Кристаллография, 2021, T. 66, № 5, стр. 802-806

ВВЕДЕНИЕ

Олигомеризация белков может являться причиной некоторых нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и других [1, 2]. Триггерами олигомеризации могут служить ионы металлов. Индуцированная металлами агрегация может встречаться как у частично разупорядоченных белков, так и у глобулярных. Например, ионы хрома, кобальта и никеля способствуют агрегации альбумина [3]. Часто встречаются данные, свидетельствующие о том, что агрегацию белков способны вызывать ионы цинка и меди [4–7]. Медь присутствует в организме человека в концентрации 16–20 мкМ в крови, 15 мкМ в синаптической щели и 0.5–2.5 мкМ в спинномозговой жидкости [8]. Ее концентрация в спинномозговой жидкости повышена в 2.2 раза у пациентов с болезнью Альцгеймера [9]. При болезни Альцгеймера концентрация так называемой свободной (диализуемой) меди в плазме крови достигает 5 мкМ [10].

Церулоплазмин (ЦП) – медьсодержащая многофункциональная гликозилированная ферроксидаза с молекулярной массой (ММ) ∼132 кДа, циркулирующая в растворимой форме в плазме крови. Благодаря способности превращать токсичное двухвалентное железо в трехвалентное он является природным антиоксидантом. ЦП содержит от 40 до 70% меди плазмы крови [11]. Большинство исследований такими методами, как гель-фильтрация, электрофорез в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР), показывают, что ЦП млекопитающих является мономером [12–15]. Ранее в литературе была описана так называемая димерная изоформа ЦП с молекулярной массой ∼200 кДа [16]. Димер ЦП был обнаружен в плазме крови здоровых доноров и секретировался культурой гепатоцитов (HepG2). Опыты, в которых при кросс-сшивке мономерного ЦП с помощью дитиобиссукцинимидилпропионата образовался продукт с ММ ∼200 кДа, а при ограниченном протеолизе мономерного и димерного ЦП образовались идентичные фрагменты, позволили заключить, что обнаруженная ими изоформа ЦП является димером, а не продуктом посттрансляционной модификации или альтернативного сплайсинга [16]. Полипептидная цепь белка свернута в глобулу, состоящую из шести доменов, расположенных в форме псевдогексамера, соединенных длинными петлями. Благодаря ионам меди в структуре ЦП помимо ферроксидазной активности обладает свойствами оксидазы, NO-оксидазы, NO₂-синтазы, супероксиддисмутазы. Структурные исследования показывают, что ЦП человека содержит шесть–восемь центров связывания меди, из которых шесть основных сайтов всегда заполнены, а заполнение двух лабильных сайтов наблюдается не всегда [13]. ЦП крысы содержит на один лабильный сайт больше [17]. Обнаружено, что при избытке меди ЦП подвержен олигомеризации. Было исследовано олигомерное состояние ЦП в растворе методом МУРР в присутствии хлорида меди и обнаружена частичная димеризация белка. В результате была получена трехмерная модель димера низкого разрешения, определены зоны контактов мономер–мономер.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и очистка церулоплазмина. Для получения препарата мономерного ЦП с A₆₁₀/A₂₈₀ > > 0.049 плазму крови с добавлением 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0.1 мМ фенилметилсульфонил фторида (PMSF) подвергали хроматографии на UNOsphere Q и неомицин-агарозе [18]. Далее ЦП концентрировали до 80 мг/мл с помощью центрифужной ячейки Vivaspin 20 (M > 100 кДа), трижды заменяя 0.1 M Hepes-NaOH рН 7.5.

Малоугловое рентгеновское рассеяние. Предварительные измерения малоуглового рассеяния ЦП были проведены на станции БиоМУР Курчатовского центра синхротронного излучения [19]. Финальные измерения МУРР были проведены на станции EMBL P12 BioSAXS (кольцо PETRA-III синхротрона DESY, Гамбург, Германия) [20] в диапазоне векторов рассеяния 0.023 < s < 5.0 нм^–1 (s = $4\pi \sin \theta {\text{/}}\lambda $, где 2θ – угол рассеяния и λ = = 0.124 нм – длина волны). Линия P12 оснащена оборудованием для автоматической смены образцов и двумерным детектором Pilatus 2M (фирма DECTRIS, Швейцария). Время экспозиции одного образца – 20 кадров по 0.05 с каждый. При сравнении временных кадров радиационного повреждения зафиксировано не было. Данные были собраны при концентрации ЦП 1.5–7.0 мг/мл (11–53 мкМ) как в присутствии 10 мкМ CuCl₂, так и без добавления соли меди. Первичную обработку экспериментальных данных проводили в соответствии со стандартными процедурами [21]. В частности, усреднение сигнала от буфера и его вычитание осуществляли с использованием программы PRIMUS [22]. Рассеяние в нулевой угол I(0) и радиус инерции R_g вычислены с помощью приближения Гинье [23]. Программу обратного фурье-преобразования GNOM [24] использовали для оценки максимального размера частиц D_max. Эффективные ММ частиц в растворе получены путем сравнения с рассеянием на эталонном образце бычьего сывороточного альбумина (66 кДа). В качестве дополнительного контроля ММ использовали исключенный (породовский) объем V_p [25, 26].

Олигомерное равновесие. Альтернативные модели димера ЦП, полученные с помощью докинга, применяли для приближения экспериментальных данных образца, содержащего мономеры и димеры. Анализ смесей мономер–димер осуществляли по программе OLIGOMER [22], которая приближает данные рассеяния линейной комбинацией кривых рассеяния компонентов смеси. Варьируемыми параметрами являются объемные доли компонентов, а приближение осуществляется путем минимизации невязки χ² между экспериментальными данными I_exp(s) и рассчитанной кривой I_calc(s).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная кривая МУРР для раствора ЦП с добавлением 10 мкМ хлорида меди показана на рис. 1. Соответствующие общие параметры растворенных частиц приведены в табл. 1. В табл. 1 также приведены теоретические значения R_g, D_max, V_p для кристаллографической модели и ММ мономера по данным масс-спектрометрии [27], поскольку этот метод намного точнее определяет ММ белка, чем теоретические расчеты по кристаллографической модели (118 кДа) или аминокислотной последовательности ЦП (122.2 кДа) из-за гликозилирования, типичного для белков млекопитающих [27]. Полученные экспериментально для образца церулоплазмина ММ и V_p свидетельствуют о том, что в растворе находятся как мономеры, так и димеры ЦП в соотношении 40 : 60%. Действительно, кривая МУРР, рассчитанная для мономера ЦП, систематически отличается от экспериментальных данных в области малых и средних углов. Олигомерное равновесие в смеси было охарактеризовано с помощью линейной комбинации кривых рассеяния, рассчитанных для кристаллографической модели ЦП (код pdb 4enz) и моделей димера, построенных с использованием сервера ClusPro [28]. Всего было рассмотрено двадцать возможных вариантов димеризации ЦП. При помощи программы OLIGOMER и докинга найден оптимальный вариант димера, а также определены объемные доли мономера и димера, которые совпали со значениями, полученными из анализа ММ и V_p. На рис. 2, 3 представлена оптимальная модель димера, a на рис. 1 – приближение экспериментальных данных МУРР смесью 40% кристаллографического мономера с 60% оптимального варианта димера. Несколько высокое значение χ², видимо, связано с недооцененными ошибками эксперимента. Контакт мономеров расположен далеко от сайтов связывания меди, как основных, так и лабильных.

Рис. 1.

Кривые МУРР раствора церулоплазмина (а): кружки – экспериментальные данные, штриховая линия – приближение кристаллографической моделью мономера, сплошная линия – приближение смесью мономера и димера в соотношении 40 : 60%; распределение взвешенных аминокислотных остатков в случае приближения смесью (I(s_i)–I_смесь(s_i))/σ(s_i) (б).

Рис. 2.

Кристаллографическая модель мономера церулоплазмина (а) и оптимальная модель димера, полученная докингом (б).

Рис. 3.

Модель димера церулоплазмина: ионы меди изображены сферами, темным цветом показаны ионы в лабильных сайтах связывания меди, зона контакта мономер–мономер выделена овалом, А и B – субъединицы.

Анализ областей димеризации позволил приблизительно определить основные зоны контактов. Петля 698–710 субъединицы А взаимодействует с доменом III субъединицы В. С этим доменом взаимодействует, вероятно, и Trp669 субъединицы А (рис. 4). Trp669 и Ser662 относятся к сайту связывания р-фенилендиамина. Этот ароматический амин является классическим субстратом для измерения оксидазной активности ЦП [29, 30]. Следовательно, образование димера может блокировать связывание этого субстрата и, соответственно, его окисление.

Рис. 4.

Внутридимерный контакт в области p-фенилендиаминсвязывающего сайта.

Другой контакт расположен в области петли 885–890, соединяющей домены V и VI субъединицы А с доменом IV субъединицы В. Способность ионов металлов вызывать агрегацию конкретного белка зависит от многих параметров. В их число входят тип металла и белка, внутриклеточная концентрация ионов металла, структура белка, содержание и взаимное расположение потенциальных лигандирующих групп в боковых цепях аминокислот. К таким группам относятся тиоловая, имидазольная и карбоксилатная [31]. Предпочтительным кандидатом на роль лиганда ионов меди является гистидин [32]. Используемый метод не позволяет точно определить сайты связывания металла, тем более что в зонах контактов расположены преимущественно лабильные междоменные петли, которые могут иметь различные конформации. Конформацию одного из участков ЦП, а.а 885–890, предположительно вовлеченного в межмолекулярное взаимодействие, ни разу не удалось установить при рентгеноструктурном анализе [13].

Аминокислотные последовательности областей зон межмолекулярных контактов не содержат гистидины. Однако потенциальный сайт связывания иона меди с типичными лигандами может быть сформирован боковыми цепями Glu704 (субъединицы В) и Met580 (субъединицы А), расположенными на α-спирали (рис. 5а). Другой потенциальный сайт включает в себя Glu 419 (субъединицы А) и Glu712 (субъединицы В) (рис. 5б). Аргинин также является предпочтительным лигандом для Cu²⁺ [32], и нельзя исключить, что Arg701 (субъединицы В) (рис. 5а) может быть вовлечен в связывание ионов металла, как и соседний Arg700 (рис. 4). Потенциальная роль димеризации ЦП под действием ионов меди вытекает из анализа областей олигомеризации. Петля 885–890 участвует в обнаруженных in vivo белок-белковых взаимодействиях ЦП [13], ингибируя в них миелопероксидазу и пероксидазу эозинофилов [33]. Таким образом, ЦП предотвращает синтез хлорноватистой кислоты (HOCl) и окисление ряда ароматических субстратов. HOCl является мощным антибактериальным агентом и частью врожденного иммунного ответа. Однако HOCl повреждает все виды биополимеров, и ее избыток может приводить к галогенирующему стрессу, сопровождающему хронические воспалительные заболевания, в том числе атеросклероз [13, 34]. Расположение в области димеризации петли 885–890 экранирует ее и, предположительно, будет мешать образованию упомянутых выше белок-белковых комплексов, лишая ЦП ингибирующего действия на миелопероксидазу и пероксидазу эозинофилов. Таким образом, в результате действия избытка ионов меди эффективность реализации части функций ЦП может существенно снижаться.

Рис. 5.

Потенциальные сайты связывания ионов свободной меди: а – контакт в области Met580, б – контакт в области Glu419.

Работа выполнена при финансовой поддержке Совета по грантам Президента РФ (грант № МД-1901.2020.4) в части выделения и очистки ЦП, Министерства науки и высшего образования РФ в рамках Государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части обработки малоугловых данных и при поддержке НИЦ “Курчатовский институт” (Приказ № 1360) в части измерения экспериментальных кривых МУРР и моделирования димера ЦП.