Микробиология, 2019, T. 88, № 6, стр. 715-718

Возбудитель мелиоидоза Burkholderia pseudomallei является естественным обитателем почвенных и водных экосистем в регионах мира, эндемичных по данному заболеванию (Limmathurotsakul et al., 2016). Заражение мелиоидозом обычно происходит в результате контакта человека с почвой, поэтому наиболее подвержены данной инфекции работники сельскохозяйственной отрасли. Предшествующие исследования показали, что в почвах и воде агроландшафтов (преимущественно рисовых полей) северо-восточного Таиланда, наряду с B. pseudomallei, содержатся бактериофаги этой бактерии, причем большинство изолятов фагов, несмотря на то, что они получены в различных географических пунктах, близкородственны друг другу. Типовым представителем данной группы фагов является бактериофаг Bp-AMP1 (Gatedee et al., 2011; Shan et al., 2014; Withatanung et al., 2016). Интересно, что фаг Bp-AMP1 инфицирует не только B. pseudomallei, но и близкородственный непатогенный вид B. thailandensis, который также встречается в почве и воде северо-восточного Таиланда и других эндемичных по мелиоидозу регионов. Это существенно облегчает работу с бактериофагом, поскольку большинство лабораторных экспериментов можно проводить с использованием непатогенного хозяина без применения специальных мер безопасности.

Интересной особенностью физиологии инфекции фага Bp-AMP1 является то, что этот вирус эффективно лизирует клетки хозяев и образует хорошо заметные бляшки на их газонах при 37°C, однако при 25°C этого не происходит (Shan et al., 2014). Авторы предположили, что инфекция клеток при пониженной температуре ведет к образованию лизогенных (или, возможно, псевдолизогенных) бактерий, которые стабильно размножаются в этих условиях, однако подвержены лизису при повышении температуры (Shan et al., 2014). Математическое моделирование динамики развития популяций бактерий и бактериофагов в воде (например, в воде рисовых чеков) с учетом описанного эффекта показало, что фаги могут вносить существенный вклад в регуляцию численности свободных и вирус-инфицированных (лизогенных или псевдолизогенных) бактерий в различных условиях. При этом конкретный результат существенно зависит не только от температуры, но и от других факторов, например, прозрачности воды для ультрафиолетового излучения (Egilmez et al., 2018). Действие подобных факторов по-видимому может объяснить наблюдаемые различия в сезонной динамике мелиоидоза в соседних районах северо-восточного Таиланда, которые не различаются климатически. Постулируемая важная экологическая роль, которую играют Bp-AMP1-подобные вирусы, делает актуальным детальное исследование молекулярных и физиологических механизмов, лежащих в основе температурного контроля развития жизненного цикла этих фагов.

Экспериментальная работа с фагом Bp-AMP1 существенно облегчается тем фактом, что полная геномная последовательность данного бактериофага была определена, аннотирована и депонирована ранее (Shan et al., 2014). Из числа биологически охарактеризованных вирусов одними из наиболее генетически родственных фагу Bp-AMP1 оказались описанные нами ранее колифаги phiKT и фаг PGT2, который очень близок к phiKT (83% идентичности полных нуклеотидных последовательностей геномов) (Golomidova et al., 2018).

Проведенное нами биоинформационое сравнение депонированной последовательности Bp-AMP1 (GenBank ID HG793132) и фага phiKT (GenBank ID NC_019520) обнаружило существенное различие в организации их генетической карты, имеющее вид кольцевой перестановки геномного фрагмента. Мы предположили, что указанное различие является артефактом, связанным с неверным определением физических концов генома в одной из последовательностей. Поскольку приблизительное положение концов генома фага phiKT ранее было нами проверено экспериментально (наши неопубликованные данные), то наиболее вероятным мы сочли ошибочное расположение концов в депонированной последовательности фага Bp-AMP1. Более того, и фаг Bp-AMP1, и фаг phiKT представляют собой вирусы, отдаленно родственные бактериофагу Т7 (Shan et al., 2014; Golomidova et al., 2018). Для фага Т7 и подобных ему вирусов свойственно наличие прямых концевых повторов генома протяженностью в несколько сотен пар нуклеотидов (Molineux, 2006). Эти повторы были обнаружены у родственных Bp-AMP1 колифагов phiKT и PGT2 (Golomidova et al., 2018), но их наличие не отражено в депонированной геномной последовательности фага Bp-AMP1.

Сравнение опубликованных геномов фагов phiKT и Bp-AMP1 позволило предположить, что в депонированной последовательности последнего фрагмент около 5000 п.н. от левого физического конца геномной ДНК до 1 н.п. депонированной последовательности оказался размещен на правом конце генома. Для проверки этого предположения необходимо было провести повторный анализ ДНК бактериофага.

Бактериофаг Bp-AMP1 и штамм хозяина B. thailandensis DW503 были любезно предоставлены нам проф. Martha Clokie (University of Leicester, UK). Фаг был выращен согласно стандартным процедурам (Shan et al., 2014), и его геномная ДНК была выделена в препаративных количествах.

Анализ последовательности генома с помощью модуля GeneQuest программного пакета Lasergene 8 (“DNAStar”, США) позволил подобрать эндонуклеазы рестрикции, для которых в геноме фага Bp-АMP1 имеются сайты, расположенные поблизости от предполагаемых физических концов упакованной в вирионы ДНК. В частности, нами были выбраны ферменты NheI и HindIII. С помощью этих эндонуклеаз был проведен гидролиз фаговой ДНК. Продукты гидролиза разделяли в 1% агарозном геле, при этом выбор нагрузки дорожек позволил визуализировать небольшие фрагменты. Полученные электрофореграммы сравнивали с теоретическими профилями фрагментов, рассчитанными, исходя из искусственно замкнутой в кольцо уникальной последовательности генома (рис. 1). Из полученных данных было очевидно, что левый конец генома содержится в NheI-фрагменте ~350 п.н., так как в уникальной последовательности генома имеется лишь один сайт NheI, расположенный вблизи предполагаемого левого конца. Соответственно, один из концов короткого NheI-фрагмента должен быть образован физическим концом генома. Этот же конец содержится и в HindIII-фрагменте длиной около 770 п.н., который исчезает при дополнительном гидролизе ферментом NheI (рис. 1).

Рис. 1.

Слева – предсказанный рестрикционный профиль ДНК фага Bp-AMP1, исходя из искусственно замкнутой в кольцо уникальной последовательности генома. В центре – разделения рестрикционных фрагментов ДНК фага Bp-AMP1 в 1% агарозном геле с маркером 1kb Ladder (“СибЭнзим”, Россия). Справа – предсказанный рестрикционный профиль для линейной откорректированной последовательности с учетом терминальных повторов.

Для точной локализации левого конца генома HindIII фрагмент длиной ~770 п.н. был элюирован из геля и направлен на секвенирование по Сэнгеру с обратным праймером AMP-LendR (5'- CACAGGCAGCACAGCACA), гибридизующимся примерно в 500 п.н. правее предполагаемого левого конца генома. По резкому обрыву сигнала (рис. 2) удалось установить положение левого конца, начиная с последовательности tagcgccgcc……

Рис. 2.

Хроматограммы автоматического секвенирования по Сэнгеру фрагментов, содержащих физические концы ДНК фага Bp-AMP1 (run-off эксперимент). Верхние панели – обработанные данные, нижние панели – исходные данные (raw data).

После того, как была получена последовательность генома с выверенным положением левого конца, стало очевидно, что профиль рестрикционных фрагментов фага по ферменту HindIII отличается от предсказанного отсутствием фрагмента ~1300 п.н. Указанный фрагмент должен содержать правый конец генома. Вместо фрагмента ~1300 п.н. в экспериментально определенном профиле рестрикционных фрагментов присутствовал фрагмент около 500 п.н., который отсутствует в теоретически рассчитанном профиле. Это свидетельствовало о предположительном наличии у варианта фага, с которым мы работали, обширной делеции около 1000 п.н. в районе гена интегразы. Наличие данной делеции было подтверждено с помощью ПЦР (данные не приводятся). Используя ПЦР-скрининг фаговых бляшек, мы обнаружили вариант фага, в котором такой делеции нет. Его профиль рестрикционных фрагментов содержал HindIII-фрагмент длиной около 1700 п.н. Секвенирование этого фрагмента с праймером AMP-end-D2 (5'-CT CTG CTG TAC CAG TCA) позволило установить точное положение правого конца по обрыву сигнала секвенирования (рис. 2) по последовательности ….ggacgcgcccta. Таким образом, фаг Bp-AMP1 обладает концевыми повторами длиной в 389 п.н.

Для подтверждения соответствия депонированной последовательности, ДНК фага, свободная от делеции в гене интегразы, была направлена на полногеномное секвенирование. Полученная последовательность оказалась идентична ранее депонированной последовательности фага Bp-AMP1. Вместе с тем инспекция имеющейся аннотации генома фага Bp-AMP1 выявила ряд неточностей. Мы вручную отредактировали аннотацию, в результате чего были дополнительно описаны некоторые рамки считывания, уточнены предсказанные функции некоторых фаговых белков. Поскольку в исходной аннотации значительное число рамок считывания не имело никакого названия, мы ввели сквозную нумерацию ORF, начиная с идентифицированного нами левого конца генома. Кроме этого, мы добавили к последовательности правый терминальный повтор, в результате чего общая длина последовательности стала составлять 42 798 п.н. вместо 42 409 п.н. в исходной версии. Полученная аннотированная последовательность депонирована в базу данных GenBank под номером MN191861.