Кристаллография, 2021, T. 66, № 5, стр. 738-741

ВВЕДЕНИЕ

Классическим способом получения трехмерных структур белков является рентгеновская кристаллография, основанная на взаимодействии рентгеновских лучей с кристаллической решеткой. Однако ввиду относительно слабого взаимодействия рентгеновского излучения с образцом [1] необходимы кристаллы размером более 20 мкм [2, 3], получение которых является крайне трудоемким и затруднительным для ряда объектов [4], что накладывает ограничения на применимость метода. Для получения наборов дифракционных данных с кристаллов размером более ∼5 мкм используются источники синхротронного излучения, а в последние годы большие надежды по решению структур с использованием микрокристаллов меньших размеров возлагаются на серийную микрокристаллографию, в том числе фемтосекундную кристаллографию с использованием лазеров на свободных электронах [5, 6] (например, European XFEL). Данный подход подразумевает получение нескольких тысяч дифракционных картин отдельных микрокристаллов. Несмотря на увеличение количества успешно решенных структур [7], к настоящему моменту подобные установки являются уникальными, а для успешного эксперимента необходимы большие объемы изучаемых образцов [6].

Второе десятилетие двадцатого века отмечено бурным развитием методов просвечивающей криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и взрывным ростом их использования в клеточной и структурной биологии [8]. Наиболее известные подходы крио-ЭМ – метод анализа одиночных частиц (англ. SPA – Single Particle Analysis) и криоэлектронная томография – подразумевают получение прямых изображений изучаемого объекта с последующей обработкой и восстановлением 3D-структуры [9]. Как правило, для успешной 3D-реконструкции с получением структуры высокого (ниже 4 Å) пространственного разрешения толщина изучаемого объекта не должна превышать 100–200 нм, а его молекулярная масса в зависимости от конфигурации микроскопа и используемого детектора должна быть не менее ∼40–150 кДа [10, 11].

Вторая группа подходов крио-ЭМ базируется на использовании данных электронной дифракции. Так, электронная 2D-кристаллография позволяет восстанавливать структуру тонких (менее 1 мкм) белковых кристаллов по двумерным дифракционным картинам [12]. Однако в силу необходимости использования относительно больших доз электронов для получения данных высокого разрешения и, как следствие, радиационных повреждений облучаемых областей [13] необходимо получение больших серий двумерных дифракционных картин от десятков и сотен различных областей двумерных кристаллов с последующей ресурсоемкой обработкой данных.

Напротив, для получения дифракционной картины с высоким разрешением от трехмерных белковых кристаллов достаточно крайне низких электронных доз (∼1 э/Ų). Основываясь на сказанном выше, в 2013 г. группа под руководством Т. Гонена предложила новый метод – электронную дифракцию микрокристаллов (ЭДМ, англ. MicroED – Microcrystal Electron Diffraction) [14–16], которая заключается в получении непрерывной поворотной дифракционной серии от витрифицированных белковых кристаллов в широком угловом диапазоне [17] (как правило, в пределах ±70°). Такой подход позволяет использовать белковые кристаллы существенно меньшего размера, чем в рентгеновской кристаллографии. При этом ввиду сходства экспериментальных процедур [18] обработка полученных данных осуществляется в стандартных кристаллографических программных пакетах [19], а достигаемое пространственное разрешение подчас превосходит результаты, полученные с помощью XFEL [20].

Безусловно, для метода ЭДМ сохраняется основное ограничение крио-ЭМ – толщина образца не должна превышать нескольких сотен нанометров. Однако метод применим для кристаллов и большего размера – например, для кристаллов толщиной до 100 мкм возможно получение тонких срезов толщиной до 100–200 нм травлением с помощью фокусированного ионного пучка в криогенном режиме (крио-ФИП). Кроме того, метод ЭДМ позволяет успешно восстанавливать 3D-структуры белков и белковых комплексов существенно меньшей молекулярной массы, чем требуется для других методов крио-ЭМ [21]. Для реализации метода используется то же оборудование, что и для других методов крио-ЭМ: источник с полевой эмиссией, быстрый и высокочувствительный детектор [22] (Falcon 3/Falcon 4, Gatan K2/K3) и энергетический фильтр [20, 23]. Можно предположить, что с ростом популярности крио-ЭМ по всему миру и увеличением доступности соответствующего оборудования метод ЭДМ может стать одним из основных методов структурной биологии уже в ближайшие годы. Так, к настоящему времени с помощью ЭДМ решены более 100 структур, причем некоторые из них – впервые [21]. В представленной работе впервые в России методом ЭДМ получены дифракционные картины тонких срезов кристаллов модельного белка лизоцима, приготовленных с использованием крио-ФИП.

ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОКРИСТАЛЛОВ ЛИЗОЦИМА

Для кристаллизации использовали белок лизоцим из куриного яйца производства Sigma-Aldrich (CAS № 12650-88-3). Белок растворяли в 0.1 М натрий-ацетатном буфере, рН 4.5, в концентрации 200 мг/мл. Кристаллы размером 20–50 мкм выращены методом кристаллизации в объеме. Перед кристаллизацией раствор белка центрифугировали и смешивали в соотношении 1 : 1 с кристаллизационным раствором (300 мМ хлорида натрия, 0.1 М натрий-ацетатного буфера, рН 4.5). Кристаллы размером 15–35 мкм вырастали при температуре 4°С и имели классическую морфологию кристаллов тетрагональной кристаллической формы лизоцима.

ВИТРИФИКАЦИЯ МИКРОКРИСТАЛЛОВ

На первом этапе в течение 30 с осуществляли обработку электронно-микроскопической медной сетки с углеродной подложкой тлеющим разрядом с помощью прибора Pelco EasiGlow при силе тока 25 мА и давлении в камере 0.26 мбар. Далее на подготовленную сетку, помещенную в камеру прибора Vitrobot Mark IV (температура 4°С, влажность ∼95%), наносили 3 мкл раствора кристаллов лизоцима, после чего излишки раствора удаляли двусторонним сжатием фильтровальной бумагой и осуществляли процедуру витрификации – быстрое погружение сетки с образцом в жидкий этан при температуре жидкого азота с образованием тонкого слоя аморфного льда (рис. 1а). В процессе нанесения образца на сетку температура в камере системы Vitrobot составляла 4°С, влажность – не менее 95%.

Рис. 1.

Схемы экспериментов: а – заморозка кристаллов, б – приготовление тонкого среза замороженного образца с помощью крио-ФИП, в – получение поворотной серии изображений.

ПОЛУЧЕНИЕ ТОНКОГО СРЕЗА МИКРОКРИСТАЛЛОВ

Полученную сетку с витрифицированным раствором микрокристаллов лизоцима переносили в предварительно откачанную до высокой степени вакуума (∼10^–5 Па) камеру растрового электронно-ионного микроскопа Versa 3D, оснащенного криогенной приставкой QuorumPPT3010. Далее с помощью газово-инжекционной системы осуществляли четыре последовательных цикла напыления защитного проводящего слоя платины при температуре 26°С на поверхность сетки в течение 3–5 с. Пауза между циклами составляла не менее 10 с, что позволило избежать артефактов напыления, снизить накопление заряда и защитить поверхность образца от радиационных повреждений в процессе эксперимента (рис. 1б).

На рис. 2а представлено изображение, полученное в криогенном раствором электронном микроскопе (крио-РЭМ), микрокристаллов лизоцима на поверхности сетки. Большинство кристаллов расположено непосредственно на медной поддерживающей сетке, что существенно ограничивает выбор возможных областей для проведения эксперимента. Микрокристаллы размером до ∼50 мкм, расположенные на некотором удалении от медных перемычек сетки, подвергались травлению с помощью крио-ФИП в условиях “скользящего пучка”. Для этого столик с образцом поворачивали на угол 12°–20° и осуществляли утонение (рис. 1б, 2б) при ускоряющем напряжении 30 кВ с последовательным понижением силы тока от 1 нА до 30 пА для минимизации радиационных повреждений и снижения области аморфизации приповерхностного слоя. Температура столика с образцом в процессе эксперимента составляла –175°С.

Рис. 2.

Подготовка тонкого среза микрокристалла с помощью крио-ФИП: а – общий вид сетки, б – промежуточный этап приготовления тонкого среза кристалла, в – крио-ЭМ-изображение полученного среза.

ЭЛЕКТРОННАЯ ДИФРАКЦИЯ МИКРОКРИСТАЛЛОВ

Полученные сетки с тонкими срезами микрокристаллов лизоцима (рис. 1в) переносили в крио-ЭМ Titan Krios 60-300, оснащенный корректором сферических аберраций (Image corrector). Исследование проводили при ускоряющем напряжении 300 кВ и длине камеры 1.35 м. В результате с помощью камеры Ceta было получено видео дифракционной серии при непрерывном повороте сетки в диапазоне от –45° до 45° и со скоростью вращения держателя 1.5°/c. Поток электронов составил ∼0.2 э/Ų/c, а полная доза ∼12 э. Набор данных осуществлялся в течение 60 с, частота обновления изображений составила ∼4 кадра/с.

На рис. 3 приведены примеры дифракционных картин микрокристаллов лизоцима, полученные при наклоне держателя на –30° (рис. 3а), 0° (рис. 3б), 30° (рис. 3в). Наблюдается падение пространственного разрешения дифракционных картин от 2.2 Å при –30° до 2.9 Å при 30° во время съемки поворотной серии, вызванное накоплением радиационных повреждений на облучаемой области.

Рис. 3.

Электронная дифракция микрокристаллов. Изображения поворотной дифракционной серии, полученные под углами –30° (а), 0° (б), 30° (в).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получен набор дифракционных данных методом электронной дифракции микрокристаллов от монокристалла размером ∼35 мкм. Продемонстрированы основные технические аспекты метода – витрификация и препарирование микрокристаллов методом фокусирования ионного травления, а также получение поворотной дифракционной серии в режиме облучения образца малыми дозами электронов с помощью крио-ЭМ. Качество полученных экспериментальных данных указывает на возможность расшифровки структуры лизоцима. Помимо определения структуры трехмерных кристаллов при помощи крио-ЭМ ЭДМ актуальна для предварительной характеризации микрокристаллических суспензий для экспериментов по серийной кристаллографии с использованием синхротронного излучения или лазеров на свободных электронах.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИЦ “Курчатовский Институт” (приказ от 02.07.2020 № 1056) и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 19-29-12054).