Кристаллография, 2021, T. 66, № 5, стр. 821-828

Изучение конформационной подвижности GroEL методами криоэлектронной микроскопии и молекулярной динамики

И. С. Панина 1, А. А. Мамчур 2, И. А. Ярошевич 2, Д. В. Зленко 2, Е. Б. Пичкур 3, С. С. Кудрявцева 4, В. И. Муронец 4, О. С. Соколова 2, Т. Б. Станишнева-Коновалова 2*

1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Москва, Россия

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет
Москва, Россия

3 Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”
Москва, Россия

4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Факультет биоинженерии и биоинформатики
Москва, Россия

* E-mail: stanishneva-konovalova@mail.bio.msu.ru

Поступила в редакцию 06.08.2020
После доработки 06.08.2020
Принята к публикации 25.03.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Бактериальный шаперонин GroEL представляет собой сложный белковый олигомер кольцевой структуры, способствующий сворачиванию других белков путем их инкапсуляции в полости. Существует крайне мало структурной информации о неупорядоченном С-концевом фрагменте субъединиц GroEL, который участвует в процессе сворачивания субстратного белка. Представлена 3D-реконструкция апо-формы GroEL, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) с разрешением 3.02 Å и дополненная расчетами методом молекулярной динамики (МД). Результаты крио-ЭМ и МД хорошо согласуются и демонстрируют различную подвижность доменов субъединиц белка. Данные МД предсказывают динамику и сеть внутримолекулярных контактов С-концевых участков белка. Эти результаты имеют большое значение для последующего изучения механизма сворачивания белков в полости GroEL.

ВВЕДЕНИЕ

Шапероны – белки, отвечающие за сворачивание других макромолекул и обеспечивающие образование их нативной трехмерной структуры. Шапероны также называют белками теплового шока (англ. Heat Shock Proteins, HSP), поскольку их активность сильно возрастает при повышении температуры [1]. В группу шаперонов входят белки, имеющие схожие функции, но различающиеся по структуре и специфичности к субстрату [2]. Одним из семейств шаперонов являются шаперонины (HSP60). Обычно они представляют собой структуру из двух колец, каждое из которых содержит несколько субъединиц, различающихся по строению и расположению у разных организмов [3].

Выделяют две группы шаперонинов. К первой относятся шаперонины бактерий, а также шаперонины хлоропластов и митохондрий. Комплексы этой группы образуют симметричные кольца, каждое из которых состоит из семи одинаковых субъединиц. Шаперонины первой группы в своем функциональном цикле взаимодействуют с кошаперонином, образующим “крышку” над полостью кольца и инкапсулирующим белок-субстрат. Вторая группа шаперонинов объединяет белки, представленные в цитозоле эукариот и архей. Шаперонины второй группы тоже состоят из двух колец, однако каждое из них включает в себя восемь или девять субъединиц. При этом субъединицы внутри одного кольца могут различаться по структуре [4]. Кроме того, некоторые бактериофаги имеют в геноме последовательности, кодирующие ортологи GroEL [5, 6]. Примечательно, что шаперонины бактериофагов могут значительно отличаться от бактериальных: шаперонин бактериофага OBP Pseudomonas fluorescens представляет собой асимметричную однокольцевую структуру из семи субъединиц [7].

Наиболее изученным шаперонином является прокариотический комплекс GroEL/GroES, который в нормальных условиях широко представлен в клетках E. coli. Он взаимодействует с ненативными конформациями различных белков, предотвращая их неправильное сворачивание и агрегацию, и обладает слабой АТФ-азной активностью [8]. По своей структуре бактериальный шаперонин GroEL представляет собой сложный олигомерный белковый комплекс, состоящий из 14 идентичных субъединиц с молекулярной массой (ММ) 57 кДа каждая, объединенных в два кольца по семь субъединиц. Для осуществления своей функции ему необходимо взаимодействовать с GroES [9], состоящим из семи идентичных субъединиц с ММ 10 кДа каждая, объединенных в куполообразную кольцевую структуру. Каждая субъединица гептамерного кольца GroEL состоит из трех доменов: апикального, промежуточного и экваториального. Апикальный домен взаимодействует с белками-субстратами и GroES, а экваториальный связывает АТФ [10].

Между аминокислотными остатками GroEL формируются контакты, часть из которых меняется в ходе функционального цикла. В апо-форме (т.е. форме без нуклеотидов и белка-субстрата) связь колец друг с другом обеспечивают солевые мостики между остатками экваториальных доменов: Lys105-Ala109 и Glu461-Arg452 [1115]. Также солевыми мостиками связаны соседние субъединицы внутри одного кольца (Arg197-Glu386). Считается, что этот контакт, стабилизирующий структуру олигомера в апо-форме, разрушается при связывании АТФ, что запускает конформационные перестройки белкового комплекса [16, 17]. Кроме того, существует несколько внутрисубъединичных солевых мостиков: Asp83-Lys327, Glu209-Arg58 и Glu409-Arg501. Первые два мостика наиболее характерны для шаперонинов в связанном с нуклеотидом состоянии, но в отсутствие кошаперонина. Такие структуры более открыты, чем апо-форма (апикальный домен сильнее удален от экваториального), но конформационные перестройки еще не завершены. Контакт между аминокислотами Glu409 и Arg501 является очень стабильным и не разрушается даже при связывании АТФ и переходе в наиболее открытую конформацию субъединицы [16, 17].

Выяснить структуру и механизм работы комплекса GroEL/GroES во многом помогли методы рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), с помощью которых было получено более 150 структур комплекса (по данным базы Protein Data Bank), в том числе на разных стадиях функционального цикла. Однако у структурных методов есть ряд ограничений, в частности они не могут расшифровать подвижные участки молекул. У GroEL 23 аминокислоты С-конца каждой субъединицы образуют подвижный хвост, который выходит из экваториального домена в полость кольца [18]. Этот участок отсутствует на реконструкциях комплекса, но важен для его функционирования. Последние 13 аминокислот С-конца представляют собой четыре повтора последовательности Gly-Gly-Met и одну аминокислоту метионин (гидрофобная последовательность [GGM]4M), а предыдущие аминокислоты содержат отрицательные заряды. Гидрофобная последовательность является консервативным участком для всех гомологов GroEL [19]. Удаление этой последовательности не вызывает гибели бактерий, однако снижает их устойчивость к тепловому шоку [20]. Замена последовательности на [AAA]4A приводила к тому, что скорость сворачивания субстрата была ниже, чем для дикого типа, но больше, чем для мутанта с полностью удаленными С-концами [21]. Исследование гидрофильной части С-концевого фрагмента (аминокислоты 526–531), в котором гидрофильный участок заменялся на нейтральный или гидрофобный, продемонстрировало, что мутанты значительно медленнее восстанавливали нативную структуру субстратного белка роданазы [22]. В других работах было показано, что при удалении С-концов значительно снижалась скорость сворачивания субстратов Рубиско [23] и GFP [24]. Хотя структурные методы не дали результатов об атомарной структуре С-концевых участков, они позволили обнаружить некоторые закономерности в их динамике. В [25] методом крио-ЭМ показано, что С-концевые фрагменты цис- и транс-колец отклоняются друг от друга и взаимодействуют с субстратными красителями, которые использовались в данном эксперименте. В том же исследовании при рассмотрении комплекса GroEL–Рубиско отмечено, что субстратный белок контактирует с апикальными доменами и С-концами.

Вычислительные методы, включая метод молекулярной динамики (МД), могут выступать в качестве дополнения к структурным, моделируя подвижные участки. С помощью МД ранее проводилось изучение С-концевых фрагментов GroEL и было показано, как меняется положение С-концов в ходе функционального цикла и как на него влияет присутствие нуклеотидов [26]. В этом исследовании использовались АТФ- и АДФ-связанные кристаллические структуры GroEL, а положения всех остатков, кроме С-концевых, были зафиксированы. В настоящей работе использована полученная авторами структура апо-формы GroEL дикого типа по данным крио-ЭМ, построена ее атомарная модель с С-концевыми участками и проведен расчет МД-системы без дополнительных ограничений. Результаты МД указывают на различия в подвижности доменов субъединиц, что согласуется с вариациями локального разрешения структуры из крио-ЭМ, а также описывают динамику С-концевых участков в апо-форме.

МЕТОДЫ

Наработка и очистка GroEL. Продукцию шаперонина GroEL осуществляли, используя замороженную бактериальную культуру W3110 E. coli с плазмидой pOF 39. Для возобновления культуры 50 мл бактериальной среды LB (Luria Broth, Sigma), содержащей 50 мкг/мл ампициллина, заражали замороженной культурой и растили в течение ночи при 37°С и перемешивании 200 об./мин. Далее брали шесть колб с 200 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и добавляли ночную культуру до оптической плотности 0.1 при 600 нм. Продукцию GroEL проводили в течение ночи при 37°C и перемешивании 200 об./мин. Полученную культуру центрифугировали 20 мин при 5000 g и 4°C. Далее отмывали бактериальные клетки (осадок) 50 мМ Трис-HCl-буфером, pH 8.0, от среды, а затем суспендировали в лизирующем буфере (100 мМ Tris-HCl, pH 8.1), содержащем 0.1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ и 0.2 мг/мл ингибиторов протеаз (Sigma). Бактериальные клетки разрушали с помощью ультразвуковой обработки (Fisher Bioblock, Illkirch, Франция) пятью импульсами по 40 с при амплитуде 50%. Суспензию центрифугировали 30 мин при 11 000 об./мин, после чего последовательно высаливали супернатант сухим (NH4)2SO4 до 30 и 80%. Далее центрифугировали препарат при тех же условиях и растворяли осадок в буфере B (50 мМ Tris-HCl, pH 7.2, 0.1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ). Полученный раствор диализовали против буфера B в течение ночи. Диализат наносили на колонку с DEAE-Sepharose fast flow (Sigma), уравновешенную буфером B. Элюцию белка проводили градиентом 0–500 мМ NaCl. Хроматографию проводили со скоростью 1–3 мл/мин на хроматографической системе Аkta Prime с программным обеспечением Unicorn Control (Amersham Biosciences, Piscatway, США). Собирали фракции в объеме 8 мл и анализировали их методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Полученный препарат GroEL, содержащий ∼350 мМ NaCl (стабилизирует белок), нагревали в круглодонной колбе на водяной бане до 58°C, после чего остужали до комнатной температуры и добавляли Mg-ATP до конечной концентрации 2 мМ. Затем прогревали смесь до той же температуры в течение 2–3 мин. Данная стадия позволяет GroEL пройти свой естественный цикл и выпустить в среду денатурированные белки E. coli, которые могли сохраниться в полости шаперонина во время выделения. Денатурировавшие белки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 11 000 g. Препарат GroEL диализовали против буфера B в течение ночи, а затем повторно очищали на DEAE-Sepharose fast flow по указанной выше методике. Собирали фракции в объеме 6 мл и также анализировали их методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Фракции, содержащие очищенный GroEL, объединяли. Очищенный препарат GroEL высаливали сухим (NH4)2SO4 до 80% и хранили при 4°C.

Получение структуры GroEL по данным крио-ЭМ. Данные крио-ЭМ получены в Ресурсном центре зондовой и электронной микроскопии НИЦ “Курчатовский институт”. Вначале поддерживающие сетки для электронной микроскопии с периодическими отверстиями в аморфной пленке углерода (Quantifoil R1.2/1.3, Quantifoil) были обработаны в тлеющем разряде с помощью установки PELCO easiGlow при стандартных условиях: время обработки образца – 30 с, сила тока – 0.25 мА, остаточное давление в камере – 0.26 мБар. Далее на сетку наносили 3 мкл образца GroEL и проводили его витрификацию в камере установки Vitrobot Mark IV при следующих параметрах: сила сжатия при промакивании (Blot force) – 0 единиц, время промакивания (Blot time) – от 2.5 до 3.5 с, температура в камере – 4.5°C, влажность в камере – 95–100%. Затем замороженные сетки переносили в криоэлектронный микроскоп Titan Krios 60–300, оборудованный высокоэффективным детектором электронов Falcon II, где проводили съемку изображений с использованием программного обеспечения EPU (FEI). Обработку изображений и построение реконструкций проводили с помощью программных пакетов Warp [27] и CryoSPARC [28]. Всего было снято 675 стеков изображений, из которых 590 стеков были отобраны для дальнейшего анализа. При помощи программного пакета Warp провели коррекцию дрейфа, оценку параметров функции передачи контраста (CTF), а также выбор на изображениях одиночных проекций объекта исследования. Из исходных изображений после пре-процессинга были выделены 47 149 проекций одиночных частиц и экспортированы в программный пакет CryoSPARC, где была проведена их двухмерная классификация. Далее выбрали 15 классов, входящие в них частицы были подвергнуты процедуре трехмерной классификации. После чего отобрали 29 700 частиц, из которых строили 3D-реконструкцию GroEL с учетом симметрии D7. Разрешение структуры было оценено по критерию FSC = 0.143 и составило 3.02 Å.

Расчет траекторий молекулярной динамики. Атомарная модель апо-формы GroEL для расчетов МД построена в программе COOT [29] по структуре из крио-ЭМ. 23 остатка С-концевого фрагмента (526–548), не выявленные в плотности, были добавлены вручную с использованием стандартной утилиты Builder программы PyMOL версии 2.2.3 (www.pymol.org). Моделирование проводили с использованием программного пакета Gromacs [30] версии 2020.1 в силовом поле a99SB-disp [31] при постоянной температуре (300 K) и постоянном давлении (1 атм) с применением периодических граничных условий. Температура и давление поддерживались постоянными с помощью алгоритмов V-rescale [32] и Parrinello-Rahman [33] соответственно. Белок помещали в ячейку с водой (модель TIP4P-D) 17 × 17 × 18 нм, содержащей 150 мМ NaCl, включая противоионы для нейтрализации суммарного заряда белка (519 Na+ и 253 Cl). Электростатические взаимодействия рассчитывали с помощью алгоритма PME с радиусом отсечки 1.2 нм. Радиус отсечки для ван-дер-ваальсовых сил составлял 1.2 нм. Временной шаг интегрирования составил 2 фс. Перед расчетом МД была проведена релаксация системы, включающая этап минимизации энергии с последующим нагреванием системы от 5 до 300 К в течение 5 нс. Длительность траектории МД – 250 нс.

Значения RMSD и RMSF для Сα-атомов, а также попарное расстояние между остатками или атомами рассчитаны с помощью стандартных утилит пакета Gromacs. В качестве критерия существования контакта (по типу “солевой мостик”) между аминокислотами выбран порог 0.3 нм, который соответствует сумме ван-дер-ваальсовых радиусов sp3 N и sp3 O [34]. Программное обеспечение MDLovoFit использовали для дифференциального расчета RMSD [35]. С помощью MDLovoFit проводили анализ флуктуаций структуры посредством выравнивания всех подмножеств Cα-атомов белка, соответствующих различным долям φ – от общего числа Cα, и поиска подгруппы с наименьшим значением RMSD.

Для сравнения результатов крио-ЭМ и молекулярной динамики на основании траектории МД построена 3D-карта рассеивающей плотности шаперонина GroEL. Для этого был создан алгоритм для Python 3.6.9 [36], который переводит множество кадров МД в единую 3D-матрицу. Измерения матрицы соответствуют абсциссе, ординате и аппликате пространства, которое содержит координаты шаперонина GroEL, а каждый элемент матрицы пропорционален вероятности нахождения в соответствующем объеме (вокселе) атомов молекулярной модели. В данной работе размер вокселя матрицы соответствовал 1 × 1 × 1 Å3, а в формировании значений элементов матрицы участвовали только тяжелые атомы молекулярной модели. Для усреднения использовали 25 000 кадров молекулярной траектории, которые были предварительно выровнены прогрессивным алгоритмом программного пакета Gromacs. 23 аминокислоты, расположенные на С-концах субъединиц, при выравнивании не учитывали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Среднее разрешение структуры тетрадекамера GroEL, полученной по данным крио-ЭМ, составило 3.02 Å. На рис. 1а представлена поверхность GroEL, окрашенная в соответствии с локальным разрешением, которое варьирует от 2.5 до 4.1 Å. Значения от 2.5 до 3 Å характерны для области экваториальных доменов, ответственных за межкольцевые взаимодействия и связывание АТФ. В зоне апикальных доменов, связывающих белки-субстраты и GroES, разрешение падает до 4.1 Å. Эти особенности распределения локального разрешения структуры согласуются с результатами [37] и указывают на большую подвижность апикального домена относительно экваториального. С помощью полученной карты рассеивающей плотности построили атомарную модель тетрадекамера GroEL. 23 аминокислоты C-конца были достроены и добавлены каждой субъединице (рис. 1б).

Рис. 1.

Структура шаперонина GroEL по данным крио-ЭМ, окрашенная в соответствии с локальным разрешением (а). Атомарная модель, использованная в расчетах МД (б). Пунктирная окружность указывает на положение достроенных С-концевых участков.

С этой моделью провели расчет траектории МД длиной 250 нс. На основании траектории была построена 3D-карта рассеивающей плотности шаперонина GroEL (рис. 2), которая аналогично плотности из крио-ЭМ отражает вероятность обнаружить атом (рассеивающий центр) в соответствующей позиции структуры. Карта рассеивающей плотности, полученная из траектории МД, согласуется с картой плотности из крио-ЭМ, демонстрируя большие значения элементов матрицы в области экваториального домена по сравнению с апикальным. Согласие между результатами крио-ЭМ, полученными усреднением структуры по ансамблю частиц, и результатами МД, полученными усреднением по времени, указывает на достаточность собранного в крио-ЭМ числа частиц и продолжительности расчета МД.

Рис. 2.

Карта рассеивающей плотности, полученная на основании траектории МД. Представлены три изометрических поверхности, соответствующие высокому (0.39, слева), среднему (0.21, центр) и низкому (0.11, справа) уровням элементов 3D-матрицы рассеивающей плотности шаперонина GroEL.

Расчет среднеквадратичных флуктуаций (RMSF) Сα-атомов каждой субъединицы GroEL в траекториях МД показал, что домены этого белка различаются по своей мобильности, а основной вклад в конформационную подвижность вносят аминокислотные остатки С-конца и апикального домена (рис. 3). Среднее значение RMSF для экваториального домена составляет 0.15 нм, для интермедиального – 0.19 нм, для апикального – 0.27 нм, а для С-концевых остатков превышает 1 нм. Согласно полученным данным наиболее высокая величина флуктуаций упорядоченных частей белка (за исключением С-концов) наблюдается для остатков β-листов 6 и 7 и α-спиралей K и L, расположенных в начале и конце апикального домена соответственно, и может достигать значения 0.9 нм.

Рис. 3.

Различия в подвижности доменов GroEL в ходе траекторий МД. График RMSF Сα-атомов субъединицы белка (а). Жирной линией показаны усредненные по 14 субъединицам значения. Бледной широкой полосой показан диапазон значений RMSF каждого остатка. Ход основной цепи (показаны только Сα-атомы) субъединицы GroEL (б), раскрашенный в соответствии со шкалой значений B-фактора (внизу).

Значения среднеквадратичного отклонения (RMSD) координат Сα-атомов от их положения в начальной структуре для всех 14 субъединиц по результатам МД находятся в пределах от 0.27 до 0.33 нм. Отклонения от начальной позиции атомов апикального домена существенно превышают таковые для экваториального и интермедиального доменов: средние значения RMSD составляют 0.27, 0.19 и 0.17 нм соответственно. Чтобы выяснить, является ли вычисленное значение RMSD апикального домена следствием большего отклонения его начального (стартового) состояния от равновесного (достигнутого в ходе МД) или его большей подвижности, дополнительно был проведен анализ RMSD атомов относительно их положения в предшествующей структуре отдельно для каждого домена, а также выравнивание всевозможных подмножеств атомов одной субъединицы с целью выявления наиболее изменчивых областей с использованием программного пакета MDLovoFit [35]. Проведенный анализ позволил выявить полный набор Cα-атомов одной субъединицы с наименьшим RMSD. Было установлено, что по меньшей мере 60% атомов каждой субъединицы формируют “неподвижное ядро” и могут быть наложены на их исходные позиции в пределах 0.2 нм. Как и в [18], в данном моделировании не все субъединицы претерпевали изменения синхронно, что привело к переменному составу подвижной и неподвижной частей. Тем не менее для 11 из 14 субъединиц набор остатков неподвижного ядра совпадает на 79%. Рисунок 4а демонстрирует усредненное изменение во времени субъединицы целиком (средняя линия) и выявленных стабильных (нижняя линия) и высоко подвижных участков (верхняя линия). Атомы, входящие в подвижную группу, отклоняются от исходной структуры более чем на 0.6 нм и преимущественно входят в состав апикального домена, а также неупорядоченных С-концов (рис. 4б, светлым). Неподвижное ядро быстро приходит к равновесному положению и не изменяет своей структуры на протяжении проведенной МД (рис. 4б, темным).

Рис. 4.

Оценка RMSD Cα-атомов одной субъединицы. RMSD как функции времени Cα-атомов: субъединицы целиком; 60% атомов, составляющих неподвижное ядро субъединиц; оставшиеся 40% атомов, претерпевающих наибольшие изменения. Соответствующим бледным цветом закрашены диапазоны значений RMSD для 14 субъединиц (а). Суперпозиция фреймов МД. Неподвижное ядро показано темным, 40% наиболее подвижных атомов – светлым (б). Структуры ориентированы подобным рис. 3б образом. Видно, что в подвижную часть входят апикальный домен, С-концы и участки петель других доменов. Профиль распределения значений RMSD атомов относительно их положения в предшествующей структуре (Δt 50 пс) экваториального, интермедиального и апикального доменов (в).

Анализ RMSD относительно предшествующего по времени положения атомов показывает различную скорость изменения положения атомов в разных доменах (рис. 4в). За выбранный интервал времени (500 пс) экваториальный и интермедиальный домены изменяют свои структуры в пределах 0.06–0.07 нм, тогда как изменения RMSD апикального домена лежат в диапазоне 0.07–0.09 нм. Проведенный анализ подвижности шаперонина GroEL по результатам МД дает численные оценки разнородной подвижности доменов этого белка и дополняет качественную картину структурной динамики этой макромолекулы, полученную в рамках крио-ЭМ.

В рамках работы особое внимание уделено динамике пяти физиологически значимых аминокислотных контактов (рис. 5). Несмотря на отсутствие в стартовой модели непосредственного контакта между боковыми цепями внутрисубъединичных пар остатков Arg58-Glu209 и Asp83-Lys327, эти солевые мостики образуются в ходе динамики. Расстояние между парой тяжелых атомов солевого мостика Glu409-Arg501 остается постоянным (0.28 нм) на протяжении всего моделирования. Время жизни солевых мостиков, формируемых между субъединицами одного кольца, составляет ~95% от времени МД.

Рис. 5.

Наблюдаемые в ходе МД солевые мостики, образованные между доменами и субъединицами GroEL: а – карта солевых мостиков. По оси ординат указана пара остатков, образующих солевой мостик; б – диаграмма среднего для 14 субъединиц времени жизни изучаемых контактов, выраженное в процентах от времени моделирования.

Стабилизация межмолекулярного взаимодействия колец достигается за счет двух (в каждой паре субъединиц) солевых мостиков Arg452-Glu461. Анализ корреляции между образующимися контактами выявил, что наличие одного из контактов в паре связано с уменьшением вероятности образования другого (табл. 1). Описанное в литературе взаимодействие между кольцами посредством контактов Lys105-Ala109 не было реализовано в ходе МД, однако остатки Lys105-Ala109 одной субъединицы образуют перманентную водородную связь между атомами основной цепи.

Таблица 1.  

Коэффициенты корреляции (r) для пары контактов Arg452–Glu461 и Glu461–Arg452 соответствующих субъединиц, находящихся в межмолекулярном контакте двух колец

Пара взаимодействующих субъединиц r
A–K –0.824
B–J –0.693
C–I –0.500
D–H –0.541
E–N –0.564
F–M –0.923
G–L –0.897

В выполненных расчетах высокоподвижные С-концевые фрагменты белка формируют неупорядоченную сеть контактов между собой, а также взаимодействуют с другими доменами субъединиц своего кольца. Карта контактов (рис. 6) показывает, что помимо взаимодействия со своей субъединицей С-концы часто связываются с двумя соседними субъединицами в кольце.

Рис. 6.

Тепловая карта матрицы контактов С-концевых фрагментов с субъединицами. Цветовая шкала соответствует заселенности попарных контактов, выраженной в процентах от времени траектории.

Замечено, что существует различие в частоте образования контактов С-конца субъединицы с двумя соседними субъединицами кольца. С большей вероятностью С-конец связывается с внутренней поверхностью субъединицы, расположенной следующей по часовой стрелке (при взгляде со стороны апикальных доменов). Это наблюдение можно объяснить структурой белка, в которой С-конец структурированной части экваториального домена одной субъединицы расположен ближе к следующей по часовой стрелке субъединице, что делает более вероятным образование контакта. Отметим, что С-концы редко образуют контакты с субъединицами, расположенными более чем через одного соседа, хотя в ходе проведенной МД были обнаружены контакты между удаленными друг от друга субъединицами B и E.

Проведенное исследование иллюстрирует эффективное взаимодействие между экспериментальным (крио-ЭМ) и теоретическим (МД) подходами для изучения структурной динамики белка на примере шаперонина GroEL. Рассеивающая плотность, полученная в результате исследования крио-ЭМ, является не только отправной точкой для создания молекулярной модели для проведения МД, но и позволяет качественно оценить относительную подвижность отдельных доменов белкового комплекса. Как показано в работе, такая качественная оценка может быть сравнена с результатом расчета МД и являться способом его верификации. В свою очередь метод МД позволяет оценить количественные характеристики молекулярной подвижности, динамический характер образования и разрыва конкретных связей, а также рассмотреть крайне подвижные части белка, структуру которых невозможно реконструировать при помощи крио-ЭМ.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 19-74-20055).

Список литературы

  1. Maio A.D. // Shock. 1999. V. 11. № 1. P. 1. https://doi.org/10.1097/00024382-199901000-00001

  2. Bose D., Chakrabarti A. // IUBMB Life. 2017. V. 69. № 9. P. 647. https://doi.org/10.1002/iub.1656

  3. Skjaerven L., Cuellar J., Martinez A., Valpuesta J.M. // FEBS Lett. 2015. V. 589. P. 2522. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2015.06.019

  4. Yebenes H., Mesa P., Munoz I.G. et al. // Trends Biochem. Sci. 2011. V. 36. №8. P. 424. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2011.05.003

  5. Hertveldt K., Lavigne R., Pleteneva E. et al. // J. Mol. Biol. 2005. V. 354. № 3. P. 536. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2005.08.075

  6. Kurochkina L.P., Semenyuk P.I., Orlov V.N. et al. // J. Virology. 2012. V. 86. № 18. P. 10103. https://doi.org/10.1128/jvi.00940-12

  7. Stanishneva-Konovalova T.B., Semenyuk P.I., Kurochkina L.P. et al. // J. Struct. Biol. 2020. V. 209. № 2 P. 107439. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2019.107439

  8. Sparrer H., Lilie H., Buchner J. // J. Mol. Biol. 1996. V. 258. №1. P. 74. https://doi.org/10.1006/jmbi.1996.0235

  9. Grallert H., Buchner J. // J. Struct. Biol. 2001. V. 135. № 2. P. 95. https://doi.org/10.1006/jsbi.2001.4387

  10. Horwich A.L., Farr G.W., Fenton W.A. // Chem. Rev. 2006. V. 106. № 5. P. 1917. https://doi.org/10.1021/cr040435v

  11. Lorimer G.H., Fei X., Ye X. // Philos. Trans. R. Soc. London. B. 2018. V. 373 (1749). P. 20170179. https://doi.org/10.1098/rstb.2017.0179

  12. Ludtke S.J., Baker M.L., Chen D.-H. et al. // Structure. 2008. V. 16 (3). P. 441. https://doi.org/10.1016/j.str.2008.02.007

  13. Ranson N.A., Clare D.K., Farr G.W. et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. V. 13 (2). P. 147. https://doi.org/10.1038/nsmb1046

  14. Saibil H.R., Fenton W.A., Clare D.K., Horwich A.L. // J. Mol. Biol. 2013. V. 425. № 9. P. 1476. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2012.11.028

  15. Sot B., Galán A., Valpuesta J.M. et al. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 37. P. 34024. https://doi.org/10.1074/jbc.m205733200

  16. Ma J., Sigler P.B., Xu Z., Karplus M. // J. Mol. Biol. 2000. V. 302. № 2. P. 303. https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.4014

  17. Ranson N.A., Farr G.W., Roseman A.M. et al. // Cell. 2001. V. 107. № 7. P. 869. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(01)00617-1

  18. Piana S., Shaw D.E. // J. Phys. Chem. B. 2018. V. 122. № 49. P. 11440. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.8b07366

  19. Brocchieri L., Karlin S. // Protein Science. 2008. V. 9. № 3. P. 476. https://doi.org/10.1110/ps.9.3.476

  20. Mclennan N.F., Girshovich A.S., Lissin N.M. et al. // Mol. Microbiol. 1993. V. 7. № 1. P. 49. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1993.tb01096.x

  21. Tang Y.-C., Chang H.-C. Roeben A. et al. // Cell. 2006. V. 125. № 5. P. 903. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.04.027

  22. Machida K., Kono-Okada A., Hongo K. et al. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. № 11. P. 6886. https://doi.org/10.1074/jbc.m708002200

  23. Weaver J., Rye H.S. // J. Biol. Chem. 2014. V. 289. № 33. P. 23219. https://doi.org/10.1074/jbc.m114.577205

  24. Ishino S., Kawata Y., Taguchi H. et al. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 24. P. 15042. https://doi.org/10.1074/jbc.m114.633636

  25. Chen D.-H., Madan D., Weaver J. et al. // Cell. 2013. V. 153. № 6. P. 1354. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.04.052

  26. Dalton K.M., Frydman J., Pande V.S. // PLoS ONE. 2015. V. 10. P. e0117724. № 3. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0117724

  27. Tegunov D., Cramer P. // Nat. Methods. 2019. V. 16. № 11. P. 1146. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0580-y

  28. Punjani A., Rubinstein J.L., Fleet D.J., Brubaker M.A. // Nat. Methods. 2017. V. 14. № 3. P. 290. https://doi.org/10.1038/nmeth.4169

  29. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowtan K. // Acta Cryst. D. 2010. V. 66. № 4. P. 486. https://doi.org/10.1107/s0907444910007493

  30. Abraham M.J., Murtola T., Schulz R. et al. // SoftwareX. 2015. V. 1. P. 19. https://doi.org/10.1016/j.softx.2015.06.001

  31. Robustelli P., Piana S., Shaw D.E. // Proc. Natl Acad. Sci. 2018. V. 115 (21). https://doi.org/10.1073/pnas.1800690115

  32. Bussi G., Donadio D., Parrinello M. // J. Chem. Phys. 2007. V. 126. № 1. P. 014101. https://doi.org/10.1063/1.2408420

  33. Parrinello M., Rahman A. // J. Appl. Phys. 1981. V. 52. №12. P. 7182. https://doi.org/10.1063/1.328693

  34. Tsai J., Taylor R., Chothia C., Gerstein M. // J. Mol. Biol. 1999. V. 290. № 1. P. 253. https://doi.org/10.1006/jmbi.1999.2829

  35. Martínez L. // PLoS ONE. 2015. V. 10. № 3. P. e0119264. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119264

  36. Python Release Python 3.6.9. Python.org. Retrieved from https://www.python.org/downloads/release/python-369/

  37. Roh S.-H., Hryc C.F., Jeong H.-H. et al. // Proc. Natl Acad. Sci. 2017. V. 114. № 31. P. 8259. https://doi.org/10.1073/pnas.1704725114

Дополнительные материалы отсутствуют.