Микробиология, 2019, T. 88, № 2, стр. 129-136

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились бактерии Escherichia coli АТСС 25922 и Mycobacterium smegmatis mc² 155, которые культивировали на жидкой среде LB, содержащей (г/л): триптон (“Fluka”, США) – 10, дрожжевой экстракт (“BD”, США) – 5, KCl (“Реахим”, Россия) – 6.4. Определение степени гидрофобности поверхностей бактерий проводили с помощью МАТН-теста (Microbial Adhesion to Hydrocarbons) с н-гексадеканом (Rosenberg et al., 1980).

В работе использовали высокомолекулярный крабовый хитозан в форме гидрохлорида с молекулярной массой (ММ) 200 кДа и степенью дезацетилирования (СД) 87%, производимый ООО “Биопрогресс” (Россия), кватернизированный хитозан – положительно заряженное производное со степенью замещения (СЗ) 98%, полученный на основе хитозана с ММ 20 кДа с применением глицидилтриметиламмония хлорида методом алкилирования (Шагдарова и соавт., 2016), и сукцинилированный хитозан – отрицательно заряженное производное со степенью замещения остатками янтарной кислоты >45%, полученный на основе хитозана с ММ 130 кДа (Свирщевская и соавт., 2016).

Определение минимальной ингибирующей (МИК) и минимальной бактерицидной концентраций (МБК) препаратов хитозана проводили методом серийных разведений в микропланшетах, согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), США) и высокоэффективным методом Flash microbiocide (Кононова и соавт., 2017).

Для изучения интенсивности адгезии бактерий к полистиролу 2.7 мл суспензии отмытых бактериальных клеток (10⁸ КОЕ/мл) в питательной среде LB вносили в полистироловые чашки Петри (диаметр 36 мм). Влияние хитозана на активность адгезионного процесса исследовали, добавляя в инкубационную среду 0.3 мл водного раствора хитозана или его кватернизированного и сукцинилированного производных в исходных концентрациях 1 мг/мл. В контрольном варианте к бактериальной суспензии добавляли 0.3 мл воды. Абиотическим контролем служили растворы хитозанов в стерильной среде LB. Чашки Петри инкубировали 30 мин при 37°С. Затем жидкую часть содержимого удаляли, чашки трижды промывали 3 мл стерильной воды и окрашивали 0.1% раствором генцианвиолета в течение 10 мин. Несвязавшийся краситель несколько раз отмывали стерильной водой до прекращения окрашивания промывных вод. Поверхность высушенных чашек Петри просматривали на микровизоре “Ломо” (Россия) с иммерсией при увеличении ×1000. Количество связавшихся с поверхностью клеток определяли после просмотра не менее чем 20 полей зрения, рассчитывая среднее количество адгезированных бактерий в поле зрения микровизора.

Для определения уровня гидрофобности поверхности полистирола чашек Петри после их инкубации с растворами хитозана и его производных в стерильной среде LB жидкость удаляли аспирацией и трижды промывали 3 мл воды. После высушивания при комнатной температуре определяли уровень гидрофобности полученных поверхностей путем измерения краевого угла смачивания по модифицированному методу сидячей капли (Фролова, Городский, 1986). На подготовленные поверхности чашек Петри наносили несколько капель дистиллированной воды объемом 10 мкл, затем в течение 60 с после контакта с поверхностями фотографировали профиль полученных капель, используя цифровую фотокамеру “Nikon D90”. На полученных фотографиях, используя программное обеспечение GIMP 2.0, вручную измеряли радиус (r) и высоту (h) капель. Контактные углы (θ,°) вычисляли по формуле θ = = 2 × arctg(h/r).

Рост биопленок в присутствии хитозана и его производных исследовали при культивировании бактерий в плоскодонных полистироловых планшетах (“Медполимер”, Россия). В лунки планшетов вносили среду LB, проводили серию двукратных разведений исходных растворов хитозанов, а затем вносили по 10 мкл инокулума бактерий (10⁷ КОЕ/мл) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч (E. coli) и 72 ч (M. smegmatis). Жизнеспособность клеток в сформированных биопленках оценивали по окрашиванию раствором тиазолил тетразолия бромида при концентрации 0.1 мг/мл (“Sigma”, США), который вносили в количестве 100 мкл в лунки планшетов с промытыми биопленками. После инкубации при 37°С в течение 4 ч образовавшийся формазан экстрагировали 20%-ным раствором твина 80, приготовленным на 50%-ном этаноле, в течение 2 ч. Оптическую плотность экстрактов измеряли на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (“Biorad”, США) при длине волны 570 нм.

Морфология клеток M. smegmatis mc² 155 после культивирования в течение 72 ч в среде LB в полистироловых чашках Петри в присутствии кватернизированного хитозана была исследована с использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ). Биопленки микобактерий трижды промывали стерильной деионизированной водой, фиксировали 2.5% глутаральдегидом в течение 1 ч, а затем трижды отмывали водой и высушивали. Поверхность чашек Петри исследовали на микроскопе AFM Nano DST (“Pacific nanotechnology”, США). Все представленные AСМ-изображения являются репрезентативными для большого количества полученных изображений. Клетки микобактерий, инкубированные в полистироловых чашках Петри в среде LB без хитозана в течение 72 ч, использовали в качестве положительного контроля.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что микобактерии и клетки кишечной палочки обладают принципиальными различиями в строении клеточной стенки. Особенность этих различий заключается еще и в выраженных отличиях уровней гидрофобности их поверхностей. Особые характеристики микобактерий во многом обусловлены строением их клеточной стенки, содержащей миколовые кислоты, которые придают клеточной поверхности гидрофобность и способность к использованию гидрофобных субстратов, определяя адаптационные возможности. Известно, что липиды оболочки микобактерий составляют более 60% их сухой массы, что определяет нестандартность тинкториальных, физиологических и экологических свойств всех представителей рода Mycobacterium (Zhiguo, Jeroen De Buck, 2010). Напротив, грамотрицательные бактерии обладают значительно более гидрофильной поверхностью и, кроме того, имеют различные надмембранные образования, включая жгутики, пили или фимбрии, которые, как правило, участвуют в адгезии, опосредуя взаимодействия бактерий с различными поверхностями (Werneburg, Thanassi, 2018).

Экспериментально установлено, что более 80% популяции бактерий M. smegmatis mc² 155, выращенных на среде LB, обладают выраженным сродством к н-гексадекану. В то же время, гидрофобность бактерий E. coli АТСС 25922 едва достигала 2–4%. В связи с этим, следует отметить, что поверхностный заряд и гидрофобность бактерий могут являться определяющими факторами интенсивности их первичной адгезии на твердых поверхностях (Dunne, 2002), а также чувствительности к тем или иным антибактериальным соединениям (Silhavy et al., 2010).

Определением минимальной подавляющей (МПК) и минимальной бактерицидной концентраций (МБК) хитозана и его производных показано, что бактерии M. smegmatis mc² 155 являются более чувствительными к этим соединениям, по сравнению с E. coli АТСС 25922 (табл. 1).

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что МПК хитозана для изученных бактерий оказалась одинаковой, однако использование метода “Flash microbiocide” позволило установить бактерицидные концентрации этого соединения, которые существенно различались для E. coli АТСС 25922 и M. smegmatis mc² 155. Производное хитозана, полученное путем алкилирования и обладающее большей степенью замещения аминогрупп на четвертичные аммониевые (до 98%) (Шагдарова и соавт., 2016), проявляло наиболее выраженное антимикробное действие на микобактерии с существенным снижением МПК и МБК. Однако важно отметить, что кватернизированный хитозан обладал меньшей антибактериальной активностью в отношении E. coli АТСС 25922, по сравнению с хитозаном в форме гидрохлорида с ММ 200 кДа, СД 95%. Вероятно, данный эффект может быть связан с увеличением гидрофобности молекул кватернизированного хитозана, что приводит к возрастанию антибактериального эффекта в отношении бактерий M. smegmatis mc² 155 и снижает его в отношении относительно гидрофильных бактерий E. coli АТСС 25922.

Сукцинилирование хитозана приводит к появлению в его структуре отрицательно заряженных сайтов, что сопровождается подавлением его антибактериального действия за счет снижения способности связывания с клетками-мишенями. Абсолютная устойчивость к сукцинилхитозану обнаружена у E. coli, по-видимому, из-за выраженных анионных свойств поверхностных структур этих бактерий.

Внесение хитозана и его производных в среду инкубации бактерий существенно влияло на их адгезионные свойства. При этом сродство бактерий E. coli и M. smegmatis к полистиролу в присутствии хитозанов значительно различалось. Наибольшим сродством к полистиролу обладали бактерии M. smegmatis mc² 155, количество которых в поле зрения микроскопа достигало 20 клеток, после 30 мин инкубации их суспензий в полистироловых чашках Петри. Этот же показатель для бактерий E. coli АТСС 25922 составлял всего лишь 1–2 клетки в поле зрения микроскопа (рис. 1).

Рис. 1.

Адгезия бактерий E. coli АТСС 25922 (1) и M. smegmatis mc² 155 (2) на поверхности полистирола в присутствии хитозана и его производных через 30 мин инкубации. По оси абсцисс: 1 – контроль; 2 – хитозан; 3 – кватернизированный хитозан; 4 – сукцинилхитозан. 1 – E. coli ATCC 25822, 2 – M. smegmatis mc² 155.

Наличие хитозана и его кватернизированного производного в среде инкубации бактерий приводило к резкому уменьшению числа адгезированных микобактерий, в то время как внесение сукцинилхитозана лишь незначительно снижало количество сорбирующихся на поверхности полистирола клеток M. smegmatis mc² 155.

Другая картина наблюдалась при внесении изучаемых аминированных полисахаридов в среду инкубации бактерий E. coli АТСС 25922. Так, присутствие в среде хитозана и сукцинилхитозана способствовало адгезии бактерий на поверхности полистирола, в то время как кватернизированный хитозан, практически не изменял адгезионных свойств кишечной палочки на поверхности этого полимера. Выявленный эффект, по-видимому, обусловлен изменением физико-химических параметров поверхностей полистирола после сорбции на них молекул хитозана и его производных.

Проведенные исследования показали, что краевой угол смачивания поверхностей полистирола, предобработанных растворами хитозанов в питательной среде LB, существенно уменьшается как при обработке хитозаном, так и его кватернизированным производным. В то же время, предобработка поверхности полистирола сукциноилхитозаном, практически, не вызывала изменений контактного угла смачивания (табл. 2). Таким образом, сорбция хитозана на поверхности полистирола, снижая его гидрофобные свойства, приводила к значительному уменьшению сорбции клеток микобактерий. В то же время, более гидрофильная поверхность полистирола, полученная после предобработки хитозаном, характеризовалась существенным повышением адгезионной активности бактерий E. coli АТСС 25922. Однако прямой зависимости интенсивности адгезии E. coli от изменения степени гидрофобности поверхности модифицированного хитозаном полистирола обнаружено не было. Это связано, вероятно, с тем, что основная роль на ранней стадии колонизации поверхностей грамотрицательными бактериями принадлежит не гидрофобным и электростатическим силам, а надмембранным структурам – жгутикам, пилям или фимбриям, согласованное взаимодействие которых находится под контролем нескольких регуляторных систем, специфически реагирующих на изменение условий среды (Rossi et al., 2018).

Выявленное влияние хитозана и его производных на адгезию бактерий к поверхности полистирола, по-видимому, может существенно сказываться и на формировании на ней бактериальных пленок. Длительное культивирование бактерий M. smegmatis сопровождалось формированием выраженных биопленок на поверхности полистирола. Однако бактерии E. coli практически не формировали биопленочных сообществ и выявлялись, преимущественно, в планктонной форме. Как представлено на рис. 2а, незначительное ингибирование формирования слабых биопленок E. coli наблюдалось лишь под действием хитозана и его кватернизированной формы, но только при использовании их в высоких концентрацях (250 и 500 мкг/мл).

Рис. 2.

Биомасса биопленок E. coli АТСС 25922 через 24 ч культивирования (а) и M. smegmatis mc² 155 через 72 ч культивирования (б) в присутствии хитозана и его производных: 1 – контроль; 2 – сукцинилхитозан; 3 – кватернизированный хитозан; 4 – хитозан.

Наиболее чувствительными к присутствию хитозанов в среде оказались процессы формирования биопленок микобактериями (рис. 2б). Так, хитозан в сукцинилированной форме заметно снижал интенсивность формирования биопленок этих бактерий. При концентрации этого производного хитозана в среде роста, равной 500 мкг/мл, наблюдалось значительное подавление биопленкообразования, примерно на 45% по сравнению с контролем. Более низкое содержание сукцинилхитозана (8–250 мкг/мл) в среде приводило к снижению биомассы пленок примерно на 20%. Присутствие в среде кватернизированного производного также существенно ингибировало рост прикрепленных к полистиролу микобактерий во всем диапазоне исследованных концентраций этого соединения.

Обращает на себя внимание тот факт, что низкие концентрации хитозана в среде культивирования стимулировали образование биопленок микобактериями, однако повышение его содержания приводило к значительному ингибированию этого процесса. При расчете концентраций хитозана и его производных, подавляющих формирование биопленок M. smegmatis и E. coli на 50% по сравнению с максимально возможным (IC₅₀), установлено, что наибольшим ингибирующим эффектом обладал кватернизированный хитозан (табл. 3).

Таким образом, наиболее выраженное антибактериальное и ингибирующее развитие биопленок действие было обнаружено для кватернизированной формы хитозана в отношении бактерий M. smegmatis mc² 155. При атомно-силовом сканировании биопленок микобактерий, сформированных в течение 24 ч в присутствии 500 мкг/мл кватернизированного хитозана, выявлено практически полное отсутствие сорбированных на полистироле клеток M. smegmatis (рис. 3б). Бактериальные клетки с выраженными нарушениями их структур были сосредоточены, главным образом, на образующих агломераты частицах хитозана сферической формы с диаметром 0.6–6 мкм. Сорбированные бактериальные клетки имели существенные отличия по морфометрическим показателям при сравнении с клетками контрольной культуры (рис. 3а).

Рис. 3.

АСМ изображения клеток M. smegmatis mc² 155, закрепленных на полистироле и прокультивированных в среде LB в течение 24 ч: а – контроль; б – бактерии в присутствии 500 мкг/мл кватернизированного хитозана.

При инкубации бактерий на поверхности полистирола в присутствии кватернизированного хитозана не обнаруживалось ни увеличения размеров бактерий, ни их деления, а также формирования жгутов и мицелиоподобных структур, характерных для формирующихся на твердых поверхностях биопленок M. smegmatis (рис. 3а). Кроме того, значительно возрастала шероховатость и неоднородность поверхности микобактериальных клеток, инкубированных в присутствии хитозана в течение суток.

Таким образом, проведенные исследования показали, что внесение в среду роста микобактерий как хитозана, так и его кватернизированного производного препятствует образованию биопленок этих бактерий. В меньшей степени этот эффект проявлялся и на бактериях E. coli АТСС 25922, обладающих слабой адгезионной активностью по отношению к полистиролу и большей резистентностью к хитозану и его формам. Сорбция хитозана на поверхности полистирола значительно подавляла бактериальную адгезию, а микобактерии, сорбированные на микросферах хитозана, подвергались выраженному антибактериальному действию, которое приводило к заметному изменению морфометрических характеристик. Важно отметить, что сукцинилированный хитозан, обладающий существенными отличиями физико-химических характеристик, не оказывал выраженного антибактериального действия и практически не проявлял подавляющих адгезию и формирование биопленок свойств в отношении изученных бактерий, для проявления которых большое значение имеет наличие катионных группировок, отсутствующих в структуре сукцинилированного хитозана (Свирщевская и соавт., 2016).

Таким образом, результаты представленных исследований демонстрируют возможность предотвращения адгезии и биопленкообразования микобактерий крабовым хитозаном в форме гидрохлорида с ММ 200 кДа и степенью дезацетилирования 87%, а также его кватернизированным производным, путем внесения хитозанов в среду или посредством предварительного покрытия ими поверхности полистирола. Другими авторами также была показана эффективность предобработки различных поверхностей хитозаном с целью снижения адгезии на них стафилококков, клебсиелл и кандид, в то же время в ряде работ не представлены характеристики использованных форм хитозана (Carlson et al., 2008; Goy et al., 2009; Campana et al., 2017). Вместе с тем, все исследованные в работе формы хитозана не обладали антиадгезионным и подавляющим развитие биопленок E. сoli действием. Биологическая активность хитозана в отношении грамотрицательных бактерий зависит от физико-химических характеристик применяемых производных хитозана. Так, низкомолекулярный хитозан (50 кДа) эффективно ингибирует адгезию грамотрицательных бактерий и формирование ими биопленок (Campana et al., 2017). Высокомолекулярные формы хитозана, содержащие остатки этилхлоркарбоната, напротив, активируют адсорбцию и формирование биопленок E. coli (Shang et al., 2011). Антибактериальное действие изучаемых соединений на грамотрицательные бактерии, вероятно, зависит не только от физико-химических характеристик, а также и от дополнительных условий, например, от уровня кислотности среды культивирования (Helander et al., 2001). В то же время, считается, что бактерии грамотрицательной группы более устойчивы к антибактериальному действию хитозана и его производных (Goy et al., 2009). Однако присутствие хитозана в среде, по-видимому, может сенсибилизировать бактерии к действию других внешних антибактериальных агентов (Helander et al., 2001).

Представленные в настоящем исследовании биологические эффекты новых производных хитозана, полученных путем алкилирования с использованием глицидилтриметиламмония хлорида и сукцинилирования хитозана остатками янтарной кислоты, представляют собой высокий практический интерес, поскольку высокомолекулярный крабовый хитозан в форме гидрохлорида и его новое кватернизированное производное может быть использовано для ингибирования адгезии и образования биопленок микобактерий. В то же время выявлено, что хитозан и его сукцинилированная форма могут усилить адгезию бактерий E. coli на полимерных поверхностях. Это свойство может быть также использовано и для повышения бактериальной адсорбции при управляемом культивировании биопленок в различных биотехнологических процессах.

Работа выполнена в рамках государственного задания (№ госрегистрации темы 01201353249) и поддержана Комплексной программой исследований УРО РАН, проект № 18-7-8-8.