Микробиология, 2019, T. 88, № 5, стр. 562-567

Способы повышения жизнеспособности молочнокислых микроорганизмов

Ю. А. Николаев a*, Е. Ф. Шаненко b, Г. И. Эль-Регистан a

a Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

b Московский государственный университет пищевых производств
125080 Москва, Россия

* E-mail: NikolaevYA@mail.ru

Поступила в редакцию 18.03.2019
После доработки 31.03.2019
Принята к публикации 25.05.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе исследованы приемы стабилизации клеток молочнокислых организмов (МКО), позволившие в течение 12 мес. поддерживать титр живых клеток на уровне 107–108 кл./мл, рекомендованном для титра МКО в продуктах питания. Выявлена высокая эффективность использования природных ассоциаций МКО, селектированных по признаку длительного сохранения клетками МКО жизнеспособности. Из селектированной в течение 6 мес. ассоциации, выделенной из рыночной простокваши, были получены в чистых культурах молочнокислые бактерии Lactobacillus plantarum и дрожжи Candida parapsilosis. Скорость гибели этих МКО в бинарной культуре (по 50% каждого ассоцианта) была в несколько раз ниже, чем в монокультурах. Применение дополнительных приемов стабилизации клеток бинарной культуры МКО (бескислородные условия и внесение стабилизирующих добавок антиоксидантов и биополимеров) повысило численность жизнеспособных клеток в культурах, хранящихся в течение 12 мес., в 5–6 раз. Предложенный алгоритм использования сочетающихся приемов пролонгирования жизнеспособности клеток в длительно (до 12 мес.) хранящихся культурах молочнокислых организмов предложен впервые и может быть рекомендован для стабилизации клеток МКО как в кисломолочных пищевых продуктах, так и в заквасочных культурах. В работе впервые показано, что дрожжевым компонентом стабильной ассоциации с молочнокислыми бактериями является C. parapsilosis.

Ключевые слова: молочнокислые микроорганизмы, бинарные культуры, Lactobacillus рlantarum, Candida parapsilosis, пролонгирование жизнеспособности, стабилизация клеток

Молочнокислые бактерии (МКБ) являются важной группой бактерий-симбионтов животных и растений. В природе они встречаются на поверхности растений, фруктов, овощей, зерна, в молоке, наружных и внутренних эпителиальных покровах человека, животных, птиц, рыб. МКБ обладают рядом биохимических особенностей, на основании которых они выделены в отдельную физиологическую группу важнейших для человека пробиотических бактерий, обладающих способностью к образованию молочной кислоты, продукции высокоактивных внеклеточных гидролаз, синтезу бактериоцинов, нейроактивных биогенных аминов, сбраживанию растительных и животных углеводов (Sonomoto, Yokota, 2011; Lantinen et al., 2012; Олескин и соавт., 2016).

Следует отметить, что МКБ часто образуют симбиозы с грибами (в т.ч. дрожжами), развиваясь в виде сложных ассоциаций, например, в чайном грибе (Юркевич, Кутышенко, 2002; Рогожин, Рогожин 2017), кефирном зерне (Lopitz-Otsoa et al., 2006), при сбраживании сусла для получения квасов, сквашивании растительных продуктов и в других случаях. По этой причине стал широко употребим термин “молочнокислые организмы” (МКО), объединяющий молочнокислые бактерии и грибы.

Обладая вышеперечисленными свойствами, МКО играют важную роль в пищевых биотехнологиях для получения кисломолочных и квашеных продуктов, напитков, широко применяются в сельском хозяйстве, медицине и других отраслях (Sonomoto, Yokota, 2011; Lantinen et al., 2012; Олескин и соавт., 2016).

Недостатком продуктов на основе МКО является высокая скорость отмирания их клеток (Thomas, Batt, 1968; Ng et al., 2011). Как правило, сроки хранения, при которых титр МКО сохраняется на заявленном производителем уровне (106–108 КОЕ/мл) не превышает 4 нед. В течение этого времени титр МКО в продукте снижается в 10 и более раз (Shin et al., 2000). О минимальном содержании МКО в молочнокислых и квашеных продуктах для проявления ими пробиотических свойств нет единого мнения. Титр 108 КОЕ/мл считается минимальным для реализации продуктом пробиотических свойств в толстом кишечнике и 106 КОЕ/мл – в тонком кишечнике (Minelli, Benini, 2008). Международными организациями здравоохранения и питания утвержден минимальный уровень содержания МКО в продуктах питания – 107 КОЕ/мл для общего количества МКО, 106 КОЕ/мл – для специальных групп молочнокислых бактерий, 104 КОЕ/мл – для дрожжей (Codex …, 2003–2018).

Для продления жизнеспособности МКО самым распространенным способом является снижение температуры хранения продуктов и препаратов до близких к нулевым значениям, что увеличивает энергозатраты. Также для продления времени хранения МКО используют такие методы как селекция более устойчивых клонов (линий), инкапсулирование, изоляция от кислорода воздуха, применение стабилизирующих добавок и др. (Talwalkar, Kailasapathy, 2006).

Целью исследования было разработать технологически простые способы продления сроков сохранения жизнеспособности клеток молочнокислых организмов и сравнить их относительную эффективность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были музейные штаммы МКО и штаммы, выделенные авторами из ассоциации МКО, селектируемой в течение 6 мес. по признаку сохранения клетками жизнеспособности (колониеобразующей способности) в процессе хранения при комнатной температуре (табл. 1).

Таблица 1.  

Микроорганизмы, использованные в настоящей работе

Организм   Источник
Lactobacillus acidophilus B-1660 Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ РАН)
Lactobacillus casei B-1144 ВКМ РАН
Lactobacillus pentosus B-1941 ВКМ РАН
Lactococcus lactis ТБ2 Коллекция ГосНИИ генетики и селекции промышленных штаммов микроорганизмов
Lactobacillus plantarum (ИНМИ) Выделен в процессе исследования
Candida parapsilosis (ИНМИ) Выделен в процессе исследования

Молочнокислые бактерии и дрожжи культивировали в стерильном обезжиренном молоке в колбах объемом 250 мл с 50 мл среды, на орбитальной качалке (100 об./мин) в течение 2 сут при температуре 28–30°С до стационарной фазы роста (численность живых клеток составляла (2–11) × × 108 КОЕ/мл). Инокулят – культуры стационарной фазы роста – вносили в количестве 5% (об./об.). При выращивании бинарных культур инокулят состоял из бактерий и дрожжей в пропорции 1 : 1 (по числу КОЕ).

Численность живых клеток определяли как количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл культуры при высеве аликвот (десятичных разведений) на агаризованную (1.5%) среду MRS (de Man et al., 1960).

Для хранения МКО в условиях доступа воздуха использовали микробиологические пробирки с ватно-марлевыми пробками, а для хранения в бескислородных условиях – пластиковые шприцы с герметично закупоренными иглами. Через определенные интервалы времени из хранящихся культур отбирали аликвоту для определения численности жизнеспособных клеток (КОЕ/мл). В смешанных культурах определяли удельное содержание организмов как микроскопически, так и методом высева на плотную среду MRS.

В качестве стабилизирующих добавок, которые вносили в стационарные культуры МКО, использовали: углеводы – крахмал или карбоксиметилцеллюлозу (3%), белки – желатин (5%), антиоксиданты – орцин (0.0025–0.05%) или гексилрезорцин (0.0005–0.0025%); молочный жир (5%). Все реактивы приобретены в “Sigma”, молочный жир был использован в виде 20% ультрапастеризованных сливок, приобретенных в розничной сети, стерильность которых предварительно была проверена высевом на плотные среды.

Все опыты выполнены в трех повторностях с тремя праллельными вариантами в каждой. На рисунках представлены средние значения, рассчитанные с применением пакета прикладных программ Excel 1997/2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ассоциацию длительно выживающих МКО выделили из рыночного молочнокислого продукта (простокваши) в процессе многократного пассирования. В ультрапастеризованное обезжиренное молоко (50 мл в колбе объемом 250 мл) вносили инокулят в количестве 5% (об.), культуру инкубировали при 28–30°С в течение 2 сут на орбитальной качалке (100 об./мин). Через 2 сут культивирования наблюдали створаживание и закисление молока; титр МКО составлял (3–11) × 108 КОЕ/мл. Культуру хранили в течение 3 нед. при комнатной температуре в статическом режиме, после чего использовали как инокулят (5% по объему) для следующего цикла культивирования/селекции, как описано выше. Всего было проведено 10 циклов селекции. В итоге, через 6 мес. селекции, была получена ассоциация МКО, состоящая из двух организмов – бактерии и дрожжевого гриба. На основании культурально-морфологических свойств и определения нуклеотидных последовательностей 16S рРНК (для бактерий) или 28S рРНК (для дрожжей) организмы чистых культур были идентифицированы как Lactobacillus plantarum и Candida parapsilosis. Монокультуры L. plantarum и C. paraрsilosis и их бинарная культура, полученная при равной инокуляции обоих организмов (1 : 1 по КОЕ), были исследованы в течение 180 сут для определения скорости отмирания клеток (рис. 1).

Рис. 1.

Изменение численности жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) молочнокислых организмов при хранении в течение 6 мес.: 1L. acidophilus (ВКМ); 2 – Lactococcus lactis (ВКМ); 3L. plantarum; 4C. paraрsilosis; 5 – ассоциация L. рlantarum и C. paraрsilosis. Пунктирной горизонтальной линией отмечен уровень КОЕ, соответствующий 107 кл./мл, утвержденный международными организациями здравоохранения и питания как минимальный в продуктах питания.

Объектами сравнения были чистые культуры музейных штаммов молочнокислых бактерий (табл. 1, 2). Результаты определения численности жизнеспособных клеток (КОЕ) в процессе хранения культур МКО при температуре 17–25°С без применения каких-либо специальных приемов поддержания их жизнеспособности показали, что наибольшей скоростью отмирания характеризовались бактерии Lactococcus lactis (ВКМ) (0.4 lg/сут), наименьшей – бинарная культура бактерий и дрожжей, изолированных из селектированной ассоциации − L. plantarum и C. paraрsilosis. Следует отметить, что музейные штаммы отмирали гораздо быстрее (КОЕ ∼ 102 кл./мл до 30 сут), чем штаммы, выделенные из ассоциации специально селектированной по признаку длительного выживания (КОЕ ∼ ∼ 102 кл./мл до 60 сут). Наиболее важно, что в составе бинарной культуры эти штаммы выживали гораздо успешнее (КОЕ ∼ 102 кл./мл до 180 сут), чем при росте в монокультурах. При этом, во-первых, суммарная численность клеток МКО в бинарной культуре в стационарной фазе (7 сут роста) была на порядок больше, чем в монокультурах, а кривая отмирания не была монотонной; во-вторых, при хранении в течение 90 сут численность КОЕ в бинарной культуре L. plantarum−C. paraрsilosis сохранялась на уровне 108 КОЕ/мл. В-третьих, в культуре, изначально содержащей равные концентрации клеток бактерий и дрожжей, произошли изменения в их удельном содержании – доля бактерий снизилась до 25–30%, а доля дрожжей возросла до 70–75%. Отметим, что удельное содержание кисломолочных бактерий и дрожжей было выше рекомендуемого (Codex… 2003–2018), где численность МКБ установлена в пределах не ниже 106 кл./мл, а дрожжей – 104 кл./мл.

Клетки в бинарной культуре отмирали в течение 30 сут со скоростью 0.04 lg КОЕ/мл сут, что в 3–4 раза медленнее, чем в монокультурах (табл. 2). Затем, до 90 сут хранения, численность жизнеспособных клеток стабилизировалась на уровне 107–108 кл./мл, более высоком, чем рекомендованный как минимальный для содержания МКО в продуктах питания. После 90 сут хранения скорость отмирания бинарной культуры возросла до 0.06 и поддерживалась на этом уровне до 180 сут хранения. Наличие такого плато в период 30–90 сут хранения может быть обусловлено образованием в бинарной культуре клеток-персистеров (Michiels, Fauvart, 2016) и покоящихся цистоподобных клеток (ЦПК), формирование которых в циклах развития периодических культур было показано ранее как для молочнокислых бактерий (Лойко и соавт., 2015), так и дрожжей (Эль-Регистан и соавт., 2006). Высокая численность покоящихся форм в хранящейся бинарной культуре, составляющая 10–15% от численности клеток в стационарной культуре, показана впервые и, по-видимому, может быть следствием межклеточных взаимодействий при совместном культивировании бактерий и дрожжей. Последующее снижение численности КОЕ (через 90 сут хранения) может объясняться переходом покоящихся клеток в некультивируемое состояние в примененных условиях хранения при доступе кислорода при комнатной температуре, что создает возможность образования активных форм кислорода и постоянного окислительного стресса.

Таблица 2.  

Скорости отмирания клеток МКО при хранении их культур в течение 30 сут. Скорость отмирания выражена в единицах lg (КОЕ/мл)/сут

Организм (ассоциация) Скорость отмирания, lg(КОЕ)/мл/сут
L. аcidophilus В-1660 0.19
Lactococcus lactis ТБ2 0.36
L. plantarum ИНМИ 0.13
C. paraрsilosis ИНМИ 0.17
L. plantarumC. paraрsilosis 0.04

Исходя из этого в следующих экспериментах выросшую бинарную культуру 30-сут возраста помещали в условия отсутствия доступа кислорода воздуха при хранении в герметично закрытых пластиковых шприцах. Результаты, представленные на рис. 2, свидетельствуют, что хранение в условиях ограниченного доступа воздуха радикально изменяет скорость снижения численности КОЕ, что является показателем отмирания клеток микроорганизмов. Так, при хранении в течение 6 мес. в условиях свободного доступа воздуха титр (численность КОЕ) МКО снизился до уровня 102 КОЕ/мл, тогда как при хранении в течение 15 мес. в условиях ограниченного доступа воздуха численность колониеобразующих клеток стабилизировалась на уровне 1.2–1.4 × 107 КОЕ/мл, рекомендованном для титра МКО в продуктах питания (Codex… 2003–2018).

Рис. 2.

Выживание клеток в бинарной культуре молочнокислых бактерий L. рlantarum и дрожжей C. paraрsilosis (при их начальной удельной доле в культуре по 50%) в условиях хранения: 1 – с доступом воздуха; 2 – с ограничением доступа воздуха.

В третьей серии экспериментов были применены способы дополнительной стабилизации клеток МКО, основанные на применении стабилизирующих добавок, в качестве которых были использованы: антиоксиданты (орцин и гексилрезорцин), полимеры углеводной и белковой природы (крахмал, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) и желатин), а также молочный жир. На рис. 3 представлены результаты хранения бинарных культур молочнокислых бактерий и дрожжей в течение 12 мес. при комнатной температуре в присутствии разных стабилизирующих добавок. При анализе результатов принимали за 100% (контроль) численность КОЕ в культурах без стабилизирующих добавок, хранящихся 2 и 12 мес. (табл. 3). Значимое влияние стабилизирующих добавок было выявлено преимущественно для вариантов 12-мес. хранения: для гексилрезорцина и желатина – увеличение КОЕ в 2 раза, для орцина и крахмала – в 5–6 раз. Однозначно негативно влияло добавление молочного жира: количество КОЕ снижалось на 1–2 порядка, что, по-видимому, связано со способностью жиров окисляться с образованием долгоживущих перекисей, повреждающих клеточные мембраны.

Рис. 3.

Хранение ассоциации молочнокислых бактерий L. рlantarum и дрожжей C. paraрsilosis в условиях ограниченного доступа воздуха в течение 12 мес. при комнатной температуре в присутствии разных стабилизирующих добавок: 1 – контроль; 2 – гексилрезорцин (0.0005%); 3 – орцин (0.0025%); 4 – крахмал (3%); 5 – КМЦ (3%); 6 – желатин (5%); 7 – молочный жир (5%).

Таблица 3.  

Численность КОЕ в бинарной культуре МКО без добавок (контроль) и в присутствии разных стабилизирующих добавок через 2 и 12 мес. хранения в условиях отсутствия доступа воздуха

Срок хранения Контроль ГР Орцин Крахмал КМЦ Желатин Жир
2 мес. 100% 181.8 54.5 181.8 181.8 12.7 0.2
12 мес. 100% 250.0 625.0 500.0 25.0 250.0 2.5

Полученные результаты согласуются с литературными данными. Известны такие приемы повышения стрессоустойчивости и выживания молочнокислых бактерий, как ограничение доступа воздуха, комбинированный рост молочнокислых бактерий, применение стабилизирующих добавок и защитных сред (Talwalkar, Kailasapathy, 2006; Dijkstra et al., 2018). Например, для защиты от повреждений при сушке МКБ применяют способы их выращивания в высококонцентрированном сусле (Huang et al., 2018).

Показано, что молочнокислые бактерии L. рlantarum, Lactococcus lactis и дрожжи S. cerevisiae дают больший выход биомассы при совместном культивировании, что можно объяснить обменом азотистыми метаболитами, лежащим в основе мутуалистических взаимоотношений симбионтов (Ponomarova et al., 2017).

В работе Ng et al. (2011) показано, что совместное культивирование ряда штаммов молочнокислых бактерий повышало степень выживаемости Lactococcus lactis. Однако имеются данные о селективности таких взаимодействий: если некоторые штаммы повышали выживаемость целевого штамма МКБ, то другие бактерии действовали негативно (Vinderola et al., 2002). При этом отмечено, что для проявления положительного влияния совместного культивирования необходимо присутствие живых клеток, а не только их метаболитов (Ng et al., 2011). По-видимому, помимо трофических взаимодействий, на выживаемость МКБ влияют метаболиты, регулирующие образование стрессоустойчивых клеток, предназначенных для выживания популяций (Николаев и соавт., 2006).

Таким образом, в результате проведенных исследований, имеющих целью повышение жизнеспособности молочнокислых организмов, предложен новый алгоритм последовательного применения микробиологических и биохимических приемов, применение которых обеспечивает существенное снижение скорости отмирания клеток МКО:

– использование природных ассоциаций молочнокислых организмов для выделения штаммов МКО, естественно адаптированных к сокультивированию;

– селекция природных ассоциаций МКО по заданному технологическому свойству, в настоящем исследовании – по признаку длительности сохранения жизнеспособности клеток;

– ограничение доступа воздуха в процессе хранения культур/продуктов на основе МКО;

– внесение стабилизирующих добавок (антиоксидантов, полимеров углеводной и белковой природы) в хранящиеся в отсутствие доступа кислорода бинарные (многокомпонентные) культуры МКО.

Кроме того, впервые показано, что дрожжевым компонентом стабильной ассоциации с молочнокислыми бактериями является C. parapsilosis.

Список литературы

  1. Лойко Н.Г., Краснова М.А., Пичугина Т.В., Гриневич А.И., Ганина В.И., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Изменение диссоциативного спектра популяций молочнокислых бактерий при воздействии антибиотиков // Микробиология. 2014. Т. 83. № 3. С. 284–294.

  2. Loiko N.G., Kozlova A.N., Nikolaev Y.A., Gal’chenko V.F., El’-Registan G.I., Krasnova M.A., Pichugina T.V., Grinevich A.I., Ganina V.I. Changes in the phase variant spectra in the population of lactic acid bacteria under antibiotic treatment // Microbiology (Moscow). 2014. V. 83. P. 195–204.

  3. Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 489–496.

  4. Nikolaev Yu.A., Mulyukin A.L., Stepanenko I.Yu., El-Registan G.I. Autoregulation of stress response in microorganisms // Microbiology (Moscow). 2006. V. 75. P. 420–426.

  5. Олескин А.В., Эль-Регистан Г.И., Шендеров Б.А. Ме-жмикробные химические взаимодействия и диалог микробиота–хозяин: роль нейромедиаторов // Микробиология. 2016. Т. 85. № 1. С. 3–25.

  6. Oleskin A.V., El’-Registan G.I., Shenderov B.A. Role of neuromediators in the functioning of the human microbiota: “business talks” among microorganisms and the microbiota–host dialogue // Microbiology (Moscow). 2016. V. 85. P. 1–22.

  7. Рогожин В.В., Рогожин Ю.В. Medusomyces gisevii: строение, функционирование и использование // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7. № 4. С. 24–35.

  8. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 446–456.

  9. El-Registan G.I., Mulyukin A.L., Nikolaev Yu.A., Galchenko V.F., Suzina N.E., Duda V.I. Adaptogenic functions of extracellular autoregulators of microorganisms // Microbiology (Moscow). 2006. V. 75. P. 380–389.

  10. Юркевич Д.И., Кутышенко В.П. Медузомицет (Чайный гриб): научная история, состав, особенности физиологии и метаболизма // Биофизика. 2002. Т. 47. № 6. С. 1116–1129.

  11. Yurkevich D.I., Kytyshenko V.P. Meduzomyces (Tea fungus): scientific history, composition, physiology and metabolism // Biophysics. 2002. V. 47. P. 1116–1129.

  12. Codex standard for fermented milks. Codex standard 243-2003. Adopted in 2003. Revised in 2008, 2010, 2018. http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius

  13. de Man J.C., Rogosa M., Sharpe M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli // Appl. Bact. 1960. V. 23. P. 130–135.

  14. Dijkstra A.R., Starrenburg M.J.C., Todt T., van Hijum S.A.F.T., Hugenholtz J., Bron P.A. Transcriptome analysis of a spray drying-resistant subpopulation reveals a zinc-dependent mechanism for robustness in L. lactis SK11 // Front. Microbiol. 2018. V. 9. Article 2418.

  15. Huang S., Gaucher F., Cauty C., Jardin J., Le Loir Y., Jeantet R., Chen X.D., Jan G. Growth in hyper-concentrated sweet whey triggers multi stress tolerance and spray drying survival in Lactobacillus casei BL23: from the molecular basis to new perspectives for sustainable probiotic production // Front. Microbiol. 2018. V. 9. Article 2548.

  16. Lantinen S., Ouwehand A.C., Salminen S., Wright A.V. Lactic acid bacteria. Microbiological and functional aspects. 4th edn. CRC Press, 2012. 798 p.

  17. Lopitz-Otsoa F., Rementeria A., Elguezabal N., Garaizar J. Kefir: a symbiotic yeasts-bacteria community with alleged healthy capabilities // Rev. Iberoam. Micol. 2006. V. 23. № 2. P. 67–74.

  18. Michiels J., Fauvart M. (Eds.). Bacterial Persistence. Methods and Protocols. Belgium, Humana Press, 2016. 244 p.

  19. Minelli E.B., Benini A. Relationship between number of bacteria and their probiotic effects // Microb. Ecol. Health Dis. 2008. V. 20. P. 180–183.

  20. Ng E.W., Yeung M., Tong P.S. Effects of yogurt starter cultures on the survival of Lactobacillus acidophilus // Int. J. Food Microbiol. 2011. V. 145. P. 169–175.

  21. Ponomarova O., Gabrielli N., Sévin D.C., Mülleder M., Zirngibl K., Bulyha K., Andrejev S., Kafkia E., Typas A., Sauer U., Ralser M., Patil K.R. Yeast creates a niche for symbiotic lactic acid bacteria through nitrogen overflow // Cell Syst. 2017. V. 5. P. 345–357.

  22. Shin H.-S., Lee J.-H., Pestka J.J., Ustinol Z.P. Viability of bifidobacteria in commercial dairy products during refrigerated storage // J. Food Protect. 2000. V. 63. P. 327–331.

  23. Sonomoto K., Yokota A. (Eds.). Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria: Current Progress in Advanced Research. Caister Academic Press, 2011. 286 p.

  24. Talwalkar A., Kailasapathy K. A review of oxygen toxicity in probiotic yogurts: influence on the survival of probiotic bacteria and protective techniques // Compr. Rev. in Food Sci. and Food Safety. 2006. V. 3. P. 117–124.

  25. Thomas T.D., Batt R.D. Survival of Streptococcus lactis in starvation conditions // J. Gen. Microbiol. 1968. V. 50. P. 367–382.

  26. Vinderola C.G., Mocchiutti P., Reinheimer J.A. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products // J. Dairy Sci. 2002. V. 85. P. 721–729.

Дополнительные материалы отсутствуют.