Кристаллография, 2022, T. 67, № 4, стр. 623-627

ВВЕДЕНИЕ

Флавивирусы относятся к семейству Flaviviradae и могут быть разделены на три группы по типу переносчика инфекции: клещевые, комариные и флавивирусы с неизвестным переносчиком [1]. Известные патогены, поражающие человека, такие как вирус Зика, вирус Денге, вирус Западного Нила, переносятся комарами. Вирус клещевого энцефалита и вирус шотландского энцефалита овец относятся к флавивирусам, переносимым клещами. Они могут вызывать энцефалиты или менингоэнцефалиты центральной нервной системы. Вирус шотландского энцефаломиелита овец (ВШЭО) в основном поражает небольших животных, таких как овцы и красные тетерева. Изредка может поразить человека. Более широко распространенный вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), напротив, в основном поражает людей, хотя может поражать и грызунов. Вирус клещевого энцефалита распространен на евразийском континенте, в год регистрируется 10 000–14 000 случаев [2, 3]. Несмотря на наличие вакцин, уровень заражения ВКЭ остается довольно высоким из-за низкого процента вакцинации. Специфических лекарств от ВКЭ не существует. Одним из современных способов разработки лекарств является так называемый “драг дизайн”, который основан на знании пространственной структуры мишени [4, 5]. В случае ВКЭ мишенью является оболочечный белок Е. Этот белок образует наружную поверхность вириона, обеспечивает стабильность вирусной частицы и определяет первые этапы инфекции – связывание с клеточными рецепторами, проникновение вируса в клетку, раздевание вирусной РНК [2].

Существуют три основных подтипа ВКЭ: центрально-европейский, сибирский и дальневосточный. На территории России распространены сибирский и дальневосточный подтипы. Каждый подтип содержит множество штаммов, имеющих небольшие различия в аминокислотной последовательности белков.

Целью работы было получить кристаллы эктодомена белка Е вируса клещевого энцефалита дальневосточного подтипа штамма Софьин, аминокислотная последовательность которого представлена на рис. 1, для дальнейшего анализа структуры апоформы белка, а также для детального структурного исследования взаимодействия белка с прототипами ингибиторов.

Рис. 1.

Аминокислотная последовательность (участок 1–395) эктодомена белка Е вируса клещевого энцефалита, дальневосточный подтип, штамм Софьин (код в базе UniProt P07720).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение, очистка эктодомена белка Е. Штамм-продуцент рекомбинантного эктодомена белка E получен путем трансформации клеток штамма E. coli BL21(DE3) RIPL рекомбинантной плазмидой pET22. Белок выделяли из телец включения посредством рефолдинга, используя методику, приведенную в [6]. Супернатант концентрировали на кассетах VIVAFLOV 200, PES-мембрана, 10 кДа (Sartorius stedim LAB Ltd), затем на центрифужном концентраторе, 10 кДа (Millipore, Burlington, MA, США), и отфильтровали через фильтр с размером пор 0.22 мкм (PES-мембрана Millipore Millex-GP). Целевой белок очищали методом гель-фильтрации с использованием колонки HiLoad 16/600 Superdex 200prep grade (GE Healthcare, Швеция).

Кристаллизация эктодомена белка Е(sE). Подбор условий кристаллизации мономера и димера эктодомена белка E проводили методом диффузии в парах в варианте сидячей капли. Капли получали смешиванием 0.7 мкл раствора белка концентрации 5 мг/мл с 0.7 мкл резервуарного раствора. Объем резервуарного раствора составлял 200 мкл. Поиск первоначальных условий кристаллизации белка проводили с использованием планшетов Intelli-Plate 48-3 (Hampton Research). Поиск условий кристаллизации был проведен с использованием коммерческих скринингов Hampton Research при температуре 20°С. Было выявлено, что ограненные монокристаллы вырастают в кислых буферных системах. Определены начальные условия кристаллизации: 2.0 М сульфата аммония в 0.1 М цитратном буфере, pH 4.0. В этих условиях получены мелкие кристаллы (рис. 2а). Найденные условия оптимизировали путем варьирования концентрации сульфата аммония, рН буфера и использования добавок: полиэтиленгликоля, глицерина и 2-метил-2,4-пентандиола (МПД), пока не были найдены условия, в которых вырастали монокристаллы размером не менее 0.1 мм.

Рис. 2.

Кристаллы эктодомена белка Е вируса клещевого энцефалита, дальневосточный подтип, штамм Софьин: при начальных условиях кристаллизации (а); при условиях после оптимизации (б, в).

Cбор дифракционных данных и предварительный рентгеноструктурный анализ. Кристаллы для получения набора дифракционных данных переносили в криораствор, используя криопетлю (Hampton Research), на 15 с. Наряду с компонентами кристаллизационного раствора криораствор содержал дополнительно 20% глицерина. Затем кристаллы в петле помещали в металлическую кассету, совместимую с автоматической системой смены образцов и находящуюся в жидком азоте. Сбор дифракционных данных проводили при 100 К на станции синхротронного излучения ID30B синхротрона ESRF (Гренобль, Франция) c использованием детектора PILATUS3 6M (Dectris). Данные обрабатывали с использованием программ XDS и XSCALE [7]. Статистика дифракционных наборов приведена в табл. 1, набор собран до разрешения 3.2 Å. Структура решена методом молекулярного замещения по программе MOLREP [8] с использованием структуры эктодомена белка Е ВШЭО (Louping ill virus), уточненной до разрешения 3.6 Å (pdb код 6J5C) [1], в качестве стартовой модели. Полученная модель была уточнена до промежуточного R-фактора 22.6% по программе Refmac [9]. Структуру анализировали с использованием программ Coot [10], PyMol [11] и комплекса программ ССР4 [12].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначальный поиск условий кристаллизации проведен методом диффузии паров растворителя в сидячей капле с использованием коммерческих кристаллизационных наборов фирмы Hampton Research. Найденные условия оптимизировали для получения кристаллов размером 0.1–0.15 мм, которые удовлетворяют требованиям, предъявляемым к кристаллам, пригодным для рентгеноструктурного анализа (рис. 2). Для этого концентрацию сульфата аммония понизили на 0.2–0.4 М по сравнению с исходной, изменили рН и добавили МПД, что позволило сократить количество кристаллов, образующихся в капле, и получить монокристаллы большего размера. Поскольку белок не обладает высокой растворимостью, концентрацию белка не меняли. Наилучшие кристаллы выращены в 1.6–1.8 М сульфате аммония с 2%-ным МПД в 0.1 М цитратном буфере, pH 4.5. Кристаллы вырастали до 0.1–0.15 мм в течение двух–трех дней (рис. 2б).

Дифракционные наборы от замороженных кристаллов были собраны при 100 К на источнике синхротронного излучения ESRF. Обработка данных показала, что наивысшее пространственное разрешение составляет 3.2 Å. Кристаллы принадлежат кубической пр. гр. Р4₁21 с параметрами элементарной ячейки a = b = c = 165.061 Å, α = = β = γ = 90°. Независимая часть элементарной ячейки кристалла содержит одну молекулу. Ход полипептидной цепи сходен с ходом полипептидной цепи в структуре эктодомена белка Е ВКЭ центрально-европейского подтипа, штамм Ньюдорфф (код pdb 1SVB) [13], а также эктодомена белка Е ВШЭО (pdb код 6J5C) (рис. 3). Причем конформация эктодомена белка Е ВШЭО, кристаллы для исследования структуры которого получены в похожих кристаллизационных условиях, имеет меньше различий с конформацией изучаемой структуры, несмотря на меньшую гомологию [1], особенно в области домена III. При наложении молекулы полученной структуры по Сα-атомам на молекулу структуры 6J5C среднеквадратичное отклонение (rmsd) составляет 0.546 Å, а при наложении на молекулу структуры 1SVB – 1.519 Å. Отметим, что структура 1SVB получена из эктодомена белка Е ВКЭ западного подтипа (штамм Ньюдорфф), “срезанного” с поверхности вирусных частиц трипсином. В данной работе получена структура рекомбинантного белка, экспрессированного в бактериальной системе экспрессии. Тем не менее схожесть конформаций рекомбинантного белка и природного показывает, что растворимая часть белка Е, экспрессированная в E. coli, подходит для детального структурного исследования взаимодействия белка с ингибиторами. В настоящее время структура уточняется.

Рис. 3.

Совмещение структуры sE, полученной в настоящей работе, со структурами 6J5C (а) и 1SVB (б). Структуры 6J5C и 1SVB показаны темным цветом.

Работа показала, что, несмотря на выбор бактериальной системы экспрессии для получения рекомбинантного белка E, конформация молекулы близка к наблюдаемой в частице вируса, поэтому кристаллы такого белка могут быть использованы для рентгеноструктурного анализа комплексов с прототипами ингибиторов белка Е. Однако, поскольку из-за низкой растворимости ингибиторов наиболее часто используемый метод получения кристаллов с целью использования их для исследования кристаллических структур таких комплексов – настаивание, при котором, как правило, ухудшается пространственное разрешение кристаллов, найденные условия кристаллизации не являются оптимальными. Разрешение, при котором можно провести достоверный анализ деталей связывания ингибиторов с белком, составляет не менее 2.5 Å [5]. Разрешение кристаллов в процессе настаивания, вероятно, понизится, поэтому полученные кристаллы с разрешением 3.2 Å не дадут возможности получить кристаллические комплексы, обеспечивающие требуемую высокую детальность.

В связи с этим проводится поиск условий кристаллизации белка sE, позволяющих получить cтруктуру с разрешением около 2 Å.

Авторы выражают благодарность ESRF за обеспечение эксперимента по сбору дифракционных данных на синхротроне.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-02-40026), в рамках темплана НИЦ “Курчатовский институт” и при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН.