Кристаллография, 2023, T. 68, № 6, стр. 959-970

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что SARS-CoV-2 [1] – это вирус, вызывающий чрезвычайно опасное заболевание COVID-19 [2], которое может протекать как в легкой форме [3], так и бессимптомно, а также в крайне тяжелой форме, приводящей к смерти [4]. Существуют подходы к лечению этого заболевания, в том числе ряд вакцин различного типа действия. Однако высокая мутагенность вируса приводит к тому, что старые вакцины становятся менее эффективными или вообще перестают действовать. Таким образом, существует необходимость быстро реагировать на появление новых штаммов SARS-CoV-2.

Накопление большого объема генетической информации в единой базе и развитие биоинформатических инструментов позволяют рассчитывать целевую модель вакцины с учетом прогноза иммунного ответа хозяина и генетической информации патогена. Создание вакцины на основе технологии рекомбинантной ДНК позволяет сократить срок создания вакцины.

НИЦ “Курчатовский институт” создает национальную базу генетической информации, которая включает в себя средства депонирования, поиска по метаданным и гомологического поиска генетической информации, а также средства для управления биоинформатическими платформами Galaxy и NextFlow. Это позволяет работать с существующими и создавать собственные биоинформатические инструменты. В [5, 6] предложен иммуноинформатический подход, который позволяет конструировать основанные на эпитопах белковые вакцины.

В настоящей работе применили модификацию этого подхода для SARS-CoV-2. Одним из последних вариантов коронавируса, вызывающего COVID-19, является так называемый “Омикрон” [7, 8]. Выявлены пять его подвариантов [9]. Известно, что некоторые подварианты “Омикрона” могут заражать ранее вакцинированных людей [10]. Таким образом, создание эффективной вакцины против данного варианта коронавируса является актуальной задачей.

Выбранный для исследования так называемый спайк-протеин варианта “Омикрон” (PDB ID: 7WK3) служит мишенью для поиска вакцин [11]. Трехмерная структура белка приведена на рис. 1, его топология относительно мембраны представлена на рис. 2. На основе смоделированной трехмерной структуры и первичной последовательности исследуемого белка был проведен поиск В- и Т-клеточных эпитопов. Первичная последовательность взята из Национальной базы генетической информации (https://nbgi.ru/).

Рис. 1.

Трехмерная структура белка мишени.

Рис. 2.

Топологии белка относительно мембраны. Синим цветом выделен участок снаружи мембраны, красным – трансмембранный участок, розовым – участок внутри мембраны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Т-клеточные эпитопы найдены с помощью программы NetCTL [12]. Сервер позволяет предсказывать эпитопы CTL, ограниченные 12 супертипами главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I. Связывание пептидов с MHC класса I и протеасомное расщепление были предсказаны с помощью искусственных нейронных сетей [12–14].

С использованием NetCTL получен прогноз Т-клеточных эпитопов (выделены оранжевым цветом на рис. 3). Настройки, с которыми проводился прогноз, следующие:

Рис. 3.

Т-клеточные эпитопы (показаны оранжевым цветом).

– weight of tap – 0.05;

– weight of MHC – 1;

– weight of Cleavage – 0.15;

– порог идентификации эпитопов – 0.75.

B-клеточные эпитопы предсказаны с помощью инструмента прогнозирования ElliPro (http://tools.iedb.org/ellipro/) сервера IEDB [15, 16]. При работе с этим методом используются доступность растворителя и гибкость для прогнозирования эпитопов. Инструмент прогнозирования ElliPro выбирает антигенные остатки из известной трехмерной структуры белка. Нижняя оценка и максимальное расстояние были откалиброваны с использованием значений по умолчанию с minimum score – 0.5 Å и maximum distance – 6 Å соответственно. 3D-модель белка S1 использовали для предсказания как конформационных (прерывистых), так и линейных В-клеточных эпитопов.

Для анализа аллергенности найденных эпитопов использовали программу AllerTOP [17], для анализа токсичности – ToxinPred [18]. Для оценки перспективности данного белка как антигена была применена программа VaxiJen [19].

Рис. 4.

Линейные В-эпитопы (показаны оранжевым цветом).

Рис. 5.

Прерывистые В-эпитопы (показаны оранжевым цветом).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Спайковый белок вируса SARS-CoV-2 (СБ CoV) является главной антигенной детерминантой вируса и поэтому был выбран в качестве объекта исследования [11]. Данный белок подвержен мутациям в новых вариантах вируса SARS-CoV-2, что приводит к тому, что разработанные ранее вакцины оказываются неэффективными [20]. Для поиска антигенных детерминант спайкового белка варианта Омикрон вируса SARS-CoV-2 использовали подход, основанный на алгоритмах глубокого машинного обучения [12, 16–18]. Учитывая, что СБ CoV является трансмембранным белком, была определена его топология относительно цитоплазматической мембраны.

Для этого использовали основанный на алгоритмах глубокого машинного обучения веб-сервис DeepTMHMM [21] proteins using deep neural networks. Показано, что аминокислотные остатки 1214–1273 относятся к трансмембранному и внутриклеточному фрагменту белка, что затрудняет их использование для конструирования пептидной вакцины.

Далее провели поиск эпитопов. Выявлены как Т-, так и В-клеточные эпитопы СБ CoV (табл. 1–3). Всего выявлено 37 Т-клеточных эпитопов высокоаффинных лигандов главного комплекса гистосовместимости первого типа (MHC-1). Из них 35 находятся в надмембранной части. Каждый из найденных пептидов состоит из девяти аминокислот, что характерно для лигандов MHC-1. В табл. 1 Т-клеточные эпитопы перечислены в порядке убывания их аффинности к MHC-1. Наиболее аффинные и, следовательно, более многообещающие с точки зрения иммуногенности отличаются от менее аффинных в 4–7 раз. Отметим, что согласно [12] использованный метод позволяет предсказать, является ли пептид высокоаффинным лигандом MHC-1 с вероятностью 95%. В-клеточные эпитопы можно разделить на два типа в зависимости от пространственной структуры эпитопов: непрерывные (линейные) и прерывистые (конформационные) эпитопы [15]. Список линейных В-клеточных эпитопов приведен в табл. 2. Всего найдено 20 линейных В-клеточных эпитопов, все они относятся к надмембранной части СБ CoV. Наиболее иммуногенные из них представляют собой достаточно длинные пептиды (до 97 аминокислотных остатков). Конформационных эпитопов найдено 22 (табл. 3), из них 20 находятся в надмембранном фрагменте белка.

Оценка аллергенности найденных пептидов с использованием AllerTOP [17] показала, что ни один из них не является аллергеном.

Токсичность найденных пептидов оценивали с использованием ToxinPred [18]. Выявлено, что два Т-эпитопа и два конформационных В-эпитопа, вероятно, являются токсинами (табл. 4–6).

Отметим, что оба конформационных В-эпитопа и один из Т-эпитопов относятся к трансмембранному и внутриклеточному фрагментам белка. Алгоритмы, использованные для предсказания токсичности и аллергенности, разработаны с применением глубокого машинного обучения. Для алгоритма предсказания токсичности использовали три выборки: 8233 токсичных и 8233 нетоксичных пептида, 1924 токсичных и 1924 нетоксичных пептида, 1924 токсичных и 19240 нетоксичных пептидов. Выборки разделяли на тестовую и обучающую в соотношении 80:20 [22 ] . Такая модель позволила достичь высокой степени достоверности результата [22 ] . Модель для предсказания аллергенности имела обучающую выборку из 2427 аллергенных и столько же неаллергенных пептидов, что позволило получить достоверность предсказания выше 90% [17].

Полученные результаты позволят как сконструировать вакцину к данному варианту SARS-CoV-2, так и использовать предложенный подход в случае необходимости разработки вакцин к новым вариантам SARS-CoV-2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предсказаны B- и Т-клеточные эпитопы спайкового белка SARS-CoV-2. Проведена оценка их иммуногенности, аллергенности и токсичности. Показано, что они не являются аллергенами, большинство из них не являются токсинами. Таким образом, большинство найденных эпитопов могут быть использованы при конструировании прототипа пептидной вакцины против SARS-CoV-2.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках Федеральной научно-технической программы развития синхротронных и нейтронных исследований и исследовательской инфраструктуры на 2019–2027 гг. (Соглашение № 075-15-2021-1355 (12 октября 2021 г.)