Кристаллография, 2020, T. 65, № 6, стр. 921-932

ВВЕДЕНИЕ

В отечественной и зарубежной литературе имеется большое количество публикаций, посвященных разработке перспективных подходов к преодолению резистентности микроорганизмов за счет вновь разработанных и синтезированных альтернативных средств с высокой антимикробной активностью. К таким объектам относятся соединения с редкоземельными ионами (RE), которые входят в виде добавок в составы противовоспалительных, регенерирующих, обезболивающих, ранозаживляющих, антимикробных мазей и препаратов, таких как Эплан (регистрационное удостоверение RU.77.99.21.001.Е.002989.02.12), “Кожная броня”, Вилпран, Лантанол [1–5].

Кроме того, соединения с RE используются в профилактической медицине (гидроксиапатит, допированный ионами RE = Gd³⁺, Yb³⁺/Tm³⁺, Eu³⁺, для диагностики на основе мультимодальной визуализации) [6], в качестве 3D-скаффолдов на дефектах ткани (хитозан-силоксановые сферы с инкорпорированным CeCl₃) [7], а также они перспективны как биологически активные вещества, которые влияют на свободно радикальные процессы окисления в тканях и антиоксидантную активность [8].

Настоящие и будущие области применения соединений с RE требуют изучения этих соединений в формах, имеющих отношение к области использования, нахождения корреляционных связей и установления или предложения роли ионов RE в проявлении их функциональных свойств. Научный и практический интерес представляет исследование молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов c ионами RE, фармакологическая активность которых определяется не только их составом и строением, но и состоянием функциональных групп в препарате [9].

Цель настоящего исследования – изучить антимикробную активность солей RE(NO₃)₃ · xH₂O (RE = La, Ce, Gd, Yb, Y) как в индивидуальном виде, так и в составе композиционных гидрогелей с поли-N-винилпирролидоном, в отношении широкого круга микроорганизмов и предложить возможные причины реализации свойств.

Данная работа является продолжением цикла работ по исследованию бактерицидных и бактериостатических свойств композитов разной природы (цеолиты, полимеры, гидрогели) с наноразмерными оксидами цинка и оксидами титана (IV) [10–15], а также композиционных гидрогелей на основе поли-N-винилпирролидона (ПВП, (C₆H₉NO)_n) с поликристаллическими солями RE(NO₃)₃ · xH₂O: с RE = La, Gd, Yb [16] и Ce, Y [17]. Причем антимикробная активность солей и композитов с ПВП изучена и представлена только в отношении ограниченного круга микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans), а образцы исследованы методами рентгенографии, малоуглового рентгеновского рассеяния и электронной микроскопии.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Объекты исследования. Гидрогели на основе ПВП получены золь-гель технологией из ПВП, сшивающего агента тетраэтоксисилана (ТЭОС, SiC₈H₂₀O₄) и порошков RE(NO₃)₃ · xH₂O с RE = = La, Се, Gd, Yb и Y. Для этого к 11% водному раствору ПВП добавляли молочную кислоту (катализатор) и ТЭОС с концентрациями 0.01 и 5.04 мас. % соответственно. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и выливали в форму с крышкой. Толщина вылитых смесей составляла 4–6 мм. При получении композиционных гидрогелей ПВП/RE(NO₃)₃ · xH₂O (в дальнейшем будем обозначать их как ПВП/RE) порошки солей RE(NO₃)₃ · xH₂O (далее обозначены как RE) добавляли в количестве 5.59 мас. % до введения ТЭОС. Условия получения гидрогелей ПВП и ПВП/RE одинаковы.

Рентгенографическое изучение солей. Исследования солей RE методом порошковой рентгеновской дифракции проводились на экспериментальной станции Рентгеноструктурного анализа (РСА) Курчатовского источника синхротронного излучения [18] с использованием монохроматического излучения с длиной волны λ = 0.8 Å (энергия фотонов Е = 15 498 эВ), фокусированного на образце размером до 400 мкм. Измерения проводились в геометрии Дебая–Шеррера (на просвет), образец помещался в криопетлю размером 300 мкм и в процессе измерения вращался вокруг горизонтальной оси для усреднения дифрактограмм по ориентациям образца. Регистрация дифракционных картин осуществлялась двумерным позиционно-чувствительным детектором Rayonix SX165, располагавшимся на расстоянии 150 мм от образца под углом 2θ = 29.5° к оси прямого пучка. Время экспозиции составляло 5 мин. Полученные двумерные дифрактограммы интегрировались к одномерному виду (к зависимости I(2θ)) с использованием программы Dionis [19]. Калибровка угловой шкалы детектора и определение аппаратного уширения дифракционных рефлексов осуществлялись за счет измерения поликристаллического стандарта LaB₆ (NIST SRM 660a). Определение параметров микроструктуры и размеров элементарной ячейки RE проводилось в программе Jana2006 [20].

Дифференциально-сканирующая калориметрия образцов. Дифференциально-сканирующая калориметрия (ДСК) порошков RE и нативных гидрогелей ПВП/RE проведена на приборе Netzsch DSC 204 (Phoenix, Германия). Навески порошков или гидрогелей помещали в стандартный алюминиевый тигель с проколотой крышкой. Сканирование осуществляли со скоростью 10 град/мин в атмосфере аргона (99.99%) при скорости потока 100 мл/мин в интервале температур от 25 до 600°С. Результаты обрабатывали с помощью программы Netzsch Proteus. Точность определения температуры 0.1°С.

Рентгеновские исследования на поверхности растворов солей. Для проведения экспериментов на поверхности растворов соли Yb(NO₃)₃ · хH₂O формировали фосфолипидные монослои. Для этого использовали 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин (ДПФГ) и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДПФЭ) (Sigma). Растворы фосфолипидов (смесь хлороформ/метанол в соотношении 9:1 с концентрацией 0.45 мг/мл) наносили на поверхность раствора соли Yb(NO₃)₃ · хH₂O с концентрацией 10^–4 М, pH 6.5. Монослой поджимали до давления π = 25 мН/м, которое во время рентгеновских измерений поддерживалось постоянным. Контрольные измерения проводили на монослоях ДПФГ и ДПФЭ, сформированных на чистой воде. Все растворы были приготовлены с использованием воды высокой степени очистки (сопротивление >18 MОм · см), полученной на установке Millipore Corp. Измерения проводили при комнатной температуре.

В эксперименте использован метод стоячих рентгеновских волн (СРВ) в геометрии полного внешнего отражения (ПВО) [21]. В рамках этого метода наряду с рентгеновским отражением регистрировался выход вторичных излучений, возникающих при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях ПВО. Такие измерения позволяют получать информацию о положении атомов определенного сорта вдоль нормали к поверхности из анализа угловых зависимостей интенсивности выхода вторичного излучения. Изменения кристаллической структуры фосфолипидных монослоев фиксировали с помощью метода дифракции рентгеновских лучей в геометрии скользящих углов падения.

Измерения проводили на Курчатовском источнике синхротронного излучения на экспериментальной станции “Ленгмюр”. Во всех экспериментах использовали излучение с энергией 13 кэВ. Спектры флуоресцентного излучения регистрировали кремниевым дрейфовым детектором Vortex EX-90 (SII-Hitachi), расположенным перпендикулярно к поверхности водной субфазы на расстоянии ∼10 мм. Двумерные карты дифракционного рассеяния на фосфолипидных монослоях записывали при использовании линейного позиционно-чувствительного детектора Mythen-1k (Dectris), установленного в вертикальном положении и обеспечивающего параллельное измерение q_z-сечений в диапазоне от 0 до 0.8 Å^–1. Измерение интенсивности в горизонтальной плоскости рассеяния (q_xy-направление) осуществляли угловым сканированием детектором с коллиматором Соллера с угловой апертурой 2 мрад. Для уменьшения рассеяния излучения на воздухе и снижения испарения жидкости измерения (общее время составляло 24 ч) проводили в атмосфере увлажненного гелия.

Антимикробная активность (в темноте). Микробиологические исследования по изучению антимикробной активности (АМА) поликристаллических солей RE, гидрогелей ПВП и ПВП/RE проведены методом “колодцев” в отношении микроорганизмов Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae [22]. Взвесь определенного вида микроорганизмов, содержащую 10⁷–10⁸ КОЕ в 1 мл, засевали “газоном” в чашки Петри на агар Мюллера–Хинтона в количестве 0.2 мл. На поверхности агара, засеянного культурами микроорганизмов, делали лунки с помощью тонкостенного цилиндра диаметром 6–8 мм, в которые помещали образцы. Для исследования солей RE их насыпали ровным слоем, а для изучения гидрогелей были вырезаны нативные образцы в виде круга диаметром 13 мм и толщиной 4–6 мм. Далее чашки с испытуемыми образцами помещали в термостат при 37°С на 24 ч. Результаты оценивали по размеру (диаметру) зоны задержки роста микроорганизмов вокруг лунки (величина Д, мм) с помощью линейки, включая диаметр самой лунки.

Степень чувствительности микроорганизмов к исследуемым образцам зависит от величины Д: чем она больше, тем выше чувствительность. По величине зоны задержки роста образцы делятся на четыре группы: Д < 10 мм – отсутствие чувствительности, Д = 11–15 мм – малая чувствительность, Д = 15–25 мм – средняя чувствительность, Д > 25 мм – высокая чувствительность к микроорганизмам [23]. Микробиологические исследования проведены в боксе микробиологической защиты второго класса, оснащенном УФ-лампой и ламинарным потоком воздуха.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

RE(NO₃)₃ · хH₂O (соли). Образцы RE демонстрируют высокую АМА в отношении Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans (самая высокая), наибольшая из них у RE(NO₃)₃ · · хH₂O c RE = Y и Ce (рис. 1).

Наблюдается несколько бóльшая активность RE к грамположительной бактерии Staphylococcus aureus, за исключением соли La(NO₃)₃ · хH₂O (La), у которой высокая АМА только в отношении грамотрицательной бактерии Escherichia coli, а к остальным микроорганизмам эта соль в твердом виде проявляет среднюю чувствительность (рис. 1). Величина Д для Escherichia coli и Candida albicans убывает в ряду образцов RE(NO₃)₃ · xH₂O с Y > Ce > Gd ≈ Yb > La, а для Staphylococcus aureus в другом ряду Ce > Y > Gd > Yb > La (рис. 1). Согласно [24] антимикробная активность по отношению к грибам Rhizopus nigricans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Neurospora sitophila, Coprinus sp. снижается в ряду Lu > Y > Er > Ho > Dy > > Eu > Nd > Ce, что согласуется с нашими данными для другого вида грибов Candida albicans.

Причину разного поведения АМА солей RE нужно искать как в характеристиках самих образцов, так и в природе и строении микроорганизмов.

Анализ дифракционных картин RE (рис. 2) и результаты расчета структурных параметров (табл. 1) свидетельствуют о том, что поликристаллические соли по типу структуры разделяются на три группы: с RE = La и Ce (первая группа), RE = = Gd и Y (вторая), RE = Yb (третья), причем образец Yb(NO₃)₃ · xH₂O неоднофазный.

Объемы элементарной ячейки образцов уменьшаются в ряду RE: Gd > Y > La > Ce > Yb, что не коррелирует с размерами ионов (r_La > r_Ce > > r_Gd > r_Y > r_Yb; r – радиус иона) и не имеет связи с АМА. Предполагаемая в литературных источниках связь АМА с порядковым номером (атомным весом) RE [25] отсутствует. Не наблюдается и связь АМА с химической активностью RE, которая по данным [26] снижается от La до Lu, что обусловлено уменьшением радиусов RE.

Образцы RE отличаются средними размерами кристаллитов (D, нм), которые убывают в ряду Gd > Y > La > Ce > Yb, и величинами микронапряжений (ε, %): Yb > Y > Ce > La > Gd (табл. 1). Можно сделать вывод (в первом приближении), что АМА поликристаллических солей RE связана с микронапряжениями, если исключить неоднофазный образец Yb, для которого большая величина ε вызывается напряжениями на границе фаз.

Судя по общему виду составов кристаллогидратов RE(NO₃)₃ · xH₂O, они могут содержать и одинаковое, и разное количество молекул воды (величина x). На дифрактограммах образцов наблюдается перераспределение интенсивностей отдельных пиков, причем в меньшей степени для образцов первой группы структур (La, Ce) и в большей степени для образцов второй группы (Gd, Y) (рис. 2). Такой характер отличий интенсивностей отражений в рамках изоструктурных (предположительно) исследуемых фаз в рамках одной группы может быть обусловлен не только видом RE, но и разным содержанием молекул кристаллизационной воды. Это вывод подтверждается результатами ДСК (рис. 3, табл. 2): количество кристаллизационной воды убывает в ряду RE Y > Ce > Gd > Yb > La (овалами на рис. 3 отмечены полосы, связанные со стадиями удаления воды из кристаллогидратов).

Процесс термического разложения RE(NO₃)₃ · · xH₂O довольно сложный, многостадийный, с разными этапами и температурами в зависимости от RE [27–35]. В табл. 2 этот процесс представлен в виде обобщения.

Можно отметить лишь общие черты пиролиза RE(NO₃)₃ · xH₂O: при низких температурах удаление воды и кислородно-азотных соединений из исходных солей и промежуточных оксонитратов разного состава, а при повышении температуры дальнейшая дегидратация с потерей оксидов азота, воды и кислорода с образованием оксидов RE. Так, при разложения La(NO₃)₃ · 6H₂O при 130 и 150°C образуются соответственно La(NO₃)₃ · · 4H₂O и La(NO₃)₃ · xH₂O [34], выше 250°C найден La(NO₃)₃ [36], разложение которого начинается при ∼375–400°C [35, 36]. Пик с максимумом при 412°C относят к разложению La(NO₃)₃, а плечо при ∼426°C – к разложению оксинитрата LaONO₃ (табл. 2).

С уменьшением содержания воды в солях RE уменьшается их АМА, причем такая связь количества молекул воды в образцах с АМА установлена в [37, 38].

Таким образом, содержание кристаллизационной воды в солях RE(NO₃)₃ · xH₂O и величина микронапряжений образцов симбатно коррелируют с АМА в отношении грамотрицательной бактерии Escherichia coli, грамположительной бактерии Staphylococcus aureus и грибов Candida albicans.

Величина АМА разная в зависимости от RE и вида микроорганизмов, что логично предполагает обращение к строению и составу бактерий, прежде всего их оболочек (мембран), в состав которых входят фосфолипиды, являющиеся защитным слоем клеток. Важнейшая функция мембран – регуляция обмена веществ между клеткой и средой, а также между различными отсеками (компартментами) внутри самой клетки. Около 20% всей массы мембраны составляет прочно связанная вода, а также катионы, преимущественно Са²⁺ и Mg²⁺, входящие в хелатные комплексы.

Антимикробную активность соединений на основе RE определяет образование различных координационных соединений, в том числе с полимерами – белками, и проникновение их в клетки микроорганизмов [1, 2]. Не исключено, что при воздействии солей на микроорганизмы происходит замещение ионов RE³⁺ на ионы Ca²⁺ из-за близости их размеров, что вызывает гибель бактерий [39, 40]. Но это не объясняет найденный ряд АМА для RE. С другой стороны, может произойти нарушение водного баланса клетки при взаимодействии с кристаллогидратами RE(NO₃)₃ · xH₂O, что также нарушит функционирование клетки. Это косвенно подтверждает связь АМА с содержанием воды в солях.

Из-за своей более мощной и непроницаемой клеточной стенки грамотрицательные бактерии (в частности, Escherichia coli) более устойчивы к антителам, чем грамположительные, и их патогенность связывают с определенными компонентами их клеточных стенок, а именно с липополисахаридным слоем.

RE(NO₃)₃ · хH₂O (растворы солей). Антимикробная активность солей с ионами RE в значительной степени зависит от их способности диссоциировать в жидких средах. Характер взаимодействия ионов RE с внешней мембраной бактериальной клетки играет определяющую роль в развитии целого каскада сложнейших биохимических процессов, таких как блокировка ионных каналов или активных транспортных систем клеточной оболочки бактерии, образование комплексов с белками внешней мембраны с последующим изменением структурно-функционального состояния белковых молекул. Не исключено также прооксидантное действие ионов RE на мембранные липиды.

Изучать молекулярные механизмы взаимодействия ионов RE с клеточной оболочкой бактерий можно с помощью экспериментов на модельных системах, в первую очередь на упорядоченных липидных монослоях, которые по своему составу и морфологии представляют собой адекватную модель биологических мембран. В проведенных исследованиях использованы фосфолипиды фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицирин, которые относятся к основным липидам наружной бактериальной мембраны. Фосфатидилэтаноламин составляет 60–80% фосфолипидов в грамотрицательных бактериях (например, Escherichia coli), фосфатидилглицирин наиболее часто встречается в грамположительных бактериях (например, Staphylococcus aureus) [41, 42]. Исследования были посвящены выявлению механизмов взаимодействия соли Yb(NO₃)₃ · xH₂O, обладающей высокой АМА (рис. 1), с фосфолипидным монослоем.

Для изучения влияния раствора Yb(NO₃)₃ · · xH₂O на молекулярную упаковку монослоев ДПФГ и ДПФЭ были выполнены измерения с помощью метода дифракции в геометрии скользящих углов падения (данные не представлены). На протяжении всего времени измерений (24 ч) изменений на картах дифракционного рассеяния не наблюдалось. Кроме того, в обоих случаях не было выявлено каких-либо отличий от контрольных данных, полученных при измерениях для монослоев на чистой воде. Эти результаты позволяют сделать заключение, что присутствие соли Yb(NO₃)₃ · xH₂O в водной субфазе (в концентрации, использованной в проведенных экспериментах) не вызывает каких-либо повреждений кристаллической структуры монослоев ДПФГ и ДПФЭ.

Результаты исследований с помощью метода СРВ на монослоях ДПФГ и ДПФЭ, а также на растворе соли Yb(NO₃)₃ · 5H₂O приведены на рис. 4 и 5. Кривая выхода Yb-флуоресценции, записанная при измерениях на растворе соли (без нанесения фосфолипидного монослоя), имеет характерный вид: при углах, меньших критического угла ПВО, интенсивность флуоресценции близка к нулю, вне области ПВО при θ > θ_С интенсивность резко увеличивается. Такой ход угловой зависимости обусловлен изменением глубины проникновения волнового поля: в пределах области ПВО рентгеновское излучение практически не проходит в водную субфазу. Для θ > θ_С глубина проникновения поля увеличивается от нескольких нанометров до нескольких сотен микрон. В результате значительно увеличивается число атомов, испускающих флуоресцентные кванты, и интенсивность выхода флуоресценции возрастает на несколько порядков.

Принципиально иной ход угловой зависимости Yb-флуоресценции зарегистрирован в исследованиях на монослое ДПФГ (рис. 4). В этих измерениях интенсивность выхода флуоресценции монотонно растет с увеличением угла – от нуля при θ = 0 мрад до максимального значения в окрестности критического угла ПВО. Физический смысл таких модуляций на угловой зависимости становится ясен из рассмотрения особенностей стоячей рентгеновской волны, формирующейся в условиях ПВО: при малых углах у поверхности отражающего зеркала (водной субфазы) находится минимум интенсивности волнового поля, а вблизи критического угла ПВО – максимум интенсивности. Экспериментальные данные, полученные в измерениях на монослое ДПФГ, однозначно указывают на концентрирование ионов иттербия из объема водной субфазы к поверхности. Угловая зависимость выхода Yb-флуоресценции, записанная в исследованиях на монослое ДПФЭ, по форме ближе к кривой выхода Yb-флуоресценции от раствора соли (рис. 5). Лишь незначительное увеличение интенсивности Yb-флуоресценции вблизи критического угла свидетельствует о концентрировании небольшого количества ионов иттербия у поверхности.

Оценки параметров распределения ионов иттербия под монослоями ДПФГ и ДПФЭ получены на основе математического моделирования экспериментальных угловых зависимостей выхода Yb-флуоресценции. Оказалось, что в обоих случаях угловые зависимости выхода Yb-флуоресценции представляют собой сумму вкладов от ионов иттербия, адсорбированных в тонком слое у нижней границы фосфолипидного монослоя, и ионов иттербия, присутствующих в растворе соли Yb(NO₃)₃ · xH₂O в объеме водной субфазы. Толщина тонкого слоя составляет D_L = 10 ± 5 Å, слой находится на расстоянии 25 ± 5 Å от границы воздух/пленка. Суммируя кривые выхода флуоресценции от этого слоя и от водной субфазы с соответствующими весовыми множителями K_L и K_S, можно добиться совпадения расчетных кривых и экспериментальных данных. При этом отношение весовых множителей K_L/K_S дает представление о соотношении концентрации иттербия в тонком слое и в объеме водной субфазы. Наилучшее совпадение между расчетом и экспериментальными данными было получено для следующих значений отношения K_L/K_S: 2.5 для монослоя ДПФГ и 0.1 для монослоя ДПФЭ. Иными словами, концентрация ионов иттербия, адсорбированного в тонком слое под монослоем ДПФГ, оказалась в 25 раз выше, чем под монослоем ДПФЭ. Такое различие легко объяснить, если учесть, что в монослое ДПФГ головки фосфолипидных молекул имеют отрицательный заряд, тогда как у молекул ДПФЭ головка в целом электронейтральна.

Таким образом, можно утверждать, что при использованной в проведенных экспериментах концентрации соли Yb(NO₃)₃ · 5H₂O нарушений кристаллической структуры фосфолипидных монослоев не наблюдается; об этом свидетельствует отсутствие изменений на двумерных картах дифракционного рассеяния. Однако благодаря электростатическому взаимодействию часть ионов иттербия концентрируется под фосфолипидным монослоем. Причем наиболее интенсивно такие процессы происходят в случае фосфолипида ДПФГ с отрицательно заряженной головной группой.

Композиты в системе ПВП–RE(NO₃)₃ · хH₂O. Для разработки антимикробных препаратов с участием RE(NO₃)₃ · xH₂O необходимо создание формообразующей основы. Такой основой представляется гидрогель на основе водорастворимого, биосовместимого и нетоксичного полимера поли-N-вилилпирролидонона – ПВП ((C₆H₉NO)_n). При этом ПВП не обладает антимикробными свойствами.

Композиционные гидрогели ПВП/RE с RE = = Gd, Yb проявляют бактерицидные свойства c высокой чувствительностью к Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, с RE = La, Ce, Y – cо средней чувствительностью к Staphylococcus aureus и Escherichia coli, с RE = La – c малой чувствительностью к Escherichia coli (рис. 6а).

АМА уменьшается в рядах ПВП/Gd > ПВП/Yb > > ПВП/La ≈ ПВП/Y > ПВП/Ce для Candida albicans, ПВП/Gd > ПВП/Yb > ПВП/Y > ПВП/La ≈ ≈ ПВП/Ce для Staphylococcus aureus, ПВП/Yb > > ПВП/Gd > ПВП/Y > ПВП/La ≈ ПВП/Ce для Escherichia coli (рис. 6а).

Присутствие частиц с лантаном в гидрогеле ПВП/La увеличивает активность только по отношению к Staphylococcus aureus по сравнению с исходным порошком La(NO₃)₃ · хH₂O (рис. 1). Во всех остальных случаях антимикробные свойства ПВП/RE меньше, чем у RE(NO₃)₃ · хH₂O. Причем АМА остается наименьшей у образцов c La, а на первый план выходят ПВП/RE с Gd и Yb (рис. 6а) по сравнению с исходными солями с RE = Y и Ce с наибольшей АМА (рис. 1). Самая высокая АМА исходных порошков RE(NO₃)₃ · хH₂O (RE = La, Gd, Yb) и гидрогелей с их участием проявляется по отношению к грибам Candida albicans (диаметр зоны задержки роста >30 мм). Необходимо учитывать тот факт, что при синтезе гидрогелей присутствующие в них ионы RE могут образовывать комплексы с молекулами воды, полимера, ТЭОС, которые составят конкуренцию за координацию RE с патогенными микроорганизмами. Все это приводит к снижению АМА композиционных гидрогелей ПВП/RE по сравнению с солями RE.

Общий вид дифракционных картин нативных гидрогелей ПВП и ПВП/RE с двумя диффузными пиками практически одинаковый (рис. 7).

Первый, наиболее интенсивный, пик (межплоскостное расстояние d₁ ∼ 4 Å) на дифрактограммах ПВП и ПВП/RE (рис. 7) отвечает за меж- и внутримолекулярные расстояния между центрами масс кольца с гидрофильными группами –N–C=O и сильным внутрицепочечным вкладом. К этой боковой группе водородными связями присоединяется связанная вода: –N–C=O…H–O…H: чем меньше межплоскостное расстояние d₁ и больше интенсивность пика, тем больше молекул связанной воды. Из двух образцов ПВП/RE, представленных на рис. 7, наибольшее содержание связанной воды в ПВП/Gd (рис. 7в).

Второй малоинтенсивный диффузный пик (d ∼ 2 Å) обусловлен промежуточной или кластерной водой, физически захваченной между гидратированными полимерными цепями и связанной с цепями полимера гидрофобными взаимодействиями [16]. Этой воды больше в ПВП/Сe (рис. 7б).

Третий маловыраженный диффузный пик (d ∼ ∼ 9 Å), отсутствующий на дифрактограмме ПВП (рис. 7а), относится к межмолекулярным расстояниям между основными полимерными цепочками –CH₂–CH₂– и отвечает за свободную воду, которая находится в сетке гидрогелей. Содержание этой воды явно больше в ПВП, так как пик, отвечающий за этот вид воды, выходит за пределы дифрактограммы.

На дифрактограммах отсутствуют дифракционные пики, относящиеся к RE(NO₃)₃ · хH₂O, что свидетельствует о наличии в гидрогелях ионов RE и/или кластеров разного состава c ионами RE.

По данным ДСК (рис. 8, табл. 2) содержание всех видов воды уменьшается в ряду ПВП/Y > > ПВП/Ce(La) > ПВП/Yb > ПВП/Gd (что согласуется с рентгенографическими данными [16]), т.е. содержание воды в композиционных гидрогелях антибатно коррелирует с АМА.

Не исключено, что присутствие воды в композиционных гидрогелях “разбавляет” концентрацию функциональных ионов RE³⁺ в составе ПВП/RE, так как известно, что увеличение концентрации функциональных групп увеличивает антимикробную активность [10, 37, 43]. Однако не следует забывать о присутствии в растворе солей кислоты HNO₃ [32], которая также может влиять на бактерицидные свойства.

Композиционные гидрогели ПВП/RE проявляют не бактерицидные, а бактериостатические свойства к грамположительным бактериям Staphylococcus epidermidis и грамотрицательным Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumonia (рис. 4б), что приводит не к гибели микроорганизмов, а лишь к прекращению их роста и размножения. Проявление действия гидрогелей разное в зависимости от природы бактерий и вида RE: Proteus mirabilis – ПВП/Сe ≈ ПВП/Gd > > ПВП/La ≈ ПВП/Yb ≈ ПВП/Y, Klebsiella pneumonia – ПВП/Gd > ПВП/Y, ПВП/Сe > ПВП/La ≈ ≈ ПВП/Yb, Staphylococcus epidermidis – ПВП/Yb ≈ ≈ ПВП/Y > ПВП/La ≈ ПВП/Ce ≈ ПВП/Gd.

Анализ результатов, представленных на рис. 6, показывает явную связь бактерицидных (бактериостатических) свойств композитов ПВП/RE с составом и строением бактерий (но не с группой бактерий: грамположительные или грамотрицательные), которые по-разному взаимодействуют с ионами редкоземельных металлов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты по изучению антимикробной активности в темноте солей RE(NO₃)₃ · · хH₂O (RE) и тех же солей в составе композиционных гидрогелей с ПВП (ПВП/RE) в отношении широкого круга микроорганизмов свидетельствуют о многофакторной связи бактерицидных и бактериостатических свойств как с характеристиками солей и гидрогелей, так и с природой микроорганизмов. Тем не менее проведенные исследования позволяют выделить соли RE(NO₃)₃ · · хH₂O с RE = Ce, Gd, Yb, Y, которые обладают ярко выраженными бактерицидными свойствами с высокой чувствительностью (зона задержки роста >40 мм) к микроорганизмам Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans. Они могут быть использованы при создании раневых повязок местного применения с антимикробным пролонгированным действием.

Композиционные гидрогели в системе ПВП–RE(NO₃)₃ · хH₂O проявляют бактерицидные свойства c высокой (RE = Gd, Yb) или средней (зона задержки роста >15 мм) чувствительностью к Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, или бактериостатические свойства по отношению к Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumonia. С другой стороны, высушенные на воздухе гидрогели ПВП и ПВП/RE имеют высокую степень набухания в воде: ПВП > ПВП/Ce > ПВП/La > > ПВП/Y > ПВП/Yb > ПВП/Gd (часть из них представлена в [16]). Именно cовокупность этих двух важных функциональных свойств ПВП/RE отвечает требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям медицинского назначения для лечения различных видов ран, трофических язв, а также ожогов.

Выявленные корреляционные связи характеристик RE(NO₃)₃ · хH₂O (RE), ПВП и ПВП/RE с антимикробными свойствами, представленные как в данной работе, так и в [16, 17], важны для создания новых антимикробных препаратов как в отдельности, так и в сочетании с антибиотиками (для исключения антибиотикорезистентности).

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-03-00330) и Министерством науки и высшего образования в части электронно-микроскопических исследований.