов не имели стерических ограничений. Структурные формулы потенциальных ингибиторов представлены на рис. 2, а энергия их связывания с белком в табл. 2.

Рис. 2.

Соединения из коллекции VitasM laboratories (http://www.vitasmlab.com/), отобранные при виртуальном скрининге.

Все потенциальные ингибиторы протестировали на способность ингибировать ДНК-связывающую HUSpm c помощью метода торможения в геле (рис. 3). Как видно из рисунка, только соединение STK368440 обладало ингибирующей способностью в концентрации 100 мкM и было использовано для получения кривой дозовой зависимости и определения концентрации полумаксимального ингибирования (КИ₅₀), снижающей эффективность связывания белка с ДНК на 50% (рис. 3б–3г). В данном эксперименте ингибирующую способность STK368440 исследовали в отношении двух микоплазменных белков HUSpm и HUMgal, полученные КИ₅₀ составляли 33 ± 6 и 35 ± 7 мкМ для HUSpm и HUMgal соответственно.

Рис. 3.

Влияние соединений, отобранных при виртуальном скрининге, на ДНК-связывающую способность HU-белков, определенное методом торможения в геле: а – эффект 100 мкМ концентрации соединений на ДНК-связывающую способность HUSpm; б–д – концентрационные зависимости эффективности ингибирования ДНК-связывания соединением STK368440 (б, в), кривые дозовой зависимости и концентрации полумаксимального ингибирования (КИ₅₀) (г, д), полученные для HUSpm (б, г) и HUMgal (в, д). F – свободная ДНК.

Несмотря на большой предварительный опыт кристаллизации HU-белков [12, 21, 28], в настоящей работе не удалось получить кристаллы комплексов HUSpm с STK368440, поэтому для исследования взаимодействия ингибитора с белком использовали методы моделирования и молекулярной динамики. Модель STK368440 на границе между двумя мономерами HUSpm представлена на рис. 4. МД-симуляция этой модели, с одной стороны, позволяла оценить устойчивость комплекса, а с другой стороны, узнать, как меняется конформационная динамика белка-мишени после связывания ингибитора.

Рис. 4.

Модель ингибитора STK368440, взаимодействующего с границей между двумя мономерами в области перехода α-спирального домена в ДНК-связывающий. Белок показан как заряженная поверхность с элементами вторичной структуры.

Был проведен анализ флуктуаций основной цепи HUSpm в свободном виде, в комплексе с модельной ДНК и в комплексе с ингибитором STK368440, наблюдаемых при 100 нс МД-симуляциях (рис. 4). Как видно из рисунка, в свободном HUSpm ДНК-связывающий домен, особенно его участок между β3- и β6-слоями, обладает значительной подвижностью. Именно такое поведение HU-белков в растворе наблюдалось при их исследованиях с помощью ЯМР-спектроскопии [14, 15]. В комплексе с ДНК подвижность ДНК-связывающего домена уменьшается на всем его протяжении (от β2-слоя до С-концевой α3-спирали). Это происходит из-за перехода молекулы в конформацию захвата ДНК, в которой подвижные β-ленточные “руки” обхватывают ДНК, а петля между β4- и β5-слоями интеркалирует в малую бороздку двойной спирали [24]. При взаимодействии с ингибитором наблюдается увеличение подвижности в области перехода α-спирального домена в ДНК-связывающий домен (предполагаемое место связывания ингибитора), а также в наиболее стабильных областях ДНК-связывающего домена (β3-, β6-слой и α3-спираль), которые обеспечивают адаптацию седловидной основы ДНК-связывающего домена при переходе белка из свободного состояния в конформацию захвата ДНК, что предположительно обеспечивает высокую прочность ДНК-белковых комплексов (константы диссоциации в наномолярной области) [5]. Наблюдаемое нарушение конформационной динамики сопровождается нарушением ДНК-связывающей способности (рис. 5), что подтверждает предположение о возможности контролировать ДНК-связывающие свойства HU-белков путем воздействия на границу между мономерами.

Рис. 5.

Среднеквадратичная флуктуация (СКФ в Å) Сα-атомов в течение 100 нс МД-симуляции, вычисленная для свободного HUSpm (темно-серые линии), HUSpm в комплексе с модельной ДНК (светло-серые линии) и в комплексе с ингибитором STK368440 (черные линии). Разрывными линиями показаны результаты независимых МД-экспериментов, сплошными – усредненные значения. Вторичная структура HUSpm, взятая из [15], показана сверху.

Вероятно, подобный подход может быть использован при разработке низкомолекулярных ингибиторов, специфичных к другим нуклеоид-ассоциированным белкам, которые вместе с белком HU поддерживают топологию бактериального генома.

Работы в части исследования комплексов HU-белков с ингибиторами выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 20-04-01001), в части поиска ингибиторов – Программы президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” (грант № 0101-2014-0086). Технология проведения МД-экспериментов разработана при поддержке НИЦ “Курчатовский институт” (приказ № 1363 от 25.06.2019), поиск условий кристаллизации комплексов проводили при частичной поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН.