Кристаллография, 2021, T. 66, № 5, стр. 785-788

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время одним из важных направлений научных исследований в биотехнологии является изучение возможностей практического использования микроорганизмов, обитающих в экстремальных условиях (экстремофилов). Такие микроорганизмы представляют особый интерес для биотехнологического применения, поскольку являются природными продуцентами ферментов, способных функционировать в нестандартных и часто экстремальных условиях: при повышенной или пониженной температуре, в присутствии высокой солености или органических растворителей и т.д. [1, 2].

Примером практически значимых ферментов являются липазы, являющиеся обширным классом гидролитических ферментов, которые катализируют расщепление сложноэфирных связей в триацилглицеридах, а также находят многочисленные применения в различных биотехнологических процессах [3, 4]. Липолитические ферменты имеют схожую пространственную структуру – двудоменный α/β-гидролазный фолд, включающий в себя каноническую каталитическую триаду, состоящую из остатков Ser-His-Asp/Glu.

Согласно существующей классификации, основанной на наличии консервативных мотивов, липазы делятся на несколько семейств – I–VIII [5–7], пространственные структуры представителей каждого из которых к настоящему моменту установлены. Бактериальные ферменты, относящиеся к семейству IV, по своей структуре и свойствам схожи с гормон-чувствительными липазами млекопитающих и потому были названы бактериальными гормон-чувствительными липазами (bHSL). Ферменты этого семейства в свою очередь подразделяются на два класса на основании последовательности мотива активного центра – GD(E)SAG и GTSAG [8–10]. В последнем случае допускается вариабельность остатка, предшествующего каталитическому серину. В отличие от хорошо изученных ферментов класса GDSAG ферменты второго класса изучены значительно меньше – установлены структуры всего трех ферментов. Одним из них является эстераза PMGL2, ген которой обнаружен в результате скрининга метагеномной библиотеки ДНК из вечномерзлого грунта. Эстераза относится к семейству HSL [11] и характеризуется наличием неканонического аминокислотного остатка (а.о.) в положении, предшествующем каталитическому S174, в консервативном мотиве активного центра – ¹⁷²GXSAG¹⁷⁶. В случае PMGL2 в этом положении находится остаток цистеина – C173. С целью выяснения функциональной роли данного остатка цистеина был сконструирован ряд мутантных вариантов PMGL2, содержащих в этом положении остатки треонина, аспарагиновой кислоты и серина, встречающиеся у гомологичных ферментов [12].

В настоящей работе исследована кристаллическая структура точечного мутанта C173S эстеразы PMGL2 (m3PMGL2) с разрешением 1.5 Å. Проведено сравнение структур мутантной формы и дикого типа PMGL2 на уровне строения субъединицы, функционального димера и активного центра фермента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очистка и выделение белка, кристаллизация. Очистку и выделение мутантной формы m3PMGL2 проводили согласно [10]. Очищенный белок концентрировали до 10 мг/мл при помощи концентраторов Millipore для последующей кристаллизации.

Кристаллизацию m3PMGL2 проводили при температуре +20°С методом диффузии в парах (висячая капля) [10]. Финальные условия кристаллизации следующие: 250 мМ MgCl₂, 100 мМ HEPES 12% PEG 3350, pH 7.5.

Сбор и обработка дифракционных данных. Решение и уточнение структуры. Непосредственно перед сбором данных кристаллы m3PMGL2 кратковременно вымачивали в кристаллизационном растворе, содержащем дополнительно 25% глицерина в качестве криопротектора, после чего кристаллы вылавливали при помощи петли и помещали под струю жидкого азота. Дифракционные данные собраны на станции синхротронного источника SPring-8 (Harima Science Garden, Япония) при температуре 100 K. Дифракционная картина фиксировалась детектором Pilatus6M. Экспериментальные данные проиндексированы и обработаны с использованием программы iMOSFLM [13]. С помощью программы Pointless [14] установлена пр. гр. P2₁. Статистика набора данных приведена в табл. 1.

Структура m3PMGL2 получена с разрешением 1.50 Å при помощи метода молекулярного замещения с применением программы MOLREP [15]. В качестве стартовой модели использовали структуру PMGL2 дикого типа (код PDB6QIN). Уточнение структуры проводили с помощью программы REFMAC5 из набора CCP4 [16]. Визуальный осмотр карт электронной плотности и уточнение модели проводили с использованием программы COOT [17]. Уточнение структуры выполняли до достижения R-факторами следующих значений: R_work = 16.8%, R_free = 19.5% (табл. 2).

В случае m3PMGL2 в независимой части элементарной ячейки кристалла находятся две белковые цепи (в цепи A – 317 остатков, в цепи B – 320 остатков), один ион магния, две молекулы PEG 3350 и 453 молекулы растворителя. Электронная плотность отсутствует для 16 и 13 N-концевых аминокислот для цепей А и B соответственно, что может быть связано с их относительной подвижностью. Также в обеих цепях молекулы для а.о. 221–226 электронная плотность имела низкий уровень, позволивший, однако, достроить эти участки.

Анализ структуры проводили с использованием программы COOT и системы молекулярной графики PyMOL, Version 1.9.0.0 (Schrodinger, USA). Сравнение и наложение структур проводили с помощью сервиса PDBeFold [18], а контакты анализировали с использованием сервиса PDBePISA [19].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Кристаллы m3PMGL2 принадлежат пр. гр. P2₁. В независимой части элементарной ячейки кристалла находятся две субъединицы белка, образующие функциональный димер.

Структура m3PMGL2 имеет типичный α/β-гидролазный фолд, состоящий из двух канонических доменов – CAP-домена и каталитического домена. Домен CAP содержит две α-спирали (α1 и α2). Каталитический домен состоит из восьми β-тяжей (β1–β8), окруженных девятью α-спиралями (α3–α11) [10], и содержит в активном центре каталитический остаток серина – S174.

Анализ контактов между субъединицами из независимой части показал, что m3PMGL2 аналогично многим другим эстеразам является димером в кристалле. Скрытая при формировании димера поверхность (buried surface area) составляет 1508 Ų (11.3% поверхности субъединицы). Димер стабилизирован 10 солевыми мостиками и 20 водородными связями. Оценка гидрофобных межмолекулярных взаимодействий в димере, сделанная по выигрышу свободной энергии при формировании межмолекулярного контакта, дает величину –7.5 ккал/моль. Полученные значения схожи с таковыми для дикого типа PMGL2 [10].

Проведенный анализ показал, что структуры субъединиц m3PMGL2 и дикого типа фермента также весьма схожи (RMSD = 0.181 Ų). Наложение субъединиц продемонстрировало, что элементы вторичной структуры расположены идентично, что говорит об отсутствии влияния точечной замены на общую структуру фермента (рис. 1). Основные различия между структурами обнаружены в петлях 221–226. В молекуле PMGL2 дикого типа а.о. 221–226 не имели электронной плотности [10] в отличие от молекулы m3PMGL2, где эта область имеет электронную плотность, хотя и низкого уровня.

Рис. 1.

Наложение структуры m3PMGL2 (темный) на структуру PMGL2 дикого типа (светлый). Расположение петли 221–226 обозначено стрелкой.

Полость активного центра m3PMGL2 сформирована остатками G172, S173, A175, G176. В активном центре m3PMGL2 на месте цистеина, предшествующего каталитическому S174, находится серин, что подтверждает проведенную мутацию (рис. 2). Электронная плотность для S173 демонстрирует, что он имеет двойное положение: в одном положении его боковая группа ориентирована по направлению к C202, а в другом – к боковой группе F305. В последнем положении S173 способен образовывать водородную связь с боковой группой E120 через молекулу растворителя.

Рис. 2.

Электронная плотность 2FOFC (серая сетчатая поверхность) вокруг остатка S173. Уровень срезки – 1σ. Палочковой моделью показано двойное положение остатка серина и окружающие его остатки активного центра (подписаны). Темным цветом показан ход полипептидной цепи белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследована структура мутантной формы эстеразы PMGL2, проведено ее сравнение со структурой белка дикого типа и показано, что на уровне структуры димера, субъединицы и активного центра различий в строении двух форм PMGL2 не обнаружено. Полученные результаты позволяют утверждать, что замена цистеина на серин в положении 173 не влияет на структуру фермента, при этом биохимические характеристики мутантной формы близки к таковым для дикого типа [12].

Работы по экспрессии и выделению белка выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-04-00491), работы по кристаллографическому уточнению и анализу полученной структуры выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ. Статья подготовлена по материалам кристаллизационных исследований, выполненных в ЦР (КЭ) “Кристаллизатор” (Шифр ЦР (КЭ) “МКС (Наука)” ФНИЦ-1) на российском сегменте Международной космической станции.