Микробиология, 2019, T. 88, № 1, стр. 123-126

Традиционным способом консервирования угольных шахт после выработки пластов является их затопление. Это наиболее экономичный способ сохранения физической целостности всех подземных конструкций. Затопление существенно меняет физико-химические параметры экосистемы за счет создания анаэробных условий. Микробные консорциумы, формирующиеся в подземных горизонтах затопленных шахт, изучены недостаточно. Целью работы являлся молекулярный анализ микробного сообщества воды затопленной угольной шахты в Кузбассе.

Отбор образцов проводили из дренажной скважины, пробуренной в 1998 г. для контроля уровня воды в закрытой в 1997 г. и в настоящее время затопленной шахте “Северная”, расположенной в непосредственней близости от г. Кемерово, Российская Федерация (45 м вниз по течению от моста через реку Томь). Вода из шахты поступает самоизливом со средней скоростью 166‒170 м³/ч через скважину глубиной 260 м. Артезианский характер скважины исключает возможность загрязнения проб воды микроорганизмами, обитающими в поверхностных горизонтах. Глубина подземных горизонтов шахты, разрабатывавшей Кемеровский, Волковский и Владимировский пласты Балахонской свиты, составляла около 360 м. Проба воды из скважины была обозначена как Ku5. Вода, отобранная непосредственно у устья скважины в июле 2017 г., имела температуру 12.1°С и нейтральный pH (табл. 1). Отрицательный окислительно-восстановительный потенциал (‒174 mV) указывает на анаэробные условия. Вода содержит 22.5 мг/л сульфата и растворенный сероводород (табл. 1). В отличие от дренажных вод шахт по добыче металлов (Kaksonen et al., 2008; Кадников и соавт., 2016), содержание растворенного железа и других металлов невысоко (табл. 1), что свидетельствует об отсутствии активных окислительных процессов.

Для сбора биомассы микроорганизмов 25 л воды пропускали через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Фильтры гомогенизировали, растирая с жидким азотом, препарат метагеномной ДНК выделяли методом, основанным на лизисе клеток с последующей обработкой детергентом СТАВ (Wilson, 1987). Всего было выделено около 0.5 мкг ДНК. Для ПЦР-амплификации фрагмента гена 16S рРНК, включающего участки V3–V6, использовали “универсальные” праймеры U341F (5'-CCT ACG GGR SGC AGC AG-3') и PRK806R (5'-GGA CTA CYV GGG TAT CTA AT-3'). ПЦР-фрагменты генов 16S рРНК секвенировали на геномном анализаторе GS FLX (“Roche”, Швейцария) по протоколу Titanium. Для последующего анализа отбирали чтения, содержащие праймер U341F, и обрезали их до длины 250 нт. Последовательности низкого качества, а также встречающиеся только один раз (синглтоны) удаляли с помощью Usearch (Edgar, 2010). Кластеризацию в оперативные таксономические единицы (OTU) и удаление химерных последовательностей проводили с помощью Usearch. OTU определяли на уровне 97% идентичности последовательностей (всего 12 155 чтений). Таксономическую идентификацию OTU проводили в результате их сравнения с базой данных 16S рРНК Silva. Также для классификации OTU использовали RDP Classifier (Cole et al., 2009) и поиск близких последовательностей в GenBank по протоколу BLASTN. При обнаружении последовательности, имеющей более 95% сходства с геном 16S рРНК описанного микроорганизма, OTU относили к соответствующему роду. Всего было классифицировано 271 OTU, к которым относились 11 563 последовательностей генов 16S рРНК.

К бактериям было отнесено 74% всех классифицированных последовательностей генов 16S рРНК, остальные представляли археи (табл. 2). Большинство бактерий составляли протеобактерии классов гамма (39.12% от общего числа последовательностей генов 16S рРНК) и эпсилон (18.65%), филогенетически близкие к известным организмам. Среди гаммапротеобактерий были обнаружены представители родов Thiovirga (18.52%), Thiothrix (9.52%) и Thiomicrorhabdus (2.25%). Культивируемые представители родов Thiovirga и Thiomicrorhabdus являются хемолитоавтотрофами, аэробно окисляющими восстановленные соединения серы (Ito et al., 2005; Boden et al., 2017), а Thiomicrorhabdus hydrogeniphila – также и водород (Boden et al., 2017). Окислять восстановленные соединения серы также способны и бактерии рода Thiothrix, часто встречающиеся в виде нитчатых биопленок в проточной воде, содержащей растворенный сульфид (Larkin, Strohl, 1983). Эти бактерии растут в аэробных или микроаэробных условиях и могут быть как автотрофами, так и хемоорганотрофами (Howarth et al., 1999). Помимо Thiovirga, к семейству Halothiobacillaceae автотрофных сероокисляющих бактерий (Boden, 2017) было отнесено еще 7.84% последовательностей генов 16S рРНК, не классифицированных на уровне рода. Вторая основная группа бактерий, бетапротеобактерии, были представлены родами Sulfurovum (11.09%) и Sulfuricurvum (6.33%). Культивируемые представители этих родов являются хемолитоавтотрофами, окисляющими восстановленные соединения серы, используя в качестве акцептора электронов кислород или нитрат (Inagaki et al., 2004; Kodama et al., 2004). Окислять восстановленные соединения серы, возможно, также могут и обнаруженные представители некультивируемого филума Omnitrophica (ОР3), составляющие 3.92% сообщества. Описанный на геномном уровне представитель этого филума “Candidatus Omnitrophus magneticus” SKK-01 является магнетотактической бактерией и, вероятно, может окислять серу в анаэробных условиях, используя в качестве акцептора электронов железо (Kolinko et al., 2012). Присутствие в воде организмов, способных к окислению восстановленных соединений серы с использованием альтернативных кислороду акцепторов электронов, согласуется с анаэробными условиями экосистемы.

Почти все обнаруженные археи представляли некультивируемые линии, которые удалось классифицировать только на уровне таксонов высокого уровня. Большинство архей (14.48% всех последовательностей) представляли недавно описанный суперфилум DPANN (Rinke et al., 2013; Castelle et al., 2015). Археи этой группы имеют небольшие размеры клеток и генома, лишены многих биосинтетических путей и рассматриваются как облигатные паразиты или симбионты (Castelle et al., 2015). Около 3.23% всех последовательностей генов 16S рРНК были отнесены к филуму Euryarchaeota. Среди эуриархей были обнаружены органотрофы группы Marine Benthic Group D (0.7%), метилотрофные метаногены порядка Methanomassiliicoccales (0.59%) (Paul et al., 2012) и “Candidatus Methanoperedens” (0.86%), ‒ метанотрофные археи группы ANME-2d, анаэробно окисляющие метан и восстанавливающие нитрат или Fe(III) (Haroon et al., 2013; Cai et al., 2018).

Несмотря на значительную долю некультивируемых микроорганизмов с неизвестным метаболизмом, полученные результаты позволяют сделать ряд предположений о функционировании исследуемого микробного сообщества. Присутствие в качестве доминирующих групп хемолитоавтотрофных сероокисляющих бактерий указывает на то, что именно этот процесс обеспечивает продукцию органического вещества. Необходимый кислород, возможно, поступает в подземный водоносный горизонт с фильтрующимися через горные породы поверхностными водами. В локальных анаэробных микронишах могут проходить процессы метаногенеза и анаэробного окисления метана.

Остается загадкой источник восстановленных соединений серы, в частности сероводорода, в воде затопленной угольной шахты. В литературе нет свидетельств о возможном геологическом источнике сульфида в углях этой свиты. Высокое содержание сероводорода в воде может быть косвенным свидетельством процессов микробной сульфатредукции. Однако низкое содержание железа в воде свидетельствует об отсутствии развитых процессов окисления пирита и, следовательно, об отсутствии постоянного источника сульфата в воде. В то же время, в пробе воды мы не обнаружили организмы с известной способностью к диссимиляционному восстановлению сульфата. Решение этого вопроса требует дальнейших исследований, прежде всего по определению изотопного состава сульфатов и сероводорода.

Интересно, что наряду с сероокисляющими микроорганизмами значительную долю микробного сообщества составляют бактерии и археи, предположительно являющиеся паразитами или симбионтами других микроорганизмов (Brown et al. 2015; Castelle et al., 2015), ‒ бактерии группы Candidate phyla radiation, доля которых составляет 3.22%, и археи супефилума DPANN (14.48%). Возможно, именно они составляют гетеротрофную часть сообщества, потребляющую органику, которая могла бы ингибировать развитие хемолитоавтотрофов.

Дальнейшее изучение этого микробного сообщества с использованием метагеномных подходов, культивирования и измерения скорости микробных процессов позволит лучше понять его состав и функциональную роль отдельных групп входящих в него микроорганизмов.

Работы по молекулярному анализу микробного сообщества выполнены с использованием научного оборудования ЦКП “Биоинженерия” и поддержаны Российским научным фондом (грант № 14-14-01016). Работы по отбору проб, определению физико-химических параметров воды и элементному анализу поддержаны РФФИ (грант № 18-34-00472).