Микробиология, 2019, T. 88, № 1, стр. 3-18

ОПТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ

Традиционные методы оптической микроскопии являются в основном качественными и субъективными. Во второй половине ХХ века оптическая микроскопия, благодаря применению лазеров, высокочувствительных детекторов света, цифровой фотографии и компьютерной технике трансформировалась в методологию, обеспечивающую объективные количественные исследования пространственно-временных и физико-химических характеристик объектов в масштабах единичных клеток. Особую роль в формировании этой методологии сыграли компьютерные методы обработки и анализа цифровых изображений. Они позволили не только упростить, ускорить и автоматизировать многие уже имеющиеся количественные методы, но и обеспечили получение ранее недоступной количественной информации. Это спектральные свойства и их пространственное распределение; размер и форма индивидуальных компонентов сложной геометрии, их взаимное расположение; интенсивность и спектральные свойства свечения (например, флуоресценции); динамика процессов в широком интервале времен (Puchkov, 2016a). Проиллюстрируем широкий спектр возможностей этой методологии.

Так, например, на основе компьютерного анализа изображений разработан программный комплекс для характеристики морфотипов бактерий в микробных сообществах по данным фазовоконтрастной микроскопии CMEIAS (Center for Microbial Ecology Image Analysis System) (Liu et al., 2001). Этот комплекс позволяет классифицировать клетки по одиннадцати доминирующим морфотипам бактерий. С помощью CMEIAS исследована динамика микробных популяций в анаэробном биореакторе (Liu et al., 2001) и в природных биопленках (Dazzo, Niccum, 2015; Dazzo et al., 2017). Его также успешно применяли для изучения межклеточной сигнализации в микробных популяциях (Dazzo, 2012) (о межклеточной сигнализации у микроорганизмов см. обзор Пучков, 2016).

Морфометрия с помощью компьютерного анализа данных микроскопии была использована для оценки времени первого деления единичных клеток бактерий Escherichia coli, Listeria monocytogenes и Pseudomonas aeruginosa, растущих на плотной среде (Niven et al., 2006). Разработанный подход был автоматизирован, что позволило проводить исследования на популяционном уровне и изучать распределение клеток по длительности лаг-фазы.

Интересные методические возможности открывает оригинальное микропроточное устройство, которое позволяет с помощью микроскопии, сопряженной с компьютерным анализом изображений, исследовать динамику деления отдельных клеток E. coli и связь этого процесса с их размерами. С помощью этого устройства был проведен анализ скоростей деления и размеров клеток нескольких сотен поколений, происходящих от одной “материнской” клетки. Было показано, что средняя скорость деления клеток сохраняется на протяжении сотен поколений. Вместе с тем существует “флуктуационная” разница в продолжительности клеточного цикла каждой пары “материнской” и “дочерней” клеток. На основании полученных данных предполагается, что каждая клетка бактерий E. coli имеет устойчивый механизм развития (размножения), и утрата жизнеспособности является не результатом “стохастического” старения, а накопления повреждений (Wang et al., 2010a). С использованием такого же устройства, а также мутантного по RecA белку штамма E. coli исследована природа пороговой зависимости увеличения средней длины клеток от скорости роста. Установлено, что при увеличении скорости роста выше определенной величины средняя длина клеток возрастает в результате стохастического подавления деления у части популяции, что, по крайней мере, частично может быть связано ограничением поступления RecA в нуклеоид (Gangan, Athale, 2017).

Особой проблемой является “извлечение” морфометрических характеристик индивидуальных бактериальных клеток из больших массивов данных микроскопии, полученных при видеорегистрации развития бактериальных популяций. Для решения этой задачи разработан программный комплекс BaSCA (Bacterial image analysis driven Single Cell Analytics) (Balomenos et al., 2017). По мнению авторов, комплекс может быть использован для решения задач системной биологии на уровне бактериальных популяций.

Два алгоритма компьютерного анализа микроскопических изображений были созданы для морфометрических исследований единичных клеток почкующихся дрожжей. Первый был использован в роботизированном методе автоматической дифференциации морфотипов штаммов Saccharomyces cerevisiae с делетированными генами (Liu et al., 2011). Было показано, что метод позволяет статистически достоверно различать исследуемые штаммы по морфологическим признакам, в том числе на разных фазах роста. Второй алгоритм был разработан для выявления фазы клеточного цикла путем автоматического “извлечения” из микроскопического изображения геометрических характеристик клеток в целом и почки в частности (Yu et al., 2011).

Благодаря использованию компьютерного анализа изображений произошло значительное усовершенствование флуоресцентной микроскопии. Практически весь обширный набор исследовательских “инструментов”, основанных на явлении флуоресценции (Lakowicz, 2006), теперь стал применим на уровне единичных клеток.

Так, прежде всего, оказалось возможным сделать более объективными и менее трудоемкими некоторые традиционные количественные методы с использованием окраски микроорганизмов флуоресцентными красителями. Один из примеров ‒ компьютерная программа автоматического учета числа активно дышащих бактерий по данным флуоресцентной микроскопии в образцах речной воды (Ogawa et al., 2003). Та же программа в усовершенствованном виде была использована для выявления, идентификации и оценки дыхательной активности бактерий E. coli O157:H7 в молоке (Ogawa et al., 2005). Другой пример ‒ автоматический учет доли поврежденных клеток S. cerevisiae после двойного витального окрашивания с применением программы ImageJ (National Institutes of Health, США; http://rsb.info.nih.gov/ij). В сухих препаратах дрожжей этот показатель коррелировал с жизнеспособностью клеток (Puchkov, 2014). Аналогичный подход с использованием программы ImageJ был разработан для оценки жизнеспособности цианобактерий (Schulze et al., 2011).

Ведутся работы по внедрению информационной технологии глубинного анализа данных (data mining) (Han et al., 2011) для изучения взаимосвязи морфологических признаков окрашенных флуоресцентными красителями клеток дрожжей S. cerevisiae с их функциональными свойствами (Ohtani et al., 2004). С этой целью сформирована база морфологических данных S. cerevisiae (S. cerevisiae Morphological Database, SCMD) (Saito et al., 2004) и создана специальная программа для фенотипирования мутантов дрожжей (Ohya et al., 2005). Глубинный анализ данных позволил, в частности, установить, что делеция почти половины генов у S. cerevisiae, не существенных для роста, влияет на некоторые морфологические признаки. Изучается возможность использования данного подхода при поиске антифунгальных агентов (Gebre et al., 2015), а также для работы с дрожжами Schizosaccharomycetes (Negishi et al., 2009).

Компьютерный анализ изображений позволяет измерять параметры флуоресценции на субклеточном уровне. Для сравнительно крупных объектов, таких как дрожжи, это можно осуществлять с помощью стандартной эпифлуоресцентной микроскопии широкого поля (Puchkov, 2016) или конфокальной микроскопии (Day et al., 2016). Так, с помощью субклеточной микрофлуориметрии была определена вязкость внутри вакуолей S. cerevisiae (подробнее о внутриклеточной вязкости см. обзор Пучков, 2014) и разработан подход, получивший название “псевдоспектральный анализ”, для изучения на примере доксорубицина и клеток S. cerevisiae в качестве модели внутриклеточной локализации противораковых препаратов в клетках животных и человека (Puch-kov, 2016).

Применение технологии мечения флуоресцирующими белками (ФБ), которые являются производными и аналогами зеленого флуоресцирующего белка (Tsien, 1998), привело к значительному прогрессу в изучении внутриклеточной структуры и функций живых клеток, включая микробные (Snapp, 2005).

В исследованиях, связанных с локализацией определенных белков, меченных ФБ, у разных штаммов или у одних и тех же штаммов дрожжей при разных условиях культивирования необходима автоматизация количественного сравнения больших массивов данных. С этой целью разработана специальная программа компьютерного анализа изображений (Chen et al., 2007). В качестве одного из перспективных подходов сопряжения протеомного анализа с локализацией белков в клетках создана коллекция дрожжей с белками, меченными ФБ (Chong et al., 2012). Для изучения гетерогенности бактериальных популяций по проявлению признаков у генетически сконструированных штаммов в рамках программ по синтетической биологии разработан протокол MUSIQ (Microscope flUorescence SIngle cell Quantification), также основанный на технологии мечения ФБ и компьютерного анализа изображений (Cortesi et al., 2017).

Особый интерес представляет изучение динамики распределения белков в интактных (не фиксированных) препаратах дрожжей. Например, исследована локализация и перемещение трех меченных ФБ белков Lac репрессора (LacR), встроенного в кластер генов белка Chr1, белка Cut11 ядерной мембраны и компонента Sid4 веретена в делящихся дрожжах Schizosaccharomyces pombe (Bjerling et al., 2012). Методические аспекты изучения единичных интактных делящихся дрожжей с использованием ФБ и флуоресцентной микроскопии обобщены в обзоре (Mulvihill, 2017).

Сравнительно недавно были разработаны методы флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (“наноскопии”), которые позволяют исследовать внутриклеточные структуры с размерами порядка 0.02–0.04 мкм и даже отслеживать локализацию и движение отдельных макромолекул. В основе этих методов лежит использование химерных белков, меченных ФБ (Yao, Carballido-López, 2014). Развиваются и альтернативные методы введения флуоресцентных меток во внутриклеточные белки для “наноскопии” (Minoshima, Kikuchi, 2017).

Существует два основных подхода микроскопии сверхвысокого разрешения (Gahlmann, Moerner, 2014). Первый позволяет следить за перемещениями флуоресцирующей молекулы белка, который экспрессирован или активирован в очень низкой концентрации ‒ одна или две молекулы на клетку. Во втором регистрируют серию изображений флуоресценции молекул одного и того же белка, меченных разными флуорофорами, свечение которых может “включаться” или “выключаться” специальными световыми импульсами. Компьютерная обработка изображений, наложенных друг на друга, позволяет выявить положение в клетке расположенных рядом флуоресцирующих белков, расстояние между которыми 0.02–0.04 мкм.

С помощью этой методологии получено много фундаментальных сведений о цитоскелете бактерий и организации нуклеоида (Yao, Carballido-López, 2014), о динамике транскрипции (Stracy, Kapanidis, 2017) и трансляции (Gahlmann, Moerner, 2014), о динамике белков, взаимодействующих с ДНК (Uphoff, 2016), об организации секреторных систем и внутриклеточной компартментализаци (Schneider, Basler, 2016). Имеются примеры использования микроскопии сверхвысокого разрешения для изучения механизмов действия противобактериальных препаратов (Choi et al., 2016).

СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Существует четыре основных вида сканирующей зондовой микроскопии: сканирующая туннельная микроскопия (СТМ), сканирующая электрохимическая микроскопия (СЭХМ), сканирующая магнитно-силовая микроскопия (СМСМ) и сканирующая атомно-силовая микроскопия (САСМ). Все они основаны на регистрации взаимодействия миниатюрного механического зонда (кантелевера) с поверхностью исследуемого объекта при ее сканировании. Причем размеры зонда настолько малы, что позволяют характеризовать физическо-химические свойства поверхности (получать “физико-химические изображения”) с разрешением вплоть до размеров атомов. СТМ основана на измерении так называемого туннельного тока, возникающего между поверхностью образца и зондом. При СЭХМ осуществляется регистрация электрохимических процессов между зондом и изучаемой поверхностью. Взаимодействие атомов зонда и исследуемого образца за счет магнитных полей или сил Ван-дер-Ваальса лежит в основе СМСМ и САСМ соответственно (Bhushan, Marti, 2011).

Сведений о применении СТМ и СМСМ для изучения единичных клеток микроорганизмов в литературе не обнаружено. Есть данные об использовании СЭХМ для изучения биохимических процессов на поверхности биопленок ряда бактерий (подробнее о принципах и методических возможностях СЭХМ при изучении биопленок см. обзор Zoski, 2016). Так, в частности, с помощью СЭХМ проводились измерения содержания перекиси водорода на поверхности биопленок Vibrio fischeri (Abucayon et al., 2014) и Streptococcus gordonii в комбинации с Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Liua et al., 2011). В первом случае показано, что каталазная активность двух штаммов V.  fischeri, свободноживущего и живущего в симбиозе с клетками кальмара, примерно одинакова. Во втором случае благодаря анализу “химического изображения” содержания перекиси водорода на поверхности биопленки удалось установить, что на поверхности клеток S. gordonii генерируется перекись водорода, которая разлагается каталазой A. actinomycetemcomitans.

При исследовании межклеточной сигнализации в биопленках P. aeruginosa с помощью СЭХМ было охарактеризовано распределение редокс-активных сигнальных молекул пиоцианина в 3D пространстве над поверхностью биопленки P. aeruginosa. При этом была показана возможность получать “химическое изображение” редокс-активности исследуемой биопленки в 2D пространстве (Koley et al., 2011). Еще в одном исследовании, связанном с межклеточной сигнализацией, с использованием СЭХМ пиоцианина изучали реакции quorum sensing (QS) в 3D пространстве внутри и между искусственно созданными агрегатами клеток P. aeruginosa. Благодаря этому подходу была выявлена зависимость реакций QS от размеров агрегатов (Connella et al., 2014).

Использование АСМ в изучении микроорганизмов началось сравнительно давно, и эта область исследований обобщена в многочисленных обзорах. Поэтому имеющиеся сведения мы суммируем главным образом со ссылками на основные из них.

Первоначально АСМ использовали для получения изображений структуры поверхности нативных микробных клеток с разрешением, сопоставимым со сканирующей электронной микроскопией (СЭМ). Осуществлялось это в водной среде, что выгодно отличало АСМ от СЭМ, которая проводится на сухих или замороженных препаратах в вакууме (Dorobantu et al., 2012). Показано применение АСМ для получения изображений структуры полисахаридов, пептидогликана, тейхоевых кислот, пилей, жгутиков и многих других компонентов поверхностей различных микробных клеток в физиологических условиях (Dufrêne, 2014).

Разрешающая способность АСМ позволяет изучать структурную организацию единичных белковых молекул в надмолекулярных комплексах. Одним из примеров реализации этой уникальной возможности АСМ является характеристика пространственной самоорганизации молекул белков оболочки бактериальных микрокомпартментов Haliangium ochraceum (Sutter et al., 2016) (о микрокомпартентах бактерий см. обзор Bobik et al., 2015). АСМ высокого разрешения может быть использована и для регистрации динамики формирования надмолеклярных комплексов белков. Так, с помощью специальной методики скоростной АСМ изучены структурные особенности сборки и активации MotPS статорного компонента Na⁺-типа жгутикового мотора Bacillus subtilis (Terahara et al., 2017).

АСМ позволяет проводить количественный анализ сил взаимодействия различных молекулярных структур, находящихся на поверхности микробных клеток, между собой и с окружающей средой. Для этого проводится модификация (функционализация) кантелевера различными химическими группировками (например, аминогруппой или карбоксильной группой), небольшими шариками (например, стеклянными или латексными) или даже целыми клетками бактерий (Lower, 2011). Поэтому на сегодняшний день можно говорить о АСМ не как о методе, а о совокупности методов: микроскопии химических сил (МХС), спектроскопии сил единичных клеток (ССЕК) и спектроскопии сил единичных молекул (ССЕМ). Они позволяют характеризовать пространственную организацию химических групп и зарядов на поверхности микробных клеток (получать “химическое изображение”), а также и измерять силы взаимодействия микроорганизмов между собой, с различными лигандами и абиогенными поверхностями (Dorobantu et al., 2012; Ott et al., 2017).

Основанные на АСМ подходы оказались наиболее востребованными при изучении микробных биопленок (Angeloni et al., 2016). Например, одна из методик АСМ позволяет исследовать деление единичных клеток бактерий E. coli при росте на плоской поверхности (Van Der Hofstadt et al., 2015). Получение многопараметрических АСМ изображений с использованием ССЕМ и ССЕК успешно применяли для изучения молекулярных механизмов адгезии клеток бактерий при формировании биопленок на минеральных микрочастицах почвы (Huang et al., 2015), инструментах медицинского назначения (Herman-Bausier et al., 2017) и биотехнологическом оборудовании (James et al., 2017).

ЦИТОМЕТРИЯ

Цитометрия объединяет три основных подхода для анализа единичных клеток: проточную цитометрию (ПЦ), проточную цитометрия с визуализацией (ПЦВ (imaging flow cytometry) и сканирующую цитометрию (СЦ).

ПЦ основана на измерении оптических параметров отдельных клеток в потоке жидкости. Для этого суспензию клеток пропускают через узкий капилляр таким образом, что в потоке его центральной части единичные клетки движутся одна за другой. Поток единичных клеток проходит через оптический участок, где освещается сфокусированным пучком света. При этом в зависимости от поставленной задачи регистрируется возникающее на клетках светорассеяние под разными углами и флуоресценция, если клетки предварительно были обработаны определенными флуорохромами. ПЦ используется в микробиологии сравнительно давно и является едва ли не самым популярным методом анализа отдельных клеток в микробных популяциях. Этому способствует наличие коммерчески доступных приборов, возможность быстро анализировать большие популяции, а также широкий спектр флуорохромов, позволяющих характеризовать различные свойства клеток. Типичные коммерчески доступные приборы позволяют анализировать микробные суспензии со скоростью до 1000 клеток в секунду по 5‒10 оптическим параметрам, а специализированные ‒ до 50 000 клеток в секунду и до 20 параметров одновременно. Мы не будем останавливаться на подробностях использования ПЦ в микробиологии, поскольку они достаточно полно освещены в ряде исчерпывающих обзоров, посвященных, в частности, количественному анализу гетерогенности микробных популяций (Avery, 2006; Wilkinson, 2015), оценке жизнеспособности микроорганизмов (Juzwa et al., 2016; Emerson et al., 2017), характеристике различных физиологических реакций у бактерий (Ambriz-Aviña et al., 2014), а также исследованию экологии микроорганизмов (Czechowska et al., 2008; Wang et al., 2010; Emerson et al., 2017).

На основе ПЦ разработан препаративный метод избирательного выделения клеток с определенными свойствами, основанный на измерении их флуоресценции, FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). Этот подход широко применяется в исследовании клеток человека и животных (Herzenberg et al., 2002). Есть примеры использования FACS в микробиологии (подробнее о других препаративных методах получения единичных клеток микроорганизмов см. обзор Ishii et al., 2010). Так, например, с помощью FACS отсортировали клетки бактерий с низким содержанием нуклеиновых кислот из трех пресноводных источников. Были получены три культуры ранее неизвестных бактерий, принадлежащих к группе грамотрицательных бактерий рода Polynucleobacter по результатам анализа генов 16S РНК (Wang et al., 2009). Другой пример ‒ метод, позволяющий проводить выделение бактерий из природных образцов с использованием одновременно технологии флуоресцентной гибридизации in situ, FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) и FACS. На примере смеси бактерий E. coli с ДНК фага λ показана применимость этого метода для выделения целевых бактерий в условиях загрязнения посторонним генетическим материалом (Chen et al., 2011).

ПЦВ сочетает в себе возможности ПЦ и флуоресцентной микроскопии с одновременным измерением интегральных оптических параметров клеток в потоке и получением их цифровых флуоресцентных изображений. Это дает возможность характеризовать каждую клетку в целом по ее светорассеянию и флуоресценции, а также анализировать ее морфологию и/или пространственное распределение тех или иных оптических показателей в структуре клеток (Barteneva et al., 2012). Важно, что метод позволяет быстро количественно анализировать большие популяции клеток по множеству параметров, благодаря специальным алгоритмам компьютерного анализа (Hennig et al., 2017). Первоначально, как и ПЦ, этот подход был разработан для исследования единичных клеток человека и животных (Barteneva et al., 2012), которые существенно больше по размерам, чем клетки микроорганизмов. Это связано с небольшим разрешением получаемых изображений по сравнению с обычной микроскопией. С появлением коммерчески доступных приборов метод нашел широкое применение в биомедицинских исследованиях, в том числе при изучении взаимодействия микроорганизмов с клетками макроорганизма. Так, в частности, с помощью ПЦВ разработаны подходы для изучения фагоцитоза и интернализации бактерий Salmonella enterica в макрофаги клеточной линии RAW 264.7 (Phanse et al., 2012), Yersinia enterocolitica в мононуклеарные фагоциты (Drechsler-Hake et al., 2016), Neisseria gonorrhoeae в нейтрофилы (Smirnov et al., 2017), Toxoplasma gondii и Mycobacterium tuberculosis в различные клеточные линии (Haridas et al., 2017). С использованием ПЦВ выявлены морфологические изменения дрожжевой формы криптококков, связанные с приобретением факторов патогенности, в мононуклеарных лимфоцитах (Okagaki et al., 2010), проведена идентификация, классификация и изучены стадии развития простейших Plasmodium falciparum в крови (Dekel et al., 2017). Показано применение ПЦВ для количественной характеристики распределения клеток по стадиям клеточного цикла в популяции S. cerevisiae (Calvert et al., 2008), а также для количественной оценки сообществ фитопланктона по таким показателям, как распределение клеток по размерам, жизнеспособность и метаболическая активность (Dashkova et al., 2017).

СЦ основана на регистрации флуоресценции и светорассеяния на небольшом участке поверхности, которая освещается узким пучком лазерного излучения при горизонтальном сканировании (Kamentsky, Kamentsky, 1991). В известной мере это аналог ПЦ, который позволяет исследовать образцы клеток не в суспензии, а находящиеся на плоской поверхности, например, на предметном стекле для микроскопии, в лунке планшета для культивирования клеток, на мембранном фильтре и т.п. Это обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с ПЦ, например, возможность работать с небольшими образцами, исследовать морфологию клеток, проводить исследования in situ. СЦ нашла широкое применение преимущественно в исследованиях клеток человека и животных (Pozarowski et al., 2013). Примеров применения СЦ в микробиологии сравнительно немного. Так, например, разработаны методики количественного учета бактерий и грибов в различных природных образцах (Vanhee et al., 2010) и бактерий в питьевой воде (Baudart et al., 2004) с использованием СЦ на мембранных фильтрах. Есть также аналогичные методики количественного учета микобактерий в клинических образцах (Pina-Vaz et al., 2004) и Staphylococcus xylosus в биопленках на стеклянных поверхностях (Regina et al., 2012). Метод СЦ был использован совместно с микрофлуориметрией индивидуальных клеток Cryptococcus neoformans для оценки содержания в них ДНК, окрашенной йодидом пропидия, при изучении клеточного цикла этих дрожжей. Метод микрофлуориметрии позволил проследить динамику синтеза ДНК по стадиям развития, а СЦ оценить соотношение клеток на разных стациях клеточного цикла в популяции (Yamaguchi et al., 2007).

НАНО МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ВТОРИЧНЫХ ИОНОВ

Метод нано масс-спектрометрии вторичных ионов, nano SIMS (nano Secondary Ion Mass Spectrometry), позволяет характеризовать наличие тех или иных химических соединений в исследуемых объектах в координатах плоскости с разрешением в нанометровом диапазоне (получать “химическое изображение” объекта). Это осуществляется с помощью уникальных приборов, основанных на масс-спектрометрии вторичных ионов ‒ так называемых ионных микроскопов и ионных микрозондов. В приборах первого типа образец “бомбардируется” первичными ионами по всей поверхности одновременно, во втором – в сканирующем режиме очень узким пучком. В качестве первичных ионов используют ионы цезия (Cs⁺) и кислорода (О^–). Возникающие под ударом первичных ионов “осколки” разрушенных молекул образца – вторичные ионы, разделяются в детекторе масс-спектрометра по массе и регистрируются в виде спектра масс. Причем все эти данные у обоих типов приборов находятся в строгом соответствии с координатами плоскости образца. Если в образце имеются компоненты, имеющие пространственно-упорядоченную структуру, как например, клетки микроорганизмов, то после специальной компьютерной обработки данных, получается их “химическое изображение” по специфическому составу вторичных ионов. Кроме того приборы оснащены микроскопом, что позволяет сопоставлять “химическое изображение” с оптическим изображением (Gao et al., 2016; Nuñez et al., 2017). Применение nano SIMS в изучении микроорганизмов на уровне единичных клеток достаточно полно отражено в обзоре (Gao et al., 2016). Поэтому мы ограничимся лишь двумя примерами для иллюстрации возможностей метода. Первый пример ‒ это исследование динамики размножения единичных бактерий Staphylococcus aureus непосредственно в мокроте пациентов с кистозным фиброзом (Kopf et al., 2016). Подход был основан на мечении дейтерием (²Н₂О) вновь синтезируемых разветвленных насыщенных C₁₄ и C₁₆ жирных кислот с параллельным анализом специфичности в отношении S. aureus методом FISH. Была обнаружена выраженная гетерогенность клеток S. aureus по времени генерации, причем медиана исследованной популяции in situ по этому показателю оказалась существенно меньше измеренного ранее in vitro предела скоростей для патогенов кистозного фиброза. Авторы подчеркивают значимость данных, полученных in situ на единичных клетках, для выбора правильной стратегии химиотерапии при кистозном фиброзе.

Второй пример связан с изучением экологии микроорганизмов. Исследовали количественные физиологические характеристики индивидуальных бактериальных клеток Chromatium okenii, Lamprocystis purpurea и Chlorobium clathratiforme экосистемы олиготрофного меромиктического озера (Musat et al., 2008). Для этого был разработан подход, также как и в предыдущем примере основанный на сопряжении nano SIMS и молекулярной идентификации с помощью FISH. Метаболическую активность характеризовали по ассимиляции ${{{\text{H}}}^{{13}}}{\text{CO}}_{3}^{ - }$ и $^{{15}}{\text{NH}}_{4}^{ + }.$ Было установлено, что в популяциях клеток каждого вида существует гетерогенность по метаболической активности. Еще одним любопытным наблюдением было обнаружение того, что клетки C. okenii, составляющие менее 0.3% популяции обеспечивали более 40% потребления аммония и 70% общего потребления углерода в системе. Этот результат особенно ярко иллюстрирует принципиальную значимость и перспективность исследований экофизиологии микроорганизмов на уровне индивидуальных клеток, в частности с помощью методов nano SIMS.

КОЛЕБАТЕЛЬНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ

Колебательная спектроскопия позволяет регистрировать спектры квантовых переходов между колебательными уровнями энергии молекул после возбуждения фотонами света. Колебательные спектры регистрируют с помощью инфракрасной спектроскопии (ИКС) и рамановской спектроскопии (РС) (названа так в честь Ч.В. Рамана, впервые описавшего феномен неупругого рассеяния света; в российской литературе часто пользуются термином “спектроскопия комбинационного рассеяния”).

ИКС позволяет измерять спектры поглощения инфракрасного излучения, обусловленные колебательными энергетическими переходами в молекулах. В основе РС лежит эффект так называемого неупругого рассеяния света. При отражении от молекул основная часть света рассеивается в виде так называемого упругого (рэлеевского) рассеяния. При этом спектр отраженного света не изменяется. Однако небольшая часть фотонов претерпевает неупругое отражение вследствие взаимодействия с молекулами, которое связано с колебательными энергетическими переходами, и у них изменяются спектральные свойства. Это излучение и регистрируется в виде рамановского спектра. Следует подчеркнуть, что ИКС и РС несут информацию о разных колебательных переходах молекул: поглощение инфракрасного света определяется изменениями электрического момента молекулы в ходе поглощения, а интенсивность рамановского рассеяния зависит от того, как меняется поляризуемость молекулы при возникновении колебания. Изменения поляризуемости и изменение электрического момента могут быть по-разному выражены при различных колебаниях. Поэтому эти колебания по-разному представлены в ИКС и РС. В частности, полярные группы органических соединений (C=O, N‒H, O‒H) хорошо выражены в инфракрасных спектрах, а неполярные группы (C=C, C‒C, S‒S) лучше видны в рамановских спектрах (Ferraro et al., 2003; Stuart, 2004).

ИКС и РС уже давно применяют для характеристики многоклеточных микробных препаратов с использованием стандартных приборов, получая усредненные данные о химическом составе основных компонентов микробных клеток в популяции. Примером может служить использование этих методов для идентификации на уровне рода, вида и даже подвида, поскольку колебательные спектры микроорганизмов являются своего рода их “отпечатками пальцев” (Lu et al., 2011). Есть работы, в которых ИКС и РС использовали для изучения развития бактериальных биопленок, механизмов повреждения клеток, чувствительности к антибиотикам и ряд других (Lu et al., 2011; Santos et al., 2015).

Разработано несколько методов, которые могут быть использованы для исследования единичных клеток микроорганизмов с использованием РС (микро-РС): SERS (Surface-Enhanced Raman Spectroscopy), TERS (Tip-Enhanced Raman Spectroscopy), CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) и RRS (Resonance Raman Spectroscopy) (Li et al., 2012; Harrison, Berry, 2017). Учитывая, что рамановское рассеяние ‒ это очень слабое по интенсивности излучение, то все эти методы используют те или иные приемы для усиления регистрируемых сигналов. Основным достоинством TERS является возможность регистрировать РС с пространственным разрешением ниже оптического дифракционного предела (Domke, Pettinger, 2010). Так, в частности, показано применение TERS для изучения поверхностных структур, в том числе динамики полисахаридов и пептидов у бактерий (Neugebauer et al., 2007), а также для идентификации бактерий и дрожжей на уровне единичных клеток (Neugebauer et al., 2007; Harz et al., 2009). Усиление сигнала рамановского рассеяния также может быть достигнуто с использованием облучения ультрафиолетовым светом. Нуклеиновые кислоты и белки по остаткам ароматических аминокислот у бактерий исследовали именно этим методом в ходе развития клеток по фазам роста (Neugebauer et al., 2007).

С помощью микро-РС можно получать так называемые “рамановские изображения” (Raman imaging) микроорганизмов подобно “химическим изображениям” при nano SIMS (см. предыдущий раздел) в условиях in situ или in vivo (Li et al., 2012; Harrison, Berry, 2017). Так, например, с учетом таксономической специфичности рамановских спектров (см. выше) благодаря применению RRS и специальных методов математической статистики показана возможность идентифицировать и локализовать Mycobacterium gordonae в макрофагах (Silge et al., 2007), идентифицировать, локализовать и даже определить физиологическое состояние разных популяций S. aureus в клетках эндотелия (Große et al., 2015). Методы RRS и SERS использовали для визуализации ризосферных бактерий Pantoea sp. YR343 на поверхности корней Arabidopsis thaliana (Polisetti et al., 2016).

Особый интерес представляет применение микро-РС в сочетании с зондированием стабильными изотопами, Raman-SIP (Raman Stable Isotope Probing) (Wang et al., 2016). Метод основан на том, что замена какого-нибудь атома его изотопом в химическом соединении приводит к сдвигу характерных полос данного атома в рамановском спектре. Это открывает возможность изучения метаболизма определенных соединений путем введения в исследуемую систему субстратов, меченных стабильными изотопами. В случае изучения метаболизма целых клеток микроорганизмов в качестве меченых стабильными изотопами метаболитов в среду культивирования вносят различные субстраты. К настоящему времени исследована возможность применения субстратов меченых изотопами ¹³C, ¹⁵N и ²H. Причем наиболее значимые результаты пока получены в основном с ¹³C- и ²H-аналогами природных субстратов.

Учитывая отсутствие или большую стоимость разнообразных ¹³C-субстратов, был разработан оригинальный подход, основанный на обратном замещении ¹³C-метаболитов природными ¹²C-метаболитами (Wang et al., 2016a). Этот метод был использован при изучении симбиотических взаимоотношений бактерий Acinetobacter baylyi ADP1 и E. coli DH5α-GFP. Исходно клетки выращивали с коммерчески доступной ¹³C-D-глюкозой в качестве субстрата с добавлением D₂О. После ¹³C и ²H мечения обоих штаммов клетки инкубировали с ¹²C-цитратом. С помощью микро-РС было установлено, что клетки E. coli DH5α-GFP, не утилизирующие цитрат в монокультуре, приобретали эту способность в присутствии клеток A. baylyi ADP1. Дополнительные исследования с использованием масс-спектрометрии позволили предположить, что экскретируемые A. baylyi ADP1 путресцин и фенилаланин могут быть стимуляторами анаболизма цитрата E. coli DH5α-GFP.

Еще одно перспективное направление использования микро-РС связано с препаративным выделением отдельных клеток, обладающих определенными свойствами, RACS (Raman Activated Cell Sorting). Достоинствами этого подхода являются неинвазивность, отсутствие дополнительных химических обработок таких, как, например, флуоресцентное зондирование при FACS (см. раздел “Цитометрия”), а также возможность осуществлять выделение клеток, идентифицируемых по определенному химическому составу метаболитов (химическим “отпечаткам пальцев”). Однако развитие этой методологии сдерживается техническими трудностями, связанными главным образом с низкой интенсивностью рамановского светорассеяния и необходимостью регистрации спектров со скоростью, обеспечивающей возможность физического разделения клеток по определенным признакам в реальном масштабе времени (Pahlow et al., 2015; Song et al., 2016).

В качестве успешного применения выделения клеток бактерий с помощью RACS приведем два примера, в которых в качестве признака для препаративной сортировки клеток использовали хорошо выраженную спектральную полосу каротиноидов. Первый пример связан с использованием микропроточной системы RACS, которая была разработана для непрерывного разделения каротиноид-содержащих бактерий. В качестве модельного объекта использовали цианобактерий Synechocystis sp. PCC6803. Показана возможность разделения клеток, культивированных на ¹²С- и ¹³С-субстратах и содержащих, соответственно, ¹²С- и ¹³С-каротиноиды, с эффективностью 96.3% (McIlvenna et al., 2016). В другой работе проводилось разделение бактерий в образцах морской воды Красного моря с помощью RACS. При этом идентификация также была основана на спектрах каротиноидов, но разделение клеток производилось с использованием, так называемого клеточного выталкивания (cell ejection) с подложки, на которой фиксировались клетки. С помощью последующего геномного анализа изолированных клеток были выявлены новые функциональные гены, кодирующие биосинтез каротиноидов и изопреноидов, а также ранее неизвестные фототрофные микроорганизмы, включая некультивируемые Cyanobacteria spp. (Song et al., 2017).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени в руках микробиологов имеется большой набор методов изучения физико-химических свойств единичных клеток микроорганизмов (табл. 1). Все эти методы основаны на разных принципах и, соответственно, позволяют осуществлять многостороннюю характеристику микробных клеток: это открывает перспективу по-новому подойти к решению многих фундаментальных и прикладных проблем.

Методы количественного анализа единичных клеток лежат в основе изучения природы гетерогенности микробных популяций. С помощью этих методов уже получены уникальные сведения о структурно-функциональной организации бактерий и дрожжей на молекулярном уровне, в том числе в динамике. В сочетании с методами геномики появилась возможность изучения некультивируемых в лабораторных условиях микроорганизмов (Solden et al., 2016) непосредственно in situ. Ведутся работы по использованию данных, полученных на единичных клетках микроорганизмов, в исследованиях по системной и синтетической биологии, а также для информационной технологии глубинного анализа данных (data mining). Количественный анализ взаимодействия единичных микробных клеток с клетками макроорганизмов, несомненно, сыграет важную роль в изучении и лечении инфекционных заболеваний.

Фронт работ по разработке и применению методов количественного анализа единичных клеток микроорганизмов на клеточном и субклеточном уровне так широк, что его даже стали выделять как самостоятельное направление ‒ “микробиология единичных клеток” (single-cell microbiology) (Brehm-Stecher, Johnson, 2004). Дальнейшее развитие этого направления, включая совершенствование его методической составляющей, несомненно, будет способствовать углублению наших представлений о мире микробов. Хороших методов в экспериментальной науке не может быть слишком много!