Микробиология, 2019, T. 88, № 5, стр. 619-623

Спорообразующие сульфатредуцирующие бактерии, до недавнего времени объединяемые в род Desulfotomaculum, являются типичными обитателями подземных термальных биотопов (Aüllo et al., 2013; Frank et al., 2016). Образование спор, способность к автотрофии и устойчивость к высоким температурам позволяет этой группе успешно колонизовать глубинные воды. В 2018 году была проведена ревизия Desulfotomaculum, в результате которой выделены четыре новых рода Desulfallas, Desulfofundulus, Desulfofarcimen и Desulfohalotomaculum (Watanabe et al., 2018).

Самоизливающиеся нефтепоисковые скважины дают хорошую возможность получить доступ к воде из термальных горизонтов, расположенных на глубине нескольких километров. Кроме того, артезианская вода, поступающая под давлением из скважины, исключает возможность загрязнения поверхностными микроорганизмами. К настоящему времени основным источником информации о микроорганизмах, населяющих подземные воды, являются молекулярные методы, основанные на высокопроизводительном секвенировании. Культивирование многих организмов, чье присутствие зафиксировано молекулярными подписями, не приводило к успеху (Labonté et al., 2015). В наших попытках усовершенствовать подходы к культивированию представителей подземной биосферы мы обратили внимание на микробные обрастания, которые часто формируются в местах излива подземных скважин. Некоторые термофилы, поступающие из глубинных горизонтов, могут накапливаться в микробных матах, где сохраняется повышенная температура и появляется доступ к органическим соединениям, образуемым фототрофами. Хорошим примером служит получение чистой культуры Melioribacter roseus, выделенного из микробного обрастания в месте излива термальной нефтепоисковой скважины, что в конечном итоге привело к описанию нового филума (Podosokorskaya et al., 2013).

Целью настоящего исследования было выделение термофильных сульфидогенных микроорганизмов из микробных матов, образующихся на изливе термального источника в поселке Жемчуг Тункинского района республики Бурятия.

Нефтепоисковая скважина глубиной около 1 км была пробурена в 50-х годах ХХ в. В настоящее время термальная вода поступает с горизонта 834–864 м и используется для лечебных целей. Термальная вода содержит сероводород, являющийся бальнеологическим компонентом, поэтому культивирование было направлено на выделение сульфатвосстанавливающих микроорганизмов.

Физико-химические параметры термальной воды, рН, температуру и окислительно-восстановительный потенциал, измеряли на изливе скважины рН-метром HI83141 (“Hanna Instruments”). Концентрацию сероводорода измеряли из проб, зафиксированных ацетатом цинка, спектрофотометрически, а элементный состав воды – масс-спектрометрией с индуктивно-связанной плазмой как описано ранее (Karnachuk et al., 2008, Mardanov et al., 2016). Для получения накопительных культур сульфидогенов была использована пресноводная среда Видделя-Бака (WB) с добавлением растворов микроэлементов, витаминов, смеси селената и вольфрамата, и восстановленная раствором сульфида натрия (Widdel, Bak, 1992). В качестве доноров электронов и источников углерода использовали 7.5 мМ формиат, 9 мМ ацетат, 7.3 мМ лактат, 13.5 мМ пропионат, 7 мМ изобутират, а также пептон, желатин (каждый в концентрации 1%) и целлюлозу (100 мг на флакон объемом 12 мл). Во флаконы со средой помещали небольшое количество матов, после чего инкубировали при температуре 50°С. Филогенетическое положение изолятов определяли по последовательности гена 16S рРНК после амплификации с праймерами 27F-1492R. Выделение ДНК и условия амплификации описаны ранее (Frank et al., 2016). Номера доступа гена 16S рРНК в GenBank NCBI – MK802128 и MK788234.

В момент отбора проб микробных матов температура воды составляла 54.8°С, рН 6.75, низкий окислительно-восстановительный потенциал, –238 mV, свидетельствовал о восстановленных условиях (табл. 1). Вода имела выраженный запах сероводорода, концентрация которого составляла 0.93 мг/л.

Были получены накопительные культуры, активно продуцирующие сероводород на среде с изобутиратом и ацетатом. Выделение чистых культур проводили путем последовательных десятикратных разведений. Наблюдение накопительных культур под микроскопом показало присутствие клеток со спорами. Для их выделения культуры выдерживали при температуре 95°С в течение 15 мин. После чего получали отдельные колонии на твердой среде с добавлением изобутирата и ацетата в качестве источников углерода и электронов. Чистоту выделенных культур спорообразующих сульфидогенов подтвердило отсутствие роста на Plate Count Agar и Anaerobic Agar, а также определение последовательности гена 16S рРНК. Изолят, выделенный на среде с изобутиратом, был обозначен как штамм Bu 1-1, а на среде с ацетатом – BuA. Филогенетический анализ показал, что представители рода Desulfallas являются ближайшими родственниками штамма Bu 1-1, однако все они значительно удалены (рис. 1). Сходство последовательностей гена 16S рРНК, рассчитанное с помощью EzTaxon (Chun et al., 2007) на платформе BIOiPLUG, составляло: 92.77% с Desulfallas alcoholivorax, 92.57% – с Desulfallas sapomandens, 92.43% – c Desulfallas geothermicus, 91.53% – c Desulfallas artcticus, 91.27% – c Desulfallas thermosapovorans. Штамм Bu 1-1, вероятно, является представителем нового рода, так как сходство последовательности гена 16S рРНК значительно ниже порога 98.7%, определяемого для различных видов (Chun et al., 2018). Ближайшим родственником штамма BuA является Desulfotomaculum putei со сходством последовательностей 99.85% (рис. 1). Вероятно, штамм BuA является новым штаммом D. putei. Для штамма Bu 1-1 были определены возможные доноры электронов, которые включали: формиат, ацетат, лактат, пируват, малат, сукцинат, изобутират, пальмитат, фруктозу, сахарозу, глюкозу, этанол, пептон и желатин. Наряду с сульфатом, штамм Bu 1-1 может использовать в качестве акцептора электронов сульфит, тиосульфат, нитрат, арсенат и фумарат. Штамм не восстанавливает элементную серу и нитрит.

Рис. 1.

Дерево, показывающее филогенетическое положение изолятов Bu 1-1 и BuA на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК, определенное методом RAxML (randomized axelerated maximum likelihood, Stamatakis, 2014). Бустрепы расчитаны из 1000 итераций. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. В качестве удаленного родственника использован Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM 11347 (на дендрограмме не показан).

К настоящему времени стало очевидно, что подземные термальные системы являются типичным местообитанием спорообразующих сульфатредуцирующих бактерий. Значительное количество представителей семейства “Desulfotomaculaceae” было выделено из глубинных горизонтов. Desulfotomaculum salinum выделен из нефтегазоносных пластов в Западной Сибири (Назина и соавт., 2005), Desulfotomaculum kuznetsovii (Назина и соавт., 1988) и Desulfotomaculum thermocisternum (Nilsen et al., 1996) – из высокотемпературных нефтяных месторождений, Desulfotomaculum geothermicum (Daumas et al., 1988) и Desulfotomaculum australicum (Love et al., 1993) – из глубинных водоносных пластов, Desulfotomaculum luciae из горячего источника и Desulfotomaculum putei из осадков Триаса (Liu et al., 1997). В 2006 году был описан новый вид Desulfotomaculum thermosubterraneum (Kaksonen et al., 2006), культура которого была получена из черных обрастаний на стенах глубокой шахты в геотермально активном районе Японии. В 2008 году из горячего источника в Тунисе выделен и описан Desulfotomaculum hydrothermale (Haouari et al., 2008). И еще два новых вида, Desulfotomaculum aquiferis и Desulfotomaculum profundi, были выделены из водоносного горизонта, ассоциированного с глубинным месторождением природного газа (Berlendis et al., 2016). Интересно отметить, что последовательность гена 16S рРНК штамма Bu 1-1 полностью совпадала с депонированной в GenBank NCBI KC439348, принадлежащей неопубликованному Desulfotomaculum sp. MP104 PS13. Номер штамма предполагает, что бактерия была выделена из той же шахты Мпоненг в Южной Африке, в которой был найден далекий родственник группы Desulfotomaculum, Candidatus Desulforudis audaxviator (Chivian et al., 2008), выделенный недавно в нашей лаборатории из воды глубинной скважины в Томской области (Karnachuk et al., 2019). Мы предполагаем, что полученные нами из микробных обрастаний чистые культуры Desulfallas sp. Bu 1-1 и Desulfotomaculum sp. BuA происходят из подземных вод, вскрываемых скважиной Г-1 в Тункинской долине. Однако для подтверждения этого факта необходима дальнейшая проверка присутствия родственных филотипов в воде скважины путем профилирования гена 16S рРНК.