Микробиология, 2019, T. 88, № 2, стр. 207-216

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были 64 штамма актинобактерий, хранящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ, № 768 во Всемирной федерации коллекций культур; www.iegm.ru/iegmcol) и принадлежащие к виду Dietzia maris, 2 видам Gordonia: G. rubripertincta и G. terrae, а также 7 видам рода Rhodococcus: R. erythropolis, R. fascians, “R. longus”; R. opacus, R. qingsheengii, R. rhodochrous и R. ruber (табл. 1).

Культивирование актинобактерий. Для изучения способности актинобактерий аккумулировать ионы ТМ использовали жидкую минеральную среду следующего состава (г/л): KH₂PO₄ – 1.0; (NH₄)₂HPO₄ – 1.5; MgSO₄ · 7H₂O – 0.2; FeSO₄ · · 7H₂O – 0.01; ZnSO₄ · 7H₂O – 0.002. Компоненты питательной среды растворяли в водном растворе сульфата никеля (NiSO₄ · 7H₂O) в концентрации 1.25–10.0 мМ, приготовленного на бидистиллированной воде. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали или/или ацетат аммония – 2.0 г/л, глюкозу – 5.0 г/л, н-гексадекан или н-додекан, в концентрации 3.0 об. %.

Посевным материалом служили бактериальные культуры, предварительно выращенные в мясопептонном бульоне (МПБ) в течение 2 сут. Клеточную биомассу отделяли центрифугированием (20 мин, 5000 g), после чего дважды отмывали деионизированной водой. Осажденные клетки ресуспендировали и использовали как инокулят, который вносили в водный раствор минеральной среды, содержащей соль никеля, в количестве, обеспечивающем начальную концентрацию клеток 3.0 × 10⁹ кл./мл, (что соответствовало 1 об. %). Актинобактерии выращивали в условиях периодического культивирования в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на орбитальном шейкере (120–160 об./мин) при температуре 18–28°С в течение 2 сут. Пробы для измерений отбирали через 1, 3, 6, 9, 12, 22, 24 и 48 ч. Параллельно отбирали пробы для определения содержания внутриклеточного белка модифицированным для актинобактерий методом Лоури (Горина, Яковлева, 1980) с помощью двулучевого спектрофотометра Lambda EZ210 (UV/Vis) (“Perkin-Elmer”, США) при λ = = 750 нм. В этих определениях клеточную биомассу отделяли центрифугированием (20 мин, 5000 g) в стационарной центрифуге, после чего дважды отмывали деионизированной водой.

Определение физиологической активности. Физиологическое состояние бактериальных культур контролировали по изменению их оптической плотности и приросту биомассы. Оптическую плотность (ОП₆₀₀) измеряли спектрофотометрически (λ = 600 нм) с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 (UV/Vis) (“Perkin-Elmer”, США). Накопление биомассы определяли весовым методом. Образцы (10 мл) культуры фильтровали через предварительно взвешенные нитроцеллюлозные мембранные фильтры с размером пор 0.2 мкм (“Владисард”), промывали 0.5%-ным раствором NaCl, фильтры высушивали при температуре 105°С до постоянного веса. Вес сухой биомассы рассчитывали в г/л. Чистоту культур и число жизнеспособных клеток определяли методом прямого высева аликвот культур на МПА и микроскопически, просматривая препараты в фазово-контрастном микроскопе Axiostar plus (“Carl Zeiss”, Германия). Дыхательную активность бактериальных клеток оценивали с помощью респирометра Micro-Oxymax^® (“Columbus Instruments”, Ohio, США).

При изучении поглощения никеля бактериальными клетками использовали живые и инактивированные автоклавированием (0.5 атм., 20 мин) клетки. Контролем служили: 1) неинокулированная питательная среда, содержащая ионы Ni²⁺ и 2) бактериальные культуры, выращенные в питательной среде без никеля. О поглощающей способности клеток актинобактерий судили по снижению концентрации Ni²⁺ в среде, что определяли по формуле: (С_нач – С_кон/С_нач) × 100%, где С_нач – исходная; С_кон – конечная концентрация ТМ в среде культивирования. Одновременно регистрировали количество Ni²⁺, поглощенного клеточной биомассой. Для этого образец культуры центрифугировали (5000 g, 20 мин), клетки тщательно отмывали (до отсутствия ионов ТМ в промывных водах) бидистиллированной водой и разрушали ультразвуком (23 кГц, 0.7 А) с помощью низкочастотного диспергатора Soniprep 150 (“Sanyo”, Япония) в течение 15 мин в условиях охлаждения суспензии. Гомогенаты клеток центрифугировали (5000 g, 20 мин). В полученных супернатантах определяли содержание ионов Ni²⁺ диметилглиоксимным методом спектрофотометрически при длине волны λ = 470 нм (Лурье, 1984). Коэффициент биоаккумуляции рассчитывали по формуле: С_внутр/С_внеш, где С_внутр – количество внутриклеточного металла, мкг/г массы сухих клеток; С_внеш – количество металла в культуральной жидкости, мкг/мл.

Статистическая обработка. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Результаты обрабатывали традиционными методами с помощью пакета компьютерных программ Statistica, версия 6.0 для Windows (“StatSoft Inc.”, 2001), и Excel 2007 (“Microsoft Inc.”, 2007). Для решения отдельных задач применяли кластерный анализ с использованием метода древовидной кластеризации. Критериями оценки явились показатели взвешенного среднего числа пары группы, расстояние (S) между которыми рассчитывали по формуле City-block Manhattan distance, позволяющей снизить влияние отдельных больших различий между объектами на рассчитываемое расстояние.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Способность актинобактерий аккумулировать ионы Ni²⁺. В результате проведенных исследований нами обнаружено, что используемые в работе бактериальные штаммы обладают различной способностью к поглощению никеля. Следует отметить, что адаптационные механизмы неспецифической устойчивости алканотрофных актинобактерий к ионам ТМ были описаны нами ранее (Костина и соавт., 2010; Ившина и соавт., 2013). Большинство (43) бактериальных штаммов извлекали из среды культивирования от 20 до 60% ионов Ni²⁺ при исходной концентрации металла от 0.6 до 2.5 мМ. Полученные данные, представленные в виде процентного показателя степени извлечения ионов Ni²⁺ (рис. 1), подвергались обработке методом кластерного анализа. Дендрограмма на рис. 1 иллюстрирует распределение исследуемых бактериальных штаммов по кластерам в зависимости от степени поглощения ионов никеля из среды культивирования. Как следует из дендрограммы, исследуемые штаммы оказались объединены в четыре группы А, Б, В и Г, имеющие внутригрупповой показатель сходства, не превышающий 30 усл. ед. Необходимо отметить, что для большинства (44) исследуемых штаммов аккумуляция ионов Ni²⁺ различалась не более чем на 10%.

Рис. 1.

Дендрограмма, иллюстрирующая способность исследуемых штаммов актинобактерий аккумулировать ионы Ni²⁺ (1.25 мМ).

Первую группу (А) составляют штаммы, проявляющие низкую аккумулирующую активность ионов Ni²⁺ на уровне от 15 до 22%. Эта группа представлена, в основном, тремя видами актинобактерий рода Rhodococcus: “R. longus”, R. opacus и R. qingsheengii (до 3 штаммов каждого вида в группе), и характеризуется высокой степенью их сходства по исследуемому признаку (расстояние между штаммами на построенной диаграмме не превышает 10 усл. ед.). Помимо вышеперечисленных видов в состав данной группы входят отдельные штаммы – представители видов G. rubripertincta, G. terrae, R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber.

Вторая группа (Б) обладает средней (23–38%) аккумулирующей способностью, тогда как группа В характеризуется высоким (40–60%) уровнем аккумулирующей способности в отношении ионов никеля.

Группа Г включает 12 штаммов актинобактерий, относящихся, в основном, к видам G. rubripertincta, R. fascians, R. rhodochrous и R. ruber. Представители данной группы проявляют наиболее высокую (66–95%) металлаккумулирующую активность и характеризуются внутригрупповым показателем сходства 19–25 усл. ед.

Необходимо отметить, что данные группы объединяют все исследуемые в работе виды актинобактерий, и степень сходства внутри групп составляет от 18 до 22 усл. ед. (рис. 1). Представители видов D. maris, G. rubripertincta, R. rhodochrous и R. ruber, имеющие красно-оранжевый недиффундирующий пигмент, а также R. fascians с ярко-желтой окраской бактериальных колоний, характеризуются более выраженной степенью извлечения ионов ТМ. В среднем они извлекают из среды культивирования от 40 до 50% ионов Ni²⁺ (рис. 2), что достоверно (p < 0.05) отличает их по этому признаку от представителей видов R. erythropolis, “R. longus”, R. opacus и R. qingsheengii, образующих колонии кремового и телесно-палевого цвета, и извлекающих из среды культивирования от 15 до 30% ионов никеля. Высокая степень извлечения никеля пигментированными штаммами актинобактерий согласуется с известными литературными данными (Ившина и соавт., 2002; Gadd, 1990) и свидетельствует об участии пигментов в процессе биологической сорбции ионов ТМ. Известно (Ившина и соавт., 2013), что для пигментированных форм актинобактерий характерна повышенная жизнеспособность при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности, пониженной температуры, влиянии антимикробных соединений и ряда других.

Рис. 2.

Степень извлечения никеля (1.25 мМ) в зависимости от пигментирования клеток актинобактерий. 1 – красно-оранжевые (D. maris, G. rubripertincta, G. terrae, R. rhodochrous и R. ruber – 34 культуры); 2 – желтые (R. fascians – 5 культур); 3 – кремовые и палевые (R. erythropolis, “R. longus”, R. opacus и R. qingsheengii – 25 культур) колонии. * Статистически достоверно (p < 0.05) от непигментированных актинобактерий.

Следует отметить, что строгой корреляции между видовой принадлежностью актинобактерий и их способностью аккумулировать ионы Ni²⁺ нами не выявлено. Установлено, что штаммы актинобактерий в пределах одного вида по способности аккумулировать никель отличаются друг от друга в 1.4–4.8 раза (табл. 2), как, например, штаммы, принадлежащие видам G. rubripertincta, R. rhodochrous и R. ruber. При этом изменений в концентрации никеля в вариантах абиотического контроля нами не обнаружено.

Возможно, неоднородность актинобактерий по способности извлечения из среды никеля связана с их экологической приуроченностью. На рис. 3 представлены данные по влиянию зависимости от источника выделения чистых культур алканотрофных актинобактерий (64 штамма) на их способности аккумулировать из среды ионы Ni²⁺. Штаммы, выделенные из загрязненных нефтью сред, как водных, так и почвенных, по способности к извлечению никеля из среды культавирования на 10–15% превышают выделенные из незагрязненных субстратов.

Рис. 3.

Зависимость способности штаммов актинобактерий к извлечению никеля (1.25 мМ) от загрязненности источника их выделения. Варианты опыта: 1 – штаммы, выделенные из незагрязненных сред (25 штаммов); 2 – штаммы, выделенные из сред, загрязненных нефтью (36 штаммов). * Отличия статистически достоверны при p < 0.05.

Видовая неоднородность алканотрофных актинобактерий в отношении извлечения ионов Ni²⁺ из среды показана на примере штаммов вида R. ruber. Как видно из рис. 4, наиболее высокую (60% и более) аккумулирующую активность демонстрируют штаммы R. ruber ИЭГМ 93, ИЭГМ 172, ИЭГМ 226, ИЭГМ 231, ИЭГМ 235 и ИЭГМ 327, тогда как, минимальную (менее 30%) способность извлекать ионы Ni²⁺ проявили штаммы R. ruber ИЭГМ 73, ИЭГМ 223 и ИЭГМ 225.

Рис. 4.

Степень извлечения никеля (1.25 мМ) из среды разными штаммами вида R. ruber.

Динамика процесса поглощения никеля клетками актинобактерий. В следующей серии экспериментов изучали пути поступления никеля в клетки бактерий, а также основные закономерности процессов его накопления живыми и мертвыми клетками. Отметим, что как пассивное накопление никеля, так и его активный транспорт были аналогичны для 10 изученных нами видов актинобактерий. На рис. 5 представлены типичные результаты опытов с живыми и автоклавированными клетками на примере штамма R. ruber ИЭГМ 231 – наиболее активного биоаккумулятора никеля. Установлено, что уровень аккумуляции ионов никеля мертвыми клетками существенно (в 9.4 раз) ниже, чем клетками развивающейся культуры. Было отмечено, что в варианте использования живых клеток степень поглощения Ni²⁺ резко увеличивалась в течение первых трех часов эксперимента, а затем снижалась. При использовании инактивированных клеток степень извлечения ионов Ni²⁺ оставалась практически постоянной в течение всего эксперимента и составляла около 9.0%. Так как степень аккумулирующей активности для живых клеток в ходе эксперимента достигала 92.2%, можно заключить, что до 83.2% аккумулирующей активности приходится на способность концентрировать ионы Ni²⁺ энергозависимым образом, то есть биоаккумулированием. При этом увеличение времени взаимодействия клеток с ионами никеля до 48 ч не приводит к возрастанию его содержания в бактериальных клетках. Достигнутый уровень аккумуляции или не изменяется, или уменьшается, то есть никель вновь поступает из клеток в среду культивирования в результате адаптации или гибели бактериальных клеток (в зависимости от конкретного штамма актинобактерий), при этом концентрация никеля в бактериальных клетках снижается до уровня, который характерен для процесса биосорбции (6.0–19.0%). Следующей закономерностью является установленная зависимость уровня аккумуляции никеля от его исходной концентрации и источника углерода в среде культивирования. Как видно из табл. 3, аккумулирующая активность прямо зависит от концентрации ионов Ni²⁺ в среде культивирования. Согласно полученным данным, родококки при росте на углеводородсодержащих питательных средах, а также на глюкозе более эффективно извлекают ионы Ni²⁺ по сравнению с ростом на ацетате аммония в качестве единственного источника углерода и энергии. Несмотря на то, что уровни извлечения никеля клетками родококков при их росте в среде с углеводородами или глюкозой были сопоставимы, временной промежуток, в котором фиксировался максимум поглощения Ni²⁺ клетками, в среде с глюкозой был в 12–24 раза короче. Это позволяет проводить экспресс исследования по поиску актинобактерий – активных биоаккумуляторов ТМ.

Рис. 5.

Степень извлечения никеля (1.25 мМ) из среды живыми (1) и мертвыми (2) клетками R. ruber ИЭГМ 231 по сравнению с абиотическим контролем (3).

Изучение влияния таких параметров, как возраст культуры, исходная концентрация клеток актинобактерий, температура культивирования и диапазон активной кислотности на эффективность процесса аккумуляции никеля клетками актинобактерий описан нами ранее (Костина и соавт., 2013). Таким образом, исследованные нами штаммы актинобактерий обладают способностью поглощать из среды культивирования от 9 до 215 мг никеля на 1 г сухой биомассы, что позволяет рассматривать актинобактерии рода Rhodococcus по их способности к биосорбции ионов никеля как конкурентоспособные при сравнении с достаточно широким кругом микроорганизмов (Beolchini et al., 2009; Wang, Chen, 2009).

Микроскопические исследования обнаружили морфологические изменения клеток штамма R. ruber ИЭГМ 231 при их культивировании в среде, содержащей никель (рис. 6а): наблюдается образование больших конгломератов, а также уменьшение размера клеток в 2 раза (до 2.5–3.5 мкм) по сравнению с контролем (без ионов Ni²⁺) и практически отсутствуют V-образные делящиеся клетки. По нашему мнению, ионы никеля ингибируют процесс деления бактериальных клеток, так как количество делящихся клеток в среде с никелем снижается в 6 раз по сравнению с контролем. Для актинобактерий рода Rhodococcus экспоненциальной фазы роста при культивировании их в среде без никеля характерно присутствие палочковидных клеток длиной от 5.0 до 7.0 мкм и шириной 0.5–0.9 мкм, располагающихся единично, V‑образно или палисавидно с большим количеством V-образных делящихся клеток (рис. 6б).

Рис. 6.

Клетки R. ruber ИЭГМ 231 в световом микроскопе после 1 сут инкубирования в присутствии никеля (ув. ×1000). Варианты опыта: а – минеральная среда с Ni²⁺ (2.5 мМ); б – контроль (среда без добавления ионов ТМ).

Физиолого-биохимические исследования показали, что при инкубировании актинобактерий в среде, содержащей ионы никеля, через 24 ч культивирования происходит заметное повышение (в 1.2–2.0 раза) содержания внутриклеточного белка по сравнению с контролем (без ионов Ni²⁺) (рис. 7). Подобная закономерность выявлена для всех исследованных в работе бактериальных культур. При этом внутривидовые различия по содержанию белка в клетках культивируемых в течении 24 ч в среде, содержащей ионы Ni²⁺, не превышают 14%. Полученные результаты подтверждают высказанное ранее предположение, что отмеченное повышение белкового синтеза является проявлением одного из механизмов адаптации бактерий к металлическому стрессу, в результате которого связывание ТМ с функциональными группами белковых молекул способствует снижению токсического эффекта, вызываемого ионами ТМ (Костина и соавт., 2010).

Рис. 7.

Влияние ионов Ni²⁺ на содержание внутриклеточного белка. Варианты опыта: 1 – контроль (среда без внесения ионов ТМ); 2 – среда, содержащая ионы Ni²⁺ (2.5 мМ) через 24 ч культивирования. Виды актинобактерий: 1 – D. maris (5); 2 – G. rubripertincta (5); 3 – G. terrae (6); 4 – R. erythropolis (9); 5 – R. fascians (5 штаммов); 6 – “R. longus” (8); 7 – R. opacus (7); 8 – R. rhodochrous (6); 9 – R. ruber (12 штаммов).

Еще одним параметром влияния никеля на физиолого-биохимические процессы жизнедеятельности клеток актинобактерий было изменение их дыхательной активности, что было исследовано на примере штамма R. ruber ИЭГМ 231 (рис. 8). Интенсивность дыхания определяли по параметрам потребления бактериями кислорода и выделению углекислого газа в динамике развития бактериального штамма. Как видно из рис. 8, дыхательная активность клеток родококков была в 1.5–2.0 раза ниже при инкубировании в среде, содержащей ионы Ni²⁺, по сравнению с ростом в минеральной среде, не содержащей ионы ТМ. При этом содержание О₂ и СО₂ в абиотическом контроле практически не изменялось и не превышало 200 мкл.

Рис. 8.

Влияние ионов Ni²⁺ на дыхательную активность клеток R. ruber ИЭГМ 231 (ОП₆₀₀ = 2.0). Параметры измерений: а – аккумуляция кислорода, мкл; б – скорость потребления кислорода, мкл/мин; в – выделение углекислого газа, мкл; г – скорость выделения углекислого газа, мкл/мин. Варианты опыта: 1 – бактериальная культура в среде без внесения ионов ТМ; 2 – бактериальная культура в среде, содержащей Ni²⁺ (2.5 мМ); 3 – абиотический контроль.

Общее потребление О₂ клетками родококков в среде без внесения ионов ТМ составило 5.97 × × 10^–4 мкл на клетку, тогда как в среде, содержащей ионы Ni²⁺, 3.85 × 10^–4 мкл на клетку. Выделение CO₂ в среду культивирования составило 1298.2 ± 29.25 мкл на мл среды, тогда как в среде, содержащей ионы Ni²⁺, составило 778.5 ± 8.67 мкл на мл среды. Контрольные показатели (среда без внесения бактериальной культуры) во всех вариантах проведенных измерений были близки к нулю (рис. 8). Кумулятивное потребление О₂ и выделение СО₂ клетками родококков при высокой оптической плотности развивающейся бактериальной культуры (ОП₆₀₀ = 2.0) в 1.5–1.7 раз выше, чем при культивировании в среде, содержащей ионы ТМ. Как видно из рис. 8, полиномиальная аппроксимация более всего соответствует описанию взаимосвязи между концентрацией клеток Rhodococcus и их респираторной активностью. Используя полиномиальную аппроксимацию второго порядка, было показано, что дальнейшее инкубирование не приводит к интенсификации дыхательной активности, что, возможно, связано с ограничением роста бактериальной культуры.

Динамика потребления О₂ и выделения СО₂ клетками родококков показана на рис. 8б, 8г. Средняя скорость (18.5 ± 3.66 мкм/мин) потребления кислорода в среде, содержащей ионы Ni²⁺, достигалась к 3.5 ч инкубации и поддерживалась в течение 34 ч с последующим снижением на 60% к концу инкубации. Можно отметить, что постоянная интенсивная респирация клеток родококков в присутствии ионов Ni²⁺ показала высокую активность и стабильность. Скорость потребления О₂ в среде без добавления ионов ТМ достигала 31.6 ± 6.07, что в 1.7 раз превышает таковую в среде с ионами Ni²⁺. Максимальная скорость потребления кислорода (21.2 и 46.5 мкм/мин) была зафиксирована через 29 ч и 1 ч инкубирования в среде, содержащей ионы Ni²⁺ и без внесения ТМ соответственно. Основываясь на данных, полученных при изучении динамики респирации (см. рис. 8б), и количестве жизнеспособных клеток, установлено, что скорость потребления кислорода составляла 0.18–0.32 мкл мин^–1/мг сухих клеток.

Подобные результаты получены при изучении скорости выделения СО₂ (рис. 8г), так средняя скорость составила 21.6 ± 5.82 и 36.5 ± 7.71 мкл/мин в среде, содержащей Ni²⁺, и без ТМ соответственно. Максимальная скорость выделения СО₂ в обоих вариантах опыта зафиксирована к 44 ч инкубирования. Следует отметить, что изменение дыхательной активности в абиотическом контроле не превышало 0.5 мкл мин^–1. Полученные результаты свидетельствуют о подавлении дыхательной активности клеток родококков (в 1.7–2.0 раза) при выращивании в среде, содержащей ионы Ni²⁺, по сравнению с таковой без внесения ионов ТМ.

По нашим данным, представители актинобактерий разных родов по способности аккумулировать ионы никеля распределяются в следующий порядок: Rhodococcus > Gordonia > Dietzia. В результате проведенных скрининговых исследований по изучению металлаккумулирующей способности чистых культур алканотрофных актинобактерий выявлены количественные различия в степени поглощения ионов Ni²⁺ из среды культивирования. Отобраны штаммы, являющиеся наиболее активными биоаккумуляторами никеля: G. rubripertincta ИЭГМ 95^Т, ИЭГМ 105; R. fascians ИЭГМ 39; R. rhodochrous ИЭГМ 62^Т, ИЭГМ 64, ИЭГМ 646; R. ruber ИЭГМ 84, ИЭГМ 93, ИЭГМ 172, ИЭГМ 226, ИЭГМ 231, ИЭГМ 235, ИЭГМ 327, извлекающие из среды от 60 до 95% ионов ТМ. Эти штаммы имеют практическую значимость и могут быть использованы для биотехнологической очистки природных и сточных вод, загрязненных высокими концентрациями ионов ТМ.

Исследования выполнены в рамках Комплексной программы 18-4-8-21 и государственного задания (№ госрегистрации темы: 01201353247).