Кристаллография, 2021, T. 66, № 5, стр. 815-820
Супрамолекулярные комплексы тетрапептидов, способные индуцировать конформационные переходы бета-домена альфа-лактальбумина человека
Я. А. Забродская 1, 2, 3, 4, А. В. Швецов 1, 2, 4, Ю. П. Гармай 1, Д. В. Лебедев 1, 4, Р. Даттани 5, В. В. Егоров 1, 4, 6, *
1 Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт” – ПИЯФ
Гатчина, Россия
2 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
Санкт-Петербург, Россия
3 Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России
Санкт-Петербург, Россия
4 Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”
Москва, Россия
5 Европейский центр синхротронного излучения
Гренобль, Франция
6 Институт экспериментальной медицины
Санкт-Петербург, Россия
* E-mail: egorov_vv@pnpi.nrcki.ru
Поступила в редакцию 12.09.2020
После доработки 23.12.2020
Принята к публикации 23.12.2020
Аннотация
При помощи метода малоуглового рентгеновского рассеяния показано, что тетрапептид, являющийся индуктором фибриллогенеза для фрагмента бета-домена альфа-лактальбумина человека, активен в форме супрамолекулярных комплексов. Образование таких комплексов не детектировалось при использовании микроскопии и аналитической гель-фильтрации. Молекулярно-динамическое моделирование поведения ансамбля изучаемых тетрапептидов методом свободной диффузии подтвердило их склонность к образованию олигомеров, наблюдаемую в эксперименте. Полученные данные и методические подходы могут быть применены при разработке новых препаратов пептидной природы, способных к модулированию активности белков путем воздействия на их пространственную структуру.
ВВЕДЕНИЕ
Способность биомакромолекул к самоорганизации играет ключевую роль в функционировании живых систем. Для изучения надмолекулярных комплексов применяется широкий спектр биофизических и биохимических методов, таких как электронная и атомно-силовая микроскопия, хроматография, электрофорез в геле, динамическое светорассеяние. Однако некоторые олигомерные комплексы, существующие только в состоянии динамического равновесия олигомер–мономер в растворе, разрушаются при исследовании, так как взаимодействия между мономерами менее энергетически выгодны, чем взаимодействия между мономером и, например, поверхностью хроматографического сорбента или подложкой для проведения исследования с помощью микроскопии. В то же время динамическое светорассеяние не обладает достаточным разрешением для определения морфологических характеристик изучаемых комплексов.
В последнее время появляется все больше данных о роли коротких пептидов (образовавшихся, например, в результате ограниченного протеолиза белков [1] или при реализации альтернативных механизмов трансляции [2]) в регуляции активности белков, опосредованной воздействием на их пространственную структуру [3]. Индукция конформационных переходов в целевых вирусных белках или маркерных белках опухолей с применением пептидов используется для создания новых препаратов, направленных на борьбу с инфекционными и онкологическими заболеваниями [4–6].
В [7, 8] для изучения процесса индуцированных пептидами конформационных переходов в полипептидах использовался модельный пептид WT (участок бета-домена альфа-лактальбумина человека протяженностью 17 аминокислотных остатков (GYDTQAIVENNESTEYG). Выбор этого пептида в качестве модели обусловлен, в том числе, перспективой его использования в качестве основы для противоопухолевого препарата, специфически воздействующего на клетки опухолей молочной железы [9]. Было показано, что добавление в раствор тетрапептидов, гомологичных по первичной структуре C- или N-концевым участкам пептида WT (пептиды L и R соответственно), приводит к быстрому переходу WT в бета-структурированную форму и индуцирует образование амилоидоподобных фибрилл. Первичные структуры пептидов WT, L и R приведены в табл. 1. Аминокислотная замена остатка глутаминовой кислоты TDYG на аспарагиновую TEYG обусловлена тем, что пептид TEYG оказался крайне гигроскопичным и неустойчивым в растворе.
При индукции фибриллогенеза не наблюдалось значимого уменьшения числа молекул индуктора в растворе и разницы в морфологии фибрилл, образовавшихся в присутствии и в отсутствие индуктора [10]. Была предложена модель, объясняющая способность тетрапептидов индуцировать конформационные переходы [11]. Вкратце при помощи молекулярно-динамического (МД) моделирования было показано, что тетрапептиды способны стабилизировать бета-структурированную, способную к образованию надмолекулярных комплексов, форму пептида WT. При этом в рамках модели после образования олигомеров WT тетрапептиды высвобождаются из комплексов и способны индуцировать фибриллогенез дальше по механизму, сходному с ферментативной реакцией. В то же время предложенная модель не могла объяснить тот факт, что индукторы при добавлении в концентрациях ниже критической (менее 0.5 мг/мл) не вызывали увеличения скорости фибриллогенеза. Данное исследование посвящено уточнению модели индукции фибриллогенеза в описываемой модельной системе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пептиды WT, L и R. Пептиды GYDTQAIVENNESTEYG (WT) и GYDT (L), TDYG (R) были синтезированы в НПФ “Верта”, чистота выше 90%.
Атомно-силовую микроскопию (АСМ) пептидных агрегатов WT проводили на микроскопе Bio-Solver Pro с измерительной головкой Smena-B с использованием полуконтактного режима, зонд NSG03 (NT-MDT, Россия). Образцы растворяли в концентрации 0.7 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7.4, наносили на свежерасщепленную слюду (SPI Supplies), инкубировали в течение 1 мин, а затем промывали большим количеством деионизированной воды MilliQ.
Лазерная корреляционная спектроскопия. Измерения квазиупругого рассеяния света проводили с использованием ЛКС-спектрометра ЛКС-03 (Intox, Россия). Пептиды L и R растворяли в ФСБ в концентрациях 0.1, 0.2, 0.5, 0.7 и 1 мг/мл. Спектральный анализ проводили с использованием программного обеспечения прибора.
Спектрофотометрия. Концентрацию пептидов определяли с использованием спектрофотометра Hitachi U-3310 в 1 см кварцевых кюветах. Спектры обрабатывали с применением программного обеспечения прибора, коэффициент молярной экстинкции (1280 M–1 cм–1) был вычислен в пептидном калькуляторе PepCalc [12].
Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (МУРР). Эксперименты по МУРР проводили на источнике синхротронного излучения ESRF (Гренобль, Франция) на спектрометре ID02 в соответствии с правилами использования [13]. Регистрацию спектров пептидов, растворенных в ФСБ в концентрациях 0.7 мг/мл, проводили с использованием детекторов, расположенных на расстоянии 1.2 и 5 м, в результате диапазон переданных импульсов q составил 0.014–6 нм–1 (q = = $4\pi \sin (\theta ){\text{/}}\lambda $, где 2θ – угол рассеяния, λ – длина волны). Спектры регистрировали при комнатной температуре. Для контроля радиационных повреждений образца в каждой серии измерений было зарегистрировано 50 кривых МУРР с экспозицией 15 мс и интервалом 1 с. При отсутствии систематических изменений во всех спектрах серии полученные результаты усредняли. Обработка данных включала в себя вычитание сигнала от чистого растворителя (ФСБ), зарегистрированного в аналогичных условиях, а затем устранение некогерентного рассеяния с использованием линейного приближения спектров в координатах Iq4vs q4, как описано в [14]. Дальнейшую обработку и аппроксимацию экспериментальных данных проводили с помощью программного обеспечения SasView [15] и Origin2015.
Молекулярное моделирование. Модели пептидов были построены с помощью программы Pymol [16]. В дальнейшем с помощью GROMACS [17] была построена система в виде кубического бокса размером 1003 Å3, содержащая по 32 мономера пептидов TDYG и GYDT, а также атомы Na+ и Cl– в числе, соответствующем 50 мМ концентрации NaCl. Для моделирования взаимодействия тетрапептидов между собой применяли метод МД в режиме свободной диффузии. Для этого использовали следующий протокол.
Подготовленную стартовую конфигурацию помещали в бокс с молекулами воды. Размер бокса составлял 1003 Å3. Для пептидов использовали поле amber14sb [18], для воды – tip3p [19]. Далее следовали этапы минимизации энергии системы и первая стадия уравновешивания. Начальные скорости рассчитывали, исходя из распределения Максвелла для температуры 310 K. Чтобы избежать разрушения системы, на все тяжелые атомы пептидов накладывали дополнительный потенциал в виде чаши, который ограничивал их движение. При расчете использовали термостат и баростат Берендсена [20]. Уравновешивание растворителя проводили в течении 5 нс симуляции с почти неподвижным белком. Последнюю полученную конфигурацию использовали в качестве стартовой на второй стадии уравновешивания, при этом снимали действие потенциалов, ограничивающих движение атомов. Использовали термостат Нозе-Гувера [21–24] и баростат Паринелло-Рамана [25, 26]. Уравновешивание проводили в течение 10 нс. Далее проводили МД-симуляцию в течение 500 нс. Результаты данного этапа моделирования использовали в дальнейшем для анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Наличие критической концентрации индуктора конформационных переходов, ниже которой он не оказывал эффекта на четвертичную структуру полипептида, наблюдаемое при изучении воздействия пептидов L и R на пептид WT, было обнаружено и ранее при изучении низкомолекулярных индукторов конформационных переходов [27]. Тогда было показано, что активность низкомолекулярного индуктора триазавирина проявляется только в виде супрамолекулярных комплексов, образующихся при превышении определенной критической концентрации. Этот эффект был обусловлен необходимостью кооперативности взаимодействия индуктор–полипептид для воздействия на конформацию; кооперативность обусловливалась существованием индуктора в виде нековалентно связанных линейных гомоолигомеров [28]. Вероятно, пептиды L и R в концентрациях, превышающих критическую, существуют в растворе в виде супрамолекулярных комплексов, способных модулировать четвертичную структуру пептида WT. В пользу существования олигомерных форм пептидов R и L свидетельствовало наличие светорассеяния при превышении критических концентраций для пептидов (0.5 мг/мл для L, 0.2 мг/мл для R). Результаты обработки спектров приведены на рис. 1.
Различие в критических концентрациях может быть обусловлено наличием внутримолекулярных взаимодействий в молекулах пептида L (что следует из результатов МД-моделирования). По-видимому, при образовании структур более высокого порядка такие взаимодействия могут препятствовать олигомеризации при более низких концентрациях, характерных для пептида R, образующего преимущественно межмолекулярные связи.
При исследовании пептида R методом гель-фильтрации молекулярная масса олигомеров соответствовала тетрамеру пептида, и более высокомолекулярные формы не детектировались. Исследование надмолекулярных структур тетрапептидов-индукторов методом электронной микроскопии [10] не показало наличия олигомеров пептида R. Результаты АСМ образцов пептидов L и R свидетельствовали об отсутствии упорядоченных структур на подложке и были сравнимы с результатами микроскопии чистого буфера (данные не показаны). В то же время все эти результаты не позволяли объяснить факт наличия критической концентрации индуктора фибриллогенеза.
Результаты МУРР (рис. 2) подтверждают присутствие в растворах обоих пептидов в концентрации выше критической крупных структур. В диапазоне малых амплитуд переданных импульсов (q < 0.3 нм–1) зависимость интенсивности рассеяния I от вектора рассеяния q близка к степенной с показателем степени 2.5. Данные в этом диапазоне могут быть аппроксимированы моделью рассеяния масс-фракталом (D = 2.50 ± 0.02 и D = 2.42 ± 0.10 для пептидов L и R соответственно) ограниченного размера [29], при этом характерные корреляционные длины ξ для агрегатов, образуемых пептидами L и R, оказываются близки между собой (70 ± 5 и около 110 нм соответственно) и находятся в хорошем соответствии с результатами динамического светорассеяния. Для пептида L характерный размер отдельных рассеивающих объектов составлял ∼10–15 нм.
В диапазоне более высоких амплитуд переданного импульса (q = 0.5–1.2 нм–1) интенсивность рассеяния для пептида L в целом следует степенному закону I ∼ q–1, что соответствует линейным структурам, которые могут образовываться за счет взаимодействия между мономерами пептидов, формируя олигомерную цепь. Изолированные линейные олигомеры пептидов, полученные в результате молекулярного моделирования, спектры которых приведены на рис. 2 (врезка), в эксперименте не наблюдаются и, как можно предположить, не являются устойчивыми, ассоциируя в более крупные глобулярные агрегаты.
Отметим, что хроматографический анализ растворов пептидов L и R в концентрациях, превышающих критические, показывал наличие в растворе только тетрамеров указанных пептидов, причем спектрофотометрическое определение концентрации пептидов в растворе после разделения свидетельствовало о сохранении количества пептидов в процессе хроматографии. Таким образом, все детектируемые при помощи динамического светорассеяния и МУРР ассоциаты пептидов диссоциировали в процессе хроматографии на тетрамеры.
Для моделирования олигомеризации пептидов использовали метод МД в режиме свободной диффузии. Данный метод позволяет получить состояния, которые невозможно моделировать с использованием молекулярного докинга, в том числе неустойчивые олигомеры, существующие только в растворе. В каждый бокс для моделирования поместили по 32 молекулы L или R. Несмотря на то что оба пептида в процессе МД-моделирования показали способность к образованию устойчивой трехмерной динамической сетки в растворе за счет взаимодействия друг с другом, анализ вторичной структуры показал различающиеся результаты (рис. 3). Если для L в большей степени характерны структуры мономеров, характеризующиеся как повороты, то в случае R наблюдалось образование структур, соответствующих межмолекулярным β-листам. По всей видимости, способность образовывать различные виды β-структур является основой для образования различных трехмерных сеток пептидов L и R в растворе.
На рис. 4 представлены модели структур 32-мерных пептидов L и R, полученные в результате МД-моделирования в режиме свободной диффузии.
Таким образом, показано, что пептиды L и R способны к образованию супрамолекулярных комплексов в растворе в модели in silico, при этом структуры олигомерных комплексов для этих пептидов существенно различаются.
В [30–32] показано, что некоторые короткие пептиды способны к образованию надмолекулярных структур, в том числе амилоидоподобных фибрилл, в растворе. Тот факт, что короткие пептиды способны образовывать конформационно активные супрамолекулярные комплексы [33] вкупе со способностью коротких пептидов к проникновению через многие клеточные барьеры, открывает вероятность существования новых механизмов регуляции активности белков в норме и при патологии и возможность разработки новых биологически активных веществ пептидной природы. Метод МУРР позволяет определять способность пептидов к образованию подобных неустойчивых комплексов, а в сочетании с методом МД-моделирования создавать их модели. Полученные с помощью комбинации указанных методов модели супрамолекулярных пептидных комплексов могут быть использованы как при изучении механизма действия препаратов пептидной природы, так и при изучении механизмов действия природных супрамолекулярных пептидных комплексов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В активной концентрации пептидные индукторы (тетрапептиды GYDT и TDYG) фибриллогенеза пептида, соответствующего по первичной структуре фрагменту бета-домена альфа-лактальбумина человека (GYDTQAIVENNESTEYG), образуют в растворе олигомеры, не выявляемые при помощи аналитической хроматографии и атомно-силовой микроскопии, но детектируемые при помощи методов динамического рассеяния и МУРР. Результаты МД-моделирования тетрапептидов в растворе согласуются с данными МУРР.
Кривые МУРР получены в ESRF, Гренобль, Франция, эксперимент № LS2508 @ID02. Работа выполнена при поддержке НИЦ “Курчатовский институт” (приказ № 1363 от 25.06.2019 г.).
Список литературы
Mangione P.P., Porcari R., Gillmore J.D. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014. V. 111. № 4. P. 1539. https://doi.org/10.1073/pnas.1317488111
Andrews S.J., Rothnagel J.A. // Nat. Rev. Genet. 2014. V. 15. № 3. P. 193. https://doi.org/10.1038/nrg3520
Wu H. // Cell. 2013. V. 153. № 2. P. 287. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.03.013
Zabrodskaya Y.A., Lebedev D.V., Egorova M.A. et al. // Biophys. Chem. 2018. V. 234. P. 16. https://doi.org/10.1016/j.bpc.2018.01.001
Michiels E., Roose K., Gallardo R. et al. // Nat. Commun. 2020. V. 11. № 1. P. 1. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16721-8
Gallardo R., Ramakers M., De Smet F. et al. // Science. 2016. V. 354. № 6313. P. aah4949. https://doi.org/10.1126/science.aah4949
Egorov V.V., Solovyov K.V., Grudinina N.A. et al. // Protein Pept. Lett. 2007. V. 14. № 5. P. 471. https://doi.org/10.2174/092986607780782858
Егоров В.В., Гармай Ю.П., Соловьев К.В. и др. // Докл. РАН. 2007. Т. 414. № 6. С. 828.
Tuohy V., Jaini R., Johnson J. et al. // Cancers. 2016. V. 8. № 6. P. 56. https://doi.org/10.3390/cancers8060056
Egorov V.V., Lebedev D.V., Shaldzhyan A.A. et al. // Prion. 2014. V. 8. № 5. P. 369. https://doi.org/10.4161/19336896.2014.983745
Кадочников В.В., Егоров В.В., Швецов А.В. и др. // Кристаллография. 2016. V. 61. № 1. P. 107. https://doi.org/10.7868/s0023476116010082
PepCalc.com – Peptide calculator. https://pepcalc.com/
Narayanan T., Sztucki M., Van Vaerenbergh P. et al. // J. Appl. Cryst. 2018. V. 51. № 6. P. 1511. https://doi.org/10.1107/S1600576718012748
Svergun D.I., Koch M.H.J. // Reports Prog. Phys. 2003. V. 66. № 10. P. 1735. https://doi.org/10.1088/0034-4885/66/10/R05
SasView – Small Angle Scattering Analysis. http://www.sasview.org/
LLC Schrödinger. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. 2020. https://pymol.org/2/
Abraham M.J., Murtola T., Schulz R. et al. // SoftwareX. 2015. V. 1–2. P. 19. https://doi.org/10.1016/J.SOFTX.2015.06.001
Maier J.A., Martinez C., Kasavajhala K. et al. // J. Chem. Theory Comput. 2015. V. 11. № 8. P. 3696. https://doi.org/10.1021/acs.jctc.5b00255
Jorgensen W.L., Chandrasekhar J., Madura J.D. et al. // J. Chem. Phys. 1983. V. 79. № 2. P. 926. https://doi.org/10.1063/1.445869
Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., van Gunsteren W.F. et al. // J. Chem. Phys. 1984. V. 81. № 8. P. 3684. https://doi.org/10.1063/1.448118
Nosé S. // J. Chem. Phys. 1984. V. 81. № 1. P. 511. https://doi.org/10.1063/1.447334
Hoover W.G. // Phys. Rev. A. 1985. V. 31. № 3. P. 1695. https://doi.org/10.1103/PhysRevA.31.1695
Martyna G.J., Klein M.L., Tuckerman M. // J. Chem. Phys. 1992. V. 97. № 4. P. 2635. https://doi.org/10.1063/1.463940
Martyna G.J., Tuckerman M.E., Tobias D.J., Klein M.L. // Mol. Phys. 1996. V. 87. № 5. P. 1117. https://doi.org/10.1080/00268979600100761
Parrinello M., Rahman A. // J. Appl. Phys. 1981. V. 52. № 12. P. 7182. https://doi.org/10.1063/1.328693
Nosé S., Klein M.L. // Mol. Phys. 1983. V. 50. № 5. P. 1055. https://doi.org/10.1080/00268978300102851
Shvetsov A.V., Zabrodskaya Y.A., Nekrasov P.A., Egorov V.V. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2018. V. 36. № 10. P. 2694. https://doi.org/10.1080/07391102.2017.1367329
Zabrodskaya Y.A., Shvetsov A.V., Tsvetkov V.B., Egorov V.V. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2019. V. 37. № 12. P. 3041. https://doi.org/10.1080/07391102.2018.1507837
Sorensen C.M., Cai J., Lu N. // Langmuir. 1992. V. 8. № 8. P. 2064. https://doi.org/10.1021/la00044a029
Gazit E. // Prion. 2007. V. 1. № 1. P. 32. https://doi.org/10.4161/pri.1.1.4095
Reches M., Porat Y., Gazit E. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 38. P. 35475. https://doi.org/10.1074/jbc.M206039200
Haspel N., Zanuy D., Ma B. et al. // J. Mol. Biol. 2005. V. 345. № 5. P. 1213. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2004.11.002
Zhou J., Du X., Xu B. // Prion. 2015. V. 9. № 2. P. 110. https://doi.org/10.1080/19336896.2015.1022021
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Кристаллография