Микробиология, 2019, T. 88, № 3, стр. 297-308

Метаболомный профайлинг и липидный состав арктических и антарктических штаммов микромицетов Geomyces pannorum и Thelebolus microsporus, выращенных при различных температурах

К. В. Сазанова a***, С. В. Сеник a, И. Ю. Кирцидели a, А. Л. Шаварда ab

a Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН
197376 Санкт-Петербург, Россия

b Научный парк Санкт-Петербургского государственного университета
198504 Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: Ksazanova@binran.ru
** E-mail: barinova-kv@mail.ru

Поступила в редакцию 25.01.2018
После доработки 12.07.2018
Принята к публикации 01.02.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследованы адаптивные реакции арктических и антарктических штаммов психрофильных микромицетов Geomyces pannorum и Thelebolus microsporus к существованию в широком диапазоне температур. Показано, что адаптация этих видов к различным температурам обусловлена как морфологическими, так и биохимическими изменениями, в том числе концентрационными изменениями малых молекул и липидных компонентов мембран. Выявленные биохимические и морфо-физиологические механизмы имеют общие для всех изученных штаммов закономерности, а также видовые и штаммовые различия. Общие закономерности включали температуро-зависимые изменения в количестве моносахаров, некоторых дисахаридов, а также свободных линолевой и линоленовой кислот. Различия между арктическими и антарктическими штаммами были связаны, в основном, с изменением состава липидов, а видовые различия – с метаболомными изменениями. У штаммов из Артарктиды отмечена сниженная способность переживать повышенную температуру, коррелирующая со слабым, по сравнению с арктическими штаммами, проявлением липид-зависимых адаптационных механизмов. Среди штаммовых различий также отмечены высокие показатели роста и накопление маннита у арктических изолятов. Адаптация T. microsporus характеризовалась более разнообразными изменениями концентраций малых органических молекул в метаболомном профиле и выраженными морфологическими изменениями мицелия. С помощью метаболомного анализа с последующей обработкой методами мультивариантной статистики сделано предположение об увеличении дисперсии метаболомных характеристик при неблагоприятных для организма условиях и уменьшении дисперсии метаболомных данных при оптимальных условиях.

Ключевые слова: метаболомный профайлинг, липиды, адаптация, температура, психрофильные грибы, полярные регионы

Микромицеты повсеместно распространены в почвах и субстратах, в том числе в экосистемах Арктики и Антарктики, где они проявляют способность к существованию в экстремальных условиях. Метаболические процессы микроорганизмов полярных регионов осуществляются в короткие периоды при низких положительных температурах.

Арктика и Антарктика ‒ это территории, располагающиеся за полярным кругом. Для них характерны экстремальные условия низких температур, сильное оледенение и непостоянство смены дня и ночи (Larsen et al., 2015). Несмотря на некоторую разницу в климате полярных регионов (если в Антарктиде средняя температура воздуха остается отрицательной даже летом, то в арктических полярных пустынях, например, на архипелаге Северная Земля, температура летом может подниматься до 6°С), в экстремальных условиях высоких широт Арктики и Антарктики складываются близкие условия существования, что приводит к формированию комплексов микроскопических грибов, сходных по видовому составу (Cox et al., 2016). Организмы из экстремальных экосистем, таких как полярные области, являются богатым источником различных химических веществ с высокой биологической активностью (Zalar et al., 2012; Tian et al., 2017). Однако практически не исследованными остаются вопросы популяционного сходства и различий у биполярных видов.

В полярных регионах поверхностные слои грунта подвержены резким колебаниям температур, что отчасти определяет преимущественную локализацию биомассы почвенных грибов в подповерхностном слое в грунтах Антарктиды, где содержание органических веществ может быть выше, колебания суточных и сезонных температур меньше, и лучше сохраняется влажность (Марфенина и соавт., 2016). Низкие температуры, характерные для полярных регионов, обуславливают экологическую специфику микобиоты: некоторые из мицелиальных грибов, распространенных в Арктике и Антарктике, являются психрофильными видами, другие – психротолерантными (психротрофами) (Maggi et al., 2013).

Термин “психрофил” был предложен для микроорганизмов, минимальная, оптимальная и максимальная температура роста которых равна или ниже 0, 15 и 20°С соответственно (Morita, 1975). Микроорганизмы с максимумом роста при более высокой температуре получили название пситротрофных (Eddy, 1960). Психротрофные микроорганизмы обладают способностью расти при 0°C и максимальной скоростью роста при 20°C и выше (Hassan et al., 2016). Согласно Девералу (Deverall, 1968), температурный оптимум для психрофильных грибов составляет около 10°C. Большинство исследователей согласны с определением Мориты (Morita, 1975) и считают температурным оптимумом для прихрофильных грибов 15°C или ниже, тогда как для психротрофных грибов температурный оптимум выше 20°C (Robinson, 2001; Cavicchioli et al., 2002; Maheswari, 2005).

Отклонения условий окружающей среды от оптимальных параметров вызывает индукцию реакций на стресс. Снижение температуры до экстремально низких положительных значений, как и ее повышение до 20‒25°С, может являться стрессовым фактором и вызывать специфические физиологические реакции психротрофных грибов.

Адаптации грибов к температуре ниже или выше оптимума связывают, главным образом, с механизмами поддержания стабильности мембран. Есть доказательства, что свойства мембранных липидов могут определять способность грибов к существованию в определенном диапазоне температур, а важнейшим механизмом сохранения жизнеспособности клетки в условиях неблагоприятных температурных воздействий является поддержание структуры и функции мембран (Robinson, 2001; D’Amico et al., 2006; Pibernat et al., 2007; Терёшина и соавт., 2011; Turk et al., 2011).

Снижение температуры вызывает внутриклеточный окислительный стресс посредством индуцирования образования активных форм кислорода (Gocheva et al., 2009). Чтобы избежать повреждений, вызванных активными формами кислорода, аэробные клетки используют систему защитных механизмов, включающую как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные антиоксиданты, в частности ферменты, такие как супероксиддисмутаза и каталаза. У большинства антарктических грибов активность ферментов антиоксидантной защиты высока. Однако у некоторых представителей антарктической микобиоты, например, у антарктического штамма Geomyces pannorum, активность супероксиддисмутазы и каталазы низкая (Tosi et al., 2010; Krumova et al., 2012), а холодовой шок индуцирует синтез фенольных соединений, по-видимому, выполняющих неферментативную антиоксидантную защиту (Maggi et al., 2013).

Среди веществ, обладающих криопротекторной функцией, синтез которых индуцируется низкой температурой, наиболее распространенными являются глицерин, маннит и трегалоза (Феофилова и соавт., 1994; Weinsten et al., 2000). Полиолы выполняют защитную функцию, препятствуя повреждениям клеток грибов при действии стрессовых факторов, включая высокую и низкую температуру (Ruijter, 2003). Изменение концентрации полиолов является характерной для грибов физиологической адаптацией для поддержания тургорного давления (Weinstein, 1997). Адаптация к тепловому воздействию связана, главным образом, с повышением концентрации трегалозы (Thevelein, 1996; Терёшина и соавт., 2010; Феофилова и соавт., 2014). Комбинация этих механизмов необходима для жизнедеятельности психротрофных или психрофильных микроорганизмов.

У грибов различных экологических групп, а также различного систематического положения механизмы адаптации к низким и высоким температурам могут иметь свои особенности (Феофилова и соавт., 2014). Сравнительные исследования арктических штаммов и штаммов умеренных широт Hebeloma spp. показывают существенно большее накопление трегалозы у арктических видов, растущих при низких температурах. Аналогичные данные получены для грибов рода Humicola. Накопление маннита при низких температурах характерно в большей степени для грибов антарктических изолятов рода Humicola по сравнению с мезофильными штаммами, которые при низких температурах накапливают сахара (глюкозу и фруктозу) (Weinstein et al., 1997).

У психрофильных антарктических грибов Humicola marvinii, Geomyces pannorum, Mortierella elongata описаны различные физиологические реакции на изменение температуры. При низких температурах в мицелии H. marvinii внутриклеточно накапливалась, в основном, трегалоза и внеклеточно ‒ глицерин. Температурная адаптация мицелия G. pannorum заключалась, главным образом, в изменении состава липидов. Культура Mortierella elongata, выращенная при низкой температуре, характеризовалась отсутствием определяемого эргостерина и увеличением содержания трегалозы (Weinstein et al., 2000).

Литературные данные указывают на многообразие физиологических адаптивных механизмов к температурному стрессу. Сведения же о штаммовой и популяционной вариабельности этих механизмов довольно ограничены. Практически не исследованными остаются вопросы популяционного сходства и различий адаптаций у биполярных видов.

В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов к анализу биохимических изменений организма при воздействии какого-либо фактора является метаболомный профайлинг. Исследование состава экстрактов, полученных с помощью исчерпывающей экстракции метанолом, с последующим статистическим анализом позволяет как выявить концентрационные изменения индивидуальных метаболитов, так и визуализировать системные изменения метаболитной сети организмов. В данной работе с помощью метаболомного подхода, анализа липидов, а также морфолого-культуральных методов были исследованы адаптивные реакции арктических и антарктических штаммов Geomyces pannorum и Thelebolus microsporus к высоким и низким температурам. Данные виды являются доминирующими в комплексах микромицетов высоких широт (Кирцидели и соавт., 2010; Власов и соавт., 2012).

Цель работы состояла в сравнительном анализе биохимических и морфо-физиологических адаптационных механизмов биполярных штаммов G. pannorum и T. microsporus к существованию в широком диапазоне температур.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культуральные и морфологические исследования. Для исследования были выбраны штаммы Geomyces pannorum (Pseudogymnoascus pannorum (Link) Minnis & D.L. Lindner) и Thelebolus microsporus (Berk. & Broome) Kimbr. Использовались изоляты, выделенные из грунтов Антарктиды ‒ G. pannorum (Ant165) MG586988 и T. microsporus (Ant170) MG586989; из почв полярных пустынь Арктики ‒ G. pannorum (ISV620) MG586990 и T. microsporus (ISV18) MG586980. Культуры микроскопических грибов выращивали в чашках Петри на стандартной среде Чапека в течение двух недель при температурах 2, 12 и 22°С. При микроскопировании использовали стереоскопический микроскоп SteREO Discovery V20, а также атомно-силовой микроскоп Integra-Aura.

Метаболомный анализ. Для метаболомных исследований навеска мицелия составляла 100‒300 мг сухой массы. Точную массу учитывали при количественных расчетах и построении метаболитной матрицы. Мицелий растирали в жидком азоте, экстрагировали метанолом (5 мл) и центрифугировали (10 мин, 400 g). Супернатант перемещали в виалы, а осадок экстрагировали вторично (5 мл метанола) и центрифугировали при тех же условиях. Далее экстракты объединяли и выпаривали на вакуумном роторном испарителе при 40°С.

Анализ проводили методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) на приборе Agilent с масс-селективным детектором 5975 (США), колонка HP-5MS, 30 м × 0.25 мм. Хроматографирование проводили при линейном программировании температуры от 70 до 320°C со скоростью 4°C/мин. Газ-носитель – He; постоянная скорость потока ‒ 1.0 мл/мин. Сбор данных осуществляли с помощью программного обеспечения Agilent ChemStation. Обработку и интерпретацию масс-спектрометрической информации проводили с использованием программы AMDIS (http://www.amdis.net/ index.html) и стандартной библиотеки NIST2005. Количественная интерпретация хроматограмм проводилась методом внутренней стандартизации по углеводороду С23 с помощью программы UniChrom (http://www.unichrom.com/unichrome.shtml).

Анализ липидов и жирных кислот. Экстракцию липидов из мицелия проводили по методу Николса (Nichols, 1963) с модификациями: гомогенизировали мицелий с изопропанолом и выдерживали его последовательно в изопропаноле (30 мин при 70°С), а затем в смеси изопропанол‒хлороформ (1 : 1) (30 мин при 70°С). Объединенные экстракты упаривали, растворяли в смеси хлороформ‒метанол (1 : 1), добавляли 2.5% раствор NaCl для очистки от водорастворимых примесей. После разделения хлороформный слой декантировали, выпаривали, остаток растворяли в смеси хлороформ‒метанол (1 : 1) и хранили при ‒20°С.

Индивидуальные классы полярных липидов анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем 60 10 × 10 см (“Merck”, Германия) в системе растворителей: хлороформ‒метанол‒вода (65 : 25 : 4) в первом направлении и хлороформ‒ацетон‒метанол‒уксусная кислота‒вода (50 : 20 : 10 : 10 : 5) – во втором направлении (Benning et al., 1995). Нейтральные липиды разделяли в системе толуол–гексан–муравьиная кислота (35 : 15 : 0.25), затем в том же направлении до 2/3 высоты пластины в системе гексан–диэтиловый эфир–муравьиная кислота (30 : 20 : 0.5). Липиды идентифицировали, сравнивая их Rf с Rf стандартных свидетелей, а также по реакциям со специфическими реагентами на отдельные функциональные группы (Кейтс, 1975). Для определения количества липидов хроматограммы опрыскивали 5% серной кислотой в этаноле и нагревали при 160°С, затем рассчитывали содержание отдельных классов липидов денситометрически с использованием прибора Денскан (“Ленхром”, Россия) и программы DENS-14-12-03 в режиме линейной аппроксимации по калибровочным кривым, построенным по стандартным растворам фосфатидилхолина (ФХ) и цереброзидов (“Lаrodаn”, Швеция).

Состав жирных кислот липидов исследовали методом ГХ-МС. Жирные кислоты (ЖК) определяли в виде метиловых эфиров, полученных с помощью гидролиза фракции полярных липидов в 2.5% серной кислоте в метаноле при 70°С в течение 2 ч (Кейтс, 1975). Фракцию полярных липидов получали, разделяя общий липидный экстракт методом ТСХ в системе для нейтральных липидов, описанной выше, полярные липиды снимали со старта, элюировали из силикагеля в смеси хлороформ‒метанол (1 : 1), центрифугировали, супернатант упаривали. Идентификацию жирных кислот полученной фракции производили методом ГЖХ-МС на хроматографе Маэстро (“Интерлаб”, Россия), собранном на основе Agilent 7820А с MSD 5975. Анализ осуществлялся на капиллярной колонке Supelco OmegaWax 250 (США) длиной 30 м × 0.25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0.25 мкм. Режим хроматографа: газ-носитель – He; постоянная скорость потока ‒ 1.0 мл/мин; деление потока – 1 : 20; температура испарителя – 250°С; температура термостата – 170°С в течение 3 мин, затем линейное повышение до 220°С со скоростью 4°С/мин. Индекс ненасыщенности (ИН) рассчитывали по формуле ИН = ∑РJ/100, где РJ ‒ содержание ненасыщенных ЖК (%), умноженное на число двойных связей в каждой кислоте (Макаренко и соавт., 2010).

Статистический анализ был выполнен с помощью программы Microsoft Excel. Обработка метаболомных данных осуществлялась с помощью метода главных компонент (РСА-анализ) с использованием надстройки Multibase. Эксперимент был выполнен в трех биологических повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

У всех изученных штаммов наблюдались температурозависимые особенности ростовых и морфолого-культуральных характеристик. По предварительным наблюдениям наибольшие показатели активности роста (диаметр колонии) у всех изученных штаммов отмечались при температуре около 12°С. При более низких (2°С) и высоких (22°С) температурах рост всех штаммов замедлялся, за исключением арктического штамма G. pannorum, показатели роста которого при 22 и 12°С не различались (рис. 1, 2). При температуре 12‒22°С антарктические штаммы обоих видов уступали по данному показателю арктическим изолятам, что позволяет сделать предположение о снижении адаптационного потенциала к температуре выше 12°С у штаммов, длительное время существовавшим в условиях Антарктиды.

Рис. 1.

Динамика роста G. pannorum при разных температурах: а – антарктический штамм; б – арктический штамм (1 ‒ 22°С; 2 – 12°С; 3 – 2°С).

Рис. 2.

Динамика роста T. microsporus при разных температурах: а – антарктический штамм; б – арктический штамм (1 ‒ 22 °С; 2 – 12°С; 3 – 2°С).

Морфологические изменения биполярных штаммов при росте в различных температурных условиях были практически одинаковы. Видовые особенности изменения морфологии при разных температурах были существенными.

Выращенные при температуре 2°С культуры T. microsporus были представлены мицелием и аскоспорами, а при 12°С было отмечено образование многочисленных хламидоспор (артроспор) и отсутствие аскоспор (рис. 3). Повышение температуры до 22°С вызывало изменения морфологии мицелия, которые выражались в диморфизме – формировании дрожжеподобных клеток. Аскоспоры при 2°С были стандартными, при более высоких температурах просто отсутствовали (т.е. отсутствовали плодовые тела и сумки с аскоспорами). Проявление мицелиально-дрожжевого диморфизма под воздействием стресса у грибов сопряжено с существенными изменениями биосинтетических, энергетических процессов и структурно-морфологических характеристик, что имеет адаптивный характер и направлено на поддержание жизнеспособности организма в изменившихся условиях. Диморфизм определяет жизненную стратегию грибов путем образования клеток альтернативных морфотипов, обеспечивающих рост и выживание культуры в различных (в том числе стрессовых) условиях (Ricardo et al., 2007).

Рис. 3.

Морфологические адаптивные структуры у микроскопического гриба полярных пустынь T. microsporus: а ‒ гифы психрофильного гриба при температуре 2°С; б ‒ формирование хламидоспор при температуре 12°С; в, г ‒ формирование дрожжеподобных клеток при температуре 22°С.

У G. pannorum конидиальное спороношение (артроспоры) наблюдалось при всех исследованных температурах. Изменения касались, главным образом, макроморфологии колонии (окраска) и мицелия. Повышение температуры до 22°С приводило к образованию коремиеподобных структур и более интенсивной пигментации (что не отмечается при температурах, естественных для полярных пустынь). Кроме того, при повышении температуры (22°С) наблюдалось образование хламидоспор. Переход к дрожжеподобным структурам не был отмечен. При 2 и 12°С морфологические характеристики колоний G. pannorum были сходны.

Исследование артроспор с использованием атомно-силового микроскопа не выявило значительных различий в размерах и форме спор G. pannorum. Таким образом, у изолятов обоих видов микромицетов происходит образование клеток альтернативных морфотипов, способствующих выживанию культуры в стрессовых для них условиях.

В составе метанольных экстрактов мицелия G. pannorum и T. microsporus было обнаружено более 100 низкомолекулярных органических веществ, среди которых доминировали аминокислоты, сахароспирты, кислоты цикла Кребса, моно- и дисахариды, гликозиды, жирные кислоты. Исследование состава низкомолекулярных метаболитов, присутствующих в мицелии G. pannorum и T. microsporus, позволили выявить ряд общих закономерностей изменения метаболома грибов в зависимости от температуры. Полученная в результате анализа данных методом главных компонент (PCA-анализа) статистическая модель показала распределение в пространстве главных компонент кластеров, характеризующих метаболом G. pannorum и T. microsporus при разных температурах (рис. 4, 5), что указывает на глубокие изменения метаболизма грибов под воздействием температурного фактора. У обоих штаммов T. microsporus и антарктического штамма G. pannorum наблюдалась наименьшая дисперсия точек, характеризующих биохимическое состояние объекта при 12°С, т.е. в условиях температурного оптимума роста. У арктического штамма G. pannorum наименьшая дисперсия была при 22°С. Именно у этого штамма рост не замедлялся при температуре 22°С. Дисперсия точек в пространстве главных компонент определяется количественными изменениями множества соединений, составляющих метаболитную матрицу, а также корреляционной структурой метаболитной сети. В состоянии приспособления к новым, отличным от оптимальных, условиям структура метаболитной сети колонии микромицетов меняется. Различия в дисперсии данных, скорее всего, связаны с многообразием ответных реакций организма на изменяющиеся условия среды, которые могут иметь индивидуальные особенности. Несмотря на то, что при анализе конкретных соединений, обсуждаемых ниже, прослеживаются четкие достоверно значимые изменения их содержания при различных температурах, адаптация проявляется также в индивидуальных изменениях метаболитной сети колоний, которые и вносят вклад в дисперсию точек внутри группы (экспериментальной выборки образцов, выращенных при одной температуре). Таким образом, по-видимому, в измененных условиях, отличных от оптимальных, метаболитная сеть более склонна к проявлению новых индивидуальных состояний.

Рис. 4.

РСА-анализ малых молекул в составе мицелия G. pannorum при различных температурах: (а) ‒ антарктический; (б) ‒ арктический штамм.

Рис. 5.

РСА-анализ малых молекул в составе мицелия T. microsporus при различных температурах: (а) ‒ антарктический; (б) ‒ арктический штамм.

Среди метаболитов G. pannorum наиболее существенное влияние на кластеризацию данных оказывали моно- и дисахариды, свободные линолевая и линоленовая кислоты. У T. microsporus наибольший вклад в кластеризацию данных вносили маннит, арабит, мио-инозит, эргостерин, пролин, фруктоза, трегалоза, свободные линолевая, линоленовая кислоты. Среди метаболитов, оказывающих наибольший вклад в формирование биохимических различий мицелия грибов при различной температуре, количественный анализ был выполнен для маннита, арабита, трегалозы, глюкозы и фруктозы (рис. 6). Из перечисленных соединений трегалоза и полиолы являются важнейшими соединениями, выполняющими криопротекторную и термопротекторную функции. Повышенные концентрации трегалозы обнаружены у психрофильных грибов, подверженных холодовому стрессу (Robinson, 2001). В тоже время у мезофильных штаммов Aspergillus niger увеличение концентрации трегалозы наблюдалось при тепловом шоке, но не при воздействии низких температур. Предполагается, что трегалоза участвует в стабилизации структуры мембран (Терёшина и соавт., 2011). Изменение концентрации полиолов также является распространенной физиологической реакцией грибов на изменение температуры (Феофилова и соавт., 1994; Weinsten et al., 2000). Показано, что полиолы выполняют криопротекторную функцию путем понижения температуры замерзания жидкости (Ricardo et al., 2007).

Рис. 6.

Содержание фруктозы (1), маннита (2) и трегалозы (3) в мицелии G. pannorum (а); T. microsporus (б) при разных температурных условиях.

В наших экспериментах адаптация к температурному стрессу (как к низким, так и к высоким температурам) у T. microsporus включала накопление трегалозы и маннита. У G. pannorum трегалоза накапливалась только при низкой температуре, параллельно с глюкозой и рядом неидентифицированных дисахаридов, а при 22°С их содержание было минимальным. Аналогичная тенденция была характерна для неидентифицированных дисахаридов и глюкозы в мицелии T. microsporus. Фруктоза у обоих видов грибов накапливалась главным образом только при 2°С. При температуре 12°С ее концентрации были минимальными, а при 22°С несущественно выше, чем при 12°С. Изменение концентраций моносахаров в мицелии может быть связано с изменением интенсивности энергетического метаболизма грибов при различных температурах.

Несмотря на различия в особенностях роста арктических и антарктических штаммов одного вида, для них были характерны сходные биохимические изменения при действии высоких и низких температур. Однако оба арктических штамма отличались повышенным содержанием маннита.

Общей особенностью адаптации обоих видов грибов к температурному стрессу явилось максимальное накопление свободных линолевой и линоленовой кислот при 2°С (на 30‒40% больше, чем при 12°С) и минимальное содержание их при 22°С (на 10‒15% ниже, чем при 12°С).

У всех изученных штаммов наблюдались температурозависимые изменения в общем количестве и составе мембранных и запасных липидов. Антарктические штаммы обоих видов микромицетов продемонстрировали тенденцию к накоплению липидов при понижении температуры до 2°С (табл. 1). Содержание липидов у арктических штаммов в этих условиях не изменилось. Повышение температуры до 22°С вызывало еще более интенсивное накопление липидов у обоих антарктических штаммов, а также у арктического штамма T. microsporus.

Таблица 1.  

Изменение содержания липидов в мицелии G. pannorum и T. microsporus при разных температурных условиях

Температура, °С Содержание общих липидов,
% от сухой биомассы
Соотношение ФХ/ФЭ
G. pannorum T. microsporus G. pannorum T. microsporus
Антарктида Арктика Антарктида Арктика Антарктида Арктика Антарктида Арктика
2 13.2 ± 0.1 8.2 ± 2.3 6.9 ± 1.0 4.6 ± 0.7 0.7 ± 0.02 0.8 ± 0.03 1.1 ± 0.05 0.9 ± 0.05
12 11.2 ± 0.3 8.3 ± 0.5 5.5 ± 0.5 4.7 ± 0.2 1.0 ± 0.07 0.9 ± 0.04 1.1 ± 0.02 1.4 ± 0.30
22 18.0 ± 0.3 7.0 ± 0.6 8.9 ± 3.1 12.6 ± 0.9 1.2 ± 0.10 1.6 ± 0.09 1.6 ± 0.03 2.0 ± 0.28

Все изученные штаммы в качестве основных мембранных липидов содержали фосфатидилхолины (ФХ) и фосфатидилэтаноламины (ФЭ), в меньшем количестве – фосфатидилсерины (ФС), фосфатидилинозиты (ФИ), фосфатидные кислоты (ФК) и дифосфатидилглицерины (ДФГ). В составе сфинголипидов были выявлены гликоцерамиды (ГлЦер) (рис. 7). Основным классом запасных липидов у обоих видов грибов являются триацилглицерины (ТАГ) ‒ до 5% от сухой массы мицелия, а у T. microsporus также накапливаются эфиры стеринов (ЭС) ‒ до 1.1% от сухой массы мицелия (рис. 8).

Рис. 7.

Состав полярных липидов G. pannorum (а) и T. miсrosporus (б) в условиях роста при разных температурах: 1 – ФХ; 2 – ФЭ; 3 – ФС; 4 – ФК; 5 – ДФГ; 6 – ГлЦер.

Рис. 8.

Состав нейтральных липидов G. pannorum (а) и T. miсrosporus (б) в условиях роста при разных температурах. 1 – триацилглицерины; 2 – эфиры стеринов.

Согласно гипотезе J.R. Hazel (1995), одним из важных механизмов адаптации мембран к изменениям температуры является способность клетки поддерживать баланс “бислойных” (ФХ) и “небислойных” (ФЭ, ФК) липидов. Механизмы реструктуризации мембраны при понижении температуры включают увеличение пропорции липидов, дестабилизирующих бислойную мембрану, а эффекты воздействия высоких температур компенсируются уменьшением доли “небислойных” липидов, что позволяет клетке законсервировать фазовое состояние мембраны, необходимое для нормального физиологического состояния (McElhaney, 1984). Однако это правило соблюдается не всегда, как, например, в случае адаптации базидиомицета Flammulina velutipes к гипотермии, у которого доля ФЭ, наоборот, снижалась, а сохранение функционального состояния мембраны происходило, по всей видимости, за счет включения альтернативных механизмов (Терёшина и соавт., 2011). У всех изученных в данном исследовании штаммов в ответ на изменение температуры культивирования соотношение ФХ/ФЭ менялось в согласии с гипотезой J.R. Hazel: понижение температуры до 2°С приводило к увеличению доли “небислойного” ФЭ, а увеличение температуры – к его уменьшению (табл. 1). Причем у антарктического штамма G. pannorum увеличение доли ФЭ при низкой температуре было выражено более ярко, чем у арктического штамма, а у антактического штамма T. microsporus индекс ФХ/ФЭ при понижении температуры, наоборот, не изменился.

Эргостерин, основной стерин в мембранах грибов, по данным метаболомного анализа, в мицелии арктического штамма T. microsporus содержался в максимальном количестве при 22°С (5 мг/г сухой массы), а в минимальном – при 2°С (на 45‒80% ниже, чем при 22°С). У антарктического штамма тенденция к увеличению содержания эргостерина при повышении температуры была выражена не столь ярко (от 1 мг/г при 2 и 12°С до 2 мг/г при 22°С). Такая динамика содержания эргостерина, вероятно, связана со способностью стеринов стабилизировать мембрану, увеличивая ее толщину и плотность упаковки липидов (Yeagle, 1991; Ernst, 2016). У G. pannorum эргостерин был обнаружен лишь в небольших количествах (менее 0.5 мг/г), и достоверно значимой зависимости его накопления в мицелии от температуры не прослеживалось.

Из литературы хорошо известно, что ключевым механизмом адаптации к высоким температурам является поддержание вязкости мембран посредством снижения доли ненасыщенных ЖК (Sinensky, 1974; Los, 2004). Адаптация к низким температурам, в свою очередь, связана с увеличением степени ненасыщенности липидов (Maggi et al., 2013). По нашим данным, при повышении температуры с 12 до 22°С индекс ненасыщенности полярных липидов ожидаемо уменьшился у всех штаммов (табл. 2). Вместе с тем, удивительно, что при понижении температуры с 12 до 2°С этот показатель не вырос, а у антарктического штамма G. pannorum даже уменьшился.

Таблица 2.  

Состав жирных кислот фракции полярных липидов (% от суммы) в условиях роста при разных температурах

Штамм Т, °С C14:0 C15:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 ИН
G. pannorum
Антарктида
2 0.3 0.2 12.7 10.2 1.2 15.1 47.7 12.4 1.58
12 0.2 0.3 9.1 1.4 0.5 10.4 71.0 7.0 1.75
22 0.5 0.9 17.7 4.9 0.9 41.4 30.9 2.7 1.16
G. pannorum
Арктика
2 0.2 0.1 10.8 3.3 0.5 8.0 41.7 35.4 2.01
12 0.0 0.2 8.2 0.0 0.3 5.3 61.9 24.1 2.01
22 0.3 3.4 11.2 1.2 0.7 14.0 68.5 0.6 1.54
T. microsporus
Антарктида
2 0.5 0.2 11.4 1.4 0.8 3.4 60.5 21.7 1.91
12 0.1 0.2 4.8 0.9 0.4 2.9 84.4 6.4 1.92
22 0.6 0.5 10.3 2.9 1.3 19.2 64.6 0.7 1.53
T. microsporus
Арктика
2 0.2 0.1 11.3 0.9 1.0 4.0 44.6 37.9 2.08
12 0.1 0.2 7.2 1.3 0.5 5.1 70.7 14.8 1.92
22 0.7 0.6 9.3 0.8 2.1 26.7 58.9 1.0 1.48

В ходе адаптации к температурному стрессу также происходили изменения в составе запасных липидов. У большинства штаммов любое отклонение от термооптимума – как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения температуры – сопровождалось накоплением ТАГ (рис. 8). Такая тенденция отсутствовала только у арктического штамма G. pannorum. Кроме триглицеридов, у T. microsporus в неблагоприятных температурных условиях накапливался другой класс запасных липидов – эфиры стеринов (рис. 8).

Следует особо отметить штаммовые различия изученных биполярных видов. При 22°С у арктического штамма G. pannorum ростовые характеристики не изменялись по сравнению с 12°С, при этом вдвое снижалось количество мембранных липидов (рис. 7), отсутствовала тенденция к накоплению ТАГ, сильно увеличивался показатель ФХ/ФЭ (табл. 1) и уменьшался индекс ненасыщенности липидов (табл. 2). Антарктический штамм при 22°С, наоборот, демонстрировал увеличение количества мембранных липидов и ТАГ, доля ФХ в мембране увеличивалась незначительно, но степень ненасыщенности ацильных цепей в полярных липидах уменьшалась, как и в арктическом штамме (в основном, за счет уменьшения доли линолевой кислоты; С18:2). Слабое проявление адаптационных реакций штамма из Антарктиды, по всей видимости, отражает снижение способности переживать условия с повышенной температурой. Разницу в механизмах адаптации к холоду между штаммами биполярных видов иллюстрирует тенденция к накоплению липидов при понижении температуры до 2°С у антарктических штаммов обоих видов и отсутствие этой реакции у арктических штаммов.

Таким образом, при адаптации к высоким и низким температурам микромицеты демонстрировали видовую и штаммовую специфичность адаптивных физиологических реакций. Результаты морфолого-культуральных исследований показали, что исследованные штаммы микромицетов являются психротолерантными. Тем не менее, арктические штаммы обоих видов уступают по радиальной скорости роста арктическим изолятам, что позволяет предполагать снижение адаптационного потенциала к высокой температуре антарктических штаммов.

Видовые различия были обусловлены, главным образом, концентрационными изменениями метаболитов, которыe имели место в условиях роста при различных температурах. Адаптация к температурному стрессу T. microsporus сопровождалась более разнообразными, по сравнению с G. pannorum, изменениями концентраций малых органических молекул в метаболомном профиле, что, скорее всего, связано со значительными морфологическими изменениями мицелия, наблюдаемыми у T. microsporus при температурном стрессе.

Физиологический отклик на действие высоких и низких температур у T. microsporus был связан в значительной степени с полиолами (в первую очередь с маннитом), сахарами, эргостерином, эфирами стеринов. Биохимические изменения G. pannorum под действием низких температур были опосредованы в основном сахарами, составом глицеролипидов и жирных кислот. Общей закономерностью для обоих видов грибов явилось уменьшение степени ненасыщенности ацильных цепей полярных липидов при повышении температуры.

Полученные данные позволили выявить новые закономерности концентрационных изменений метаболитов при адаптации к разным термоусловиям. Тенденция изменений содержания в мицелии сахаров и полиолов либо является общей закономерностью для обоих видов, либо видовым признаком, но не меняется у разных штаммов одного вида, несмотря на различие в скорости роста. Изменения же состава липидов зависит как от вида, так и от штамма организма, причем в некоторых случаях штаммовые различия даже более значимы, чем видовые.

Результаты выполненного исследования впервые показали видовые и штаммовые различия у биполярных видов на уровне метаболома организма. С помощью метаболомного анализа с последующей обработкой методами мультивариантной статистики сделано предположение об увеличении дисперсии метаболомных характеристик при неблагоприятных для организма условиях и уменьшении дисперсии метаболомных данных при оптимальных условиях. Впервые показано, что видовые различия микромицетов T. microsporus и G. pannorum связаны с метаболомными изменениями, а штаммовые коррелируют в большей степени с изменением состава липидов. Исследования более общих систематических и популяционных адаптивных механизмов грибов требует большей выборки объектов и будет продолжено.

БЛАГОДАРНОСТИ

Микроскопирование проводилось на оборудовании ЦКП БИН РАН.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнялась в рамках госзаданий согласно тематическому плану БИН РАН по темам № 01201255604 и № АААА-А18-118032390136-5, гранту РФФИ 16-04-01649 и Программе фундаментальных исследований Президиума РАН.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Власов Д.Ю., Зеленская М.С., Кирцидели И.Ю., Абакумов Е.В., Крыленков В.А., Лукин В.В. Грибы на природных и антропогенных субстратах в западной Антарктике // Микология и фитопатология. 2012 Т. 46. № 1. С. 20‒26.

  2. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. М.: Мир, 1975. 322 с.

  3. Кирцидели И.Ю., Власов Д.Ю., Абакумов Е.В., Гиличинский Д.А. Разнообразие и ферментативная активность микромицетов из почв Антарктики // Микология и фитопатология. 2010. Т. 44. № 5. С 442‒453.

  4. Макаренко С.П., Константинов Ю.М., Шмаков В.Н., Коненкина Т.А. Жирнокислотный состав липидов каллусов двух видов сосны Pinus sibirica и Pinus sylvestris // Физиология растений. 2010. Т. 57. № 5. С. 791–795.

  5. Марфенина О.Е., Никитин Д.А., Иванова А.Е. Структура грибной биомассы и разнообразие культивируемых микромицетов в почвах Антарктиды (станции Прогресс и Русская) // Почвоведение. 2016. № 8. С. 991–999.

  6. Терёшина В.М., Меморская А.С., Котлова Е.Р., Феофилова Е.П. Состав мембранных липидов и углеводов цитозоля в условиях теплового шока у Aspergillus niger // Микробиология. 2010. Т. 79. № 1. С. 45–51.

  7. Tereshina V.M., Memorskaya A.S., Kotlova E.R. Feofilova E.P. Membrane lipid and cytosol carbohydrate composition in Aspergillus niger under heat shock // Microbiology (Moscow). 2010. V. 79. P. 40‒46.

  8. Терёшина В.М., Меморская А.С., Котлова Е.Р. Влияние различных тепловых воздействий на состав мембранных липидов и углеводов цитозоля у мицелиальных грибов // Микробиология. 2011. Т. 80. № 4. С. 447–453.

  9. Tereshina V.M., Memorskaya A.S., Kotlova E.R. The effect of different heat influences on composition of membrane lipids and cytosol carbohydrates in mycelial fungi // Microbiology (Moscow). 2011. V. 80. P. 455‒460.

  10. Феофилова Е.П., Усов А.И., Мысякина И.С., Кочкина Г.А. Трегалоза: особенности химического строения, биологические функции и практическое значение // Микробиология. 2014. Т. 83. № 3. С. 271–283.

  11. Feofilova E.P., Usov A.I., Mysyakina I.S., Kochkina G.A. Trehalose: chemical structure, biological functions, and practical application // Microbiology (Moscow). 2014. V. 83. P. 184‒194.

  12. D’Amico S., Collins T., Marx J-C., Feller G., Gerday C. Psychrophilic microorganisms: Challenges for life // EMBO. 2006. Rep 7. V. 4. P. 385–389.

  13. Benning C., Huang Z.H., Gage D.A. Accumulation of a novel glycolipid and a betaine lipid in cell of Rhodobacter sphaeroides grown under phosphate limitation // Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 317. P. 103‒111.

  14. Cavicchioli R.K., Siddiqui S., Andrews C., Sowers K.R. Low-temperature extremophiles and their application // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. V. 13. P. 1–9.

  15. Cox F., Newsham K.K., Bol R., Dungait J.A.J., Robinson C. Not poles apart: Antarctic soil fungal communities show similarities to those of the distant Arctic // Ecology Lett. 2016. V. 19. P. 495‒592.

  16. Deverall B.J. Psychrophiles // The Fungi an Advanced Treatise / Eds. Ainsworth G.C., Sussman A.S. New York: Academic Press, 1968. P. 129–135.

  17. Ernst R., Ejsing C.S., Antonny B. Homeoviscous adaptation and the regulation of membrane lipids // J. Mol. Biol. 2016. V. 428. Iss. 24. Part A. P. 4776‒4791.

  18. Hassan N., Rafiq M., Hayat M., Shah A.A., Hasan F. Psychrophilic and psychrotrophic fungi: a comprehensive review // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2016. V. 15. P. 147–172.

  19. Gocheva Y.G., Tosi S., Krumova E.T. Temperature downshift induces antioxidant response in fungi isolated from Antarctica // Extremophiles. 2009. V. 13. P. 273–281.

  20. Krumova E., Abrashev R., Kostadinova N., Dishlijska V., Miteva-Staleva J., Pashova S. Novel cold-active antioxidant enzymes from Antarctic fungi // N. Trends Microbiol. 2012. V. 15. P. 291–305.

  21. Larsen J.N., Anisimov O.A., Constable A., Hollowed A.B., Maynard N., Prestrud P., Prowse T.D., Stone J.M.R. Polar regions // Climate Change: Impacts, Adaptation and Vulnerability. Part B. Regional Aspects: Working Group II Contribution to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. 2015. P. 1567‒1612.

  22. Life in Extreme Environments / Eds. Ricardo A.P., Cynan E.-E., Helmut H.-S. Springer, 2007. 450 p.

  23. Los D.A., Murata N. Membrane fluidity and its roles in the perception of environmental signals // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1666. P. 142‒157.

  24. Maheswari R. Fungal biology in the 21st century // Curr. Sci. 2005. V. 88. P. 1406–1418.

  25. Maggi O., Tosi S., Angelova M., Lagostina E., Fabbri A.A., Pecoraro L., Altobelli E., Picco A.M., Savino E., Branda E., Turchetti B., Zotti M., Vizzini A., Buzzini P. Adaptation of fungi, including yeasts, to cold environments // Plant Biosystems. 2013. V. 147. P. 247–258.

  26. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria // Bacteriol. Rev. 1975. V. 39. P. 144–167.

  27. Nichols B.W. Separation of the lipids of photosynthetic tissues: improvements in analysis by thin-layer chromatography // Biochem. Biophys. Acta. 1963. V. 70. P. 417–425.

  28. Robinson C.H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi // New Phytologist. 2001. V. 151. P. 341–353.

  29. Ruijter G.J.G., Bax M., Patel H., Flitter S.J., van de Vondervoort P.J.I., de Vries R.P., vanKuyk P.A., Visser J. Mannitol is required for stress tolerance in Aspergillus niger conidiospores // Eukaryot. Cell. 2003. V. 2. P. 690‒698.

  30. Sinensky M. Homeoviscous adaptation – a homeostatic process that regulates the viscosity of membrane lipids in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 522‒525.

  31. Thevelein J.M. Regulation of trehalose metabolism and its relevance to cell growth and function // The Mycota. III. Biochemistry and Molecular Biology. 1996. V. 3. P. 395‒420.

  32. Tian Y., Li Y.-L., Zhao F.-C. Secondary metabolites from polar organisms // Mar. Drugs. 2017. V. 15. P. 28.

  33. Tosi S., Kostadinova N., Krumova E., Pashova S., Dishliiska V., Spassova B. Antioxidant enzyme activity of filamentous fungi isolated from Livingston Island Maritime // Antarctica. Polar Biol. 2010. V. 33. P. 1227–1237.

  34. Turk M., Plemenitas A., Gunde-Cimerman N. Extremophilic yeasts: Plasma-membrane fluidity as determinant of stress tolerance // Fungal Biol. 2011. V. 115. P. 950–958.

  35. Weinstein R.N., Palm M.E., Johnstone K., Wynn-Williams D.D. Ecological and physiological characterisation of Humicola marvinii, a new psychrophilic fungus from fellfield soils in the maritime Antarctic // Mycologia. 1997. V. 89. P. 706–711.

  36. Weinstein R.N., Montiel P.O., Johnstone K. Influence of growth temperature on lipid and soluble carbohydrate synthesis by fungi isolated from fellfield soil in the maritime Antarctic // Mycologia. 2000. V. 92. P. 222‒229.

  37. Yeagle P.L. Modulation of membrane function by cholesterol // Biochimie. 1990. V. 73. P. 1303‒1310.

  38. Zalar P., Sonjak S., Gunde-Cimerman N. Fungi in polar environments // Polar Microbiology: Life in a Deep Freeze / Eds. Miller R., Whyte L. Washington, DC: ASM Press, 2012. P. 79‒94.

Дополнительные материалы отсутствуют.