Микробиология, 2020, T. 89, № 2, стр. 235-246

Анализ нуклеотидного полиморфизма популяций

В результате секвенирования было получено 149132 нуклеотидных последовательности, из которых после проверки качества и фильтрации в дальнейшем анализе использовали 119306. Среднее количество нуклеотидных последовательностей в библиотеке на образец составляло 2508.

В результате секвенирования всех образцов была достигнута относительно небольшая глубина секвенирования (2500 последовательностей в образце). Анализ разнообразия показал, что ни одна из кривых насыщения не вышла на плато. Это ожидаемый результат, поскольку почва является крайне гетерогенным объектом (Berg et al., 2009). Микробные сообщества почвы различаются даже в пределах нескольких миллиметров, а также в различных участках почвенных агрегатов и между горизонтами (Ивлев, 2005).

Чтобы количественно оценить, какую часть сообщества удалось детектировать в эксперименте, наиболее часто используют отношение числа выявляемых ОТЕ к индексу ChaoI, который, в свою очередь, оценивает теоретически возможное количество видов в природном сообществе (генеральной совокупности) (табл. 1, 2). При анализе воспроизводимости таксономического состава микробиомов в повторностях опыта были получены сравнительно высокие показатели – больше половины таксонов в составе сообщества (69.3%) достоверно не изменяли свои частоты в повторностях. Данный показатель был в среднем ниже в повторностях черноземных почв, что свидетельствует о его зависимости от типа почвы. В дальнейшем для получения репрезентативных библиотек различных природных сообществ стоит использовать разную глубину секвенирования и количество проб. Параметры эти рекомендуется определять в ходе установочных экспериментов, однако можно рекомендовать увеличить количество повторностей в случае черноземной почвы до 7, а в случае дерново-подзолистой почвы можно ограничиться и 5‒6 повторностями.

Также при сравнении повторностей опыта было отмечено снижение доли “воспроизводимых” таксонов в ризосфере пшеницы: доля “воспроизводимых” ОТЕ в различных вариантах опытах составила в среднем 69.3%, в то время как в сообществах ризосферы пшеницы на черноземе этот параметр составлял 52.6%. Этот феномен может быть связан с большим разнообразием микробиомов, населяющих ризосферу пшеницы, которое, в свою очередь, определяется особенностями корневой экссудации этого растения.

Важно подчеркнуть, что в данном исследовании мы приняли достаточно строгий критерий воспроизводимости данных секвенирования, при котором доля таксона не должна достоверно различаться между повторностями. Если принять за критерий воспроизводимости данных просто наличие таксона в повторности, воспроизводимость данных будет значительно выше, в среднем – 79.3% (табл. 1).

Анализ показателей альфа-разнообразия. Для оценки альфа-разнообразия сообществ были рассчитаны индекс видового богатства и индекс Шеннона (табл. 2). Ризосферные сообщества демонстрируют снижение уровня разнообразия в сравнении с контрольными почвами, хотя достоверные различия в показателях альфа-разнообразия были обнаружены только для сообществ ризосферы пшеницы на черноземной почве (ЧЗ W5; ЧЗ W2).

Такое снижение разнообразия хорошо согласуется с известными литературными данными. В исследованиях ризосферного микробиома нескольких сортов риса также были продемонстрированы различия в альфа-разнообразии (Edwards et al., 2015). Небольшое, не всегда достоверное, снижение числа ОТЕ и индекса разнообразия Шеннона в ризосфере, по сравнению с контрольными почвами, также отмечалось многими авторами (Winston et al., 2014, Edwards et al., 2015). Различия в численных показаниях снижения разнообразия, по-видимому, обусловлены влиянием различных спектров корневых экссудатов на микробное сообщество черноземной почвы.

Снижение микробного разнообразия в ризосферных сообществах, возможно, связано с селективным действием растительных факторов, т.е. растение “отбирает” определенные функциональные группы микроорганизмов, в том числе филогенетически не связанные друг с другом. К этим группам могут быть отнесены и микроорганизмы с высокой метаболической пластичностью, быстро адаптирующие клеточный метаболизм к изменившимся условиям.

Анализ показателей бета-разнообразия. Для интегральной оценки различий в составе сообществ обычно используют различные варианты многомерных статистических анализов, в частности, анализ главных компонент PCoA. На рис. 1 представлены данные PCoA почвенных контрольных и ризосферных образцов, для данных взвешенного (учитывающего численность ОТЕ) ‒ weighted (рис. 1а, 1б) и невзвешенного (учитывающего только представленность ОТЕ) ‒ unweighted (рис. 1в, 1г) Unifrac.

Рис. 1.

Анализ главных компонент (PCoA) для микробных сообществ с обозначением контрольных и ризосферных образцов различных видов культурных растений. На осях указан процент объясненной вариации. А, Б – weighted Unifrac (1 – ДП; 2 – ЧЗ; 3 – пДП, 4 – пЧЗ; 5 – рДП; 6 – рЧЗ), В, Г – unweighted Unifrac (7 – исходная почва; 8 – ризосфера пшеницы W2; 9 – ризосфера пшеницы W5; 10 – ризосфера ржи R1; 11 – ризосфера ржи R2).

Существенные различия в составе ризосферных и почвенных сообществ подтверждаются высоким процентом объясненной вариации данных. Для PCoA анализа с использованием взвешенного Unifrac этот показатель составлял до 40% (рис. 1а, 1б).

Тип почвы оказался первым по значимости фактором, влияющим на состав микробного сообщества. С этим фактором ассоциировано более 20% различий в таксономическом составе микробиомов. Сообщества черноземной и дерново-подзолистой почвы различались по своей таксономической структуре, что выражается в присутствии кластеров на графиках PcoA (рис. 1а, 1в). Сообщества черноземной почвы проявляли некоторую гетерогенность по количественному составу микробиомов, что может быть связано с физико-химическими параметрами, создающими многообразие экологических ниш (рис. 1а, 1в). Микробные сообщества дерново-подзолистой почвы хорошо повторяют друг друга и образуют хорошо выраженный кластер (рис. 1а). Выраженное влияние типа почвы обусловлено физико-химическими различиями почвы – именно эти факторы в значительной мере определяют разнообразие прокариот.

Вторым по значимости фактором, определяющим состав ризосферного микробиома, является вид растения. Отчетливо этот фактор проявляется при сравнении сообществ дерново-подзолистой почвы и ризосфер, сформированных на ней, ‒ на графике РсоА отчетливо видны кластеры ризосфер ржи и пшеницы (рис. 1а, 1б). В случае чернозема этот эффект также присутствует, но является менее выраженным, что, возможно, связано с уже упомянутой ранее высокой гетерогенностью этой почвы.

Микробные сообщества ризосфер и пшеницы, и ржи на дерново-подзолистой почве отличаются от исходных почв, и отличия эти для обоих растений одинаково выражены. На дерново-подзолистых почвах также хорошо заметно влияние сорта растения. Так, ризосферные сообщества ржи сорта R1 оказываются ближе к исходным почвам, чем ризосферные сообщества ржи сорта R3. Аналогичный эффект можно наблюдать и для сортов пшеницы (рис. 1б). Такая разная дистанция между сообществами исходной почвы и ризосферными сообществами разных сортов в большей мере определяется количественным соотношением таксонов, поскольку по данным unweighted unifrac (учитывающим только наличие/отсутствие ОТЕ) дистанции между сообществами ДП‒ДП R1 и ДП‒ДП R2 существенно не отличаются.

Для микробиомных сообществ чернозема и ризосферных сообществ, сформированных на его основе, в целом характерны те же тенденции (рис. 1). Сообщества ризосфер ржи и пшеницы отличаются от сообществ исходных почв, дистанции между сообществами также зависят от сорта растения. Однако в рамках этого анализа однозначно разрешить эти изменения не удалось, вероятнее всего, из-за высокой агрохимической и биологической гетерогенности почвы.

Полученные результаты согласуются с опубликованными ранее работами. В ряде работ демонстрируется выраженное влияние растения на микробное сообщество уже в ризосфере (Bulgarelli et al., 2015; Edwards et al., 2015). В других работах, однако, указывается на отсутствие каких-либо изменений в составе сообществ ризосферы (по сравнению с сообществами контрольной почвы), и различия показаны только для сообществ ризопланы (Aira et al., 2010). Такое явное противоречие в оценках связано как с различной силой влияния растения на микробиом почвы, так и с уже упомянутой во введении проблемой фракционирования микробных сообществ (почва‒ризосфера‒ризоплана).

Анализ таксономической структуры сообществ. Как уже упоминалось в разделе Материалы и методы, для проведения таксономического анализа нами использовались только ОТЕ, достоверно не различающиеся между повторностями.

Преобладающим в сообществах являлся домен Bacteria, однако Archaea, представленный преимущественно филой Crenarchaeota, составлял значительную долю микробиома – 11% в случае черноземных и 5% в случае дерново-подзолистых образцов. Это соотношение практически не изменялось при рассмотрении ризосферных сообществ.

На уровне фил в почвенных и ризосферных образцах большую часть сообщества составляли представители Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Acidobacteria, а также упомянутые выше Crenarchaeota. Такая картина в целом типична для почвенных сообществ. В литературе есть указания на присутствие большого количества Actinobacteria, Bacteroidetes, Proteobacteria даже в разных по своему происхождению и типу почвах (Lundberg et al., 2012).

При сравнении исходной почвы и ризосферных сообществ, сформированных на черноземе, наблюдалось увеличение доли филы Bacteroidetes и Proteobacteria. Этот же эффект, даже в большей степени, присутствовал и у ризосферных образцов на дерново-подзолистой почве. Доля представителей фил Planctomycetes, Acidobacteria, Chloroflexi и Actinobacteria, при сравнении обоих типов контрольных почв с соответствующими ризосферными сообществами, сокращалась. На уровне классов в переходах почва– ризосфера наблюдалось значительное увеличение числа Sphingobacteriia (Bacteroidetes) ‒ с 0.6 до 8% на черноземе и с 0.6 до 6.4% на дерново-подзолистой, а также Betaproteobacteria (Proteobacteria) ‒ с 6.8 до 19.4% на дерново-подзолистой почве и с 8.4 до 16.9% на черноземе (табл. 3).

Также в ризосфере ржи наблюдалось достоверное уменьшение доли бактерий семейств Ox-alobacteraceae на обоих типах почв (на дерново-подзолистой почве более чем в 12 раз и более чем в 5 раз на черноземе), Micrococcaceae (на дерново-подзолистой более чем в 2 раза, на черноземе – бо-лее чем в 4 раза), а в ризосфере пшеницы – уменьшение в сообществе доли семейства Oxalobacteraceae и достоверное увеличение доли Acidobacteria (табл. 3).

Сравнение различных сортов одного вида растения позволяют выделить несколько сортспецифических таксонов. Так между сортами ржи на черноземной почве достоверные различия долей в сообществе были выявлены в группе Chthoniobacteracea, а при аналогичном сравнении сортов пшеницы – в группе Oxalobacteraceae и Sphingobacteriaceae. Стоит отметить, что Sphingobacteriales также упоминается в литературе как сортспецифичный таксон для различных сортов конопли (Winston et al., 2014).

В ряде исследований отмечается специфичность ризосферных таксонов. Так, уже упоминавшиеся исследования ризосферных сообществ ячменя указывают на увеличение доли Commamonadaceaе (Bulgerelli et al., 2015), а ризосфер конопли ‒ на увеличение доли Sphingomonadales (Winston et al., 2014).

Видоспецифичность некоторых ризосферных таксонов также отражена в литературе (Edwards et al., 2015; Coleman-Derr et al., 2016), однако ни в одном из проанализированных литературных источников не было обнаружено тех таксонов, которые изменяли свою долю в проанализированных микробиомах ризосфер ржи и пшеницы.

Характеристика ризосферного эффекта с использованием данных масс-спектрометрии и ионного состава

Массив данных, полученных при анализе ионного и масс-спектрального состава, очень велик и требует детального рассмотрения. В рамках данной работы мы охарактеризуем сходство или различие ионных и масс-спектральных профилей.

В графике, построенном по результатам кластерного анализа профилей масс-спектров (рис. 2), несмотря на отсутствие четкой кластеризации, можно выделить отдельную кладу, принадлежащую масс-спектрам исходных почвенных образцов. Также хорошо обособленной является клада, принадлежащая масс-спектрам ризосфер ржи. По-видимому, состав масс-спектров, в большей степени зависит от вида растения, а не от типа почвы. Это может быть связано с присутствием большого количества органических соединений ‒ продуктов корневой экссудации.

Рис. 2.

Дендрограмма, построенная по данным ICPE (Curtiss, алгоритм кластеризации Ward). Темными линиями отмечены образцы, полученные из чернозема, светлыми – из дерново-подзолистой почвы.

Кластерный анализ ионного состава (рис. 3) показывает несколько иную картину. Дендрограмма, построенная по данным ионного состава, характеризуется высокими значениями поддержки кластеров, а сам состав кластеров демонстрирует выраженную зависимость ионного состава почвенной вытяжки от типа почвы. Образцы ризосфер дерново-подзолистых почв группируются в отдельный кластер с высоким значением поддержки. Второй кластер включает в себя ризосферы, сформированные на черноземе, и обе исходных почвы (чернозем и дерново-подзолистая).

Рис. 3.

Дендрограмма, построенная по данным масс-спектрометрии (Jaccard, алгоритм кластеризации Ward). Темными линиями отмечены образцы, полученные из ризосфер ржи, светлыми – из ризосфер пшеницы. Пунктирные линии отмечают образцы, взятые из контрольных почв.

Таким образом, в качестве дальнейшей гипотезы можно считать, что именно тип почвы определяет ионный состав ризосферы. В целом химический состав (определяемый масс-спектрально) ризосферной почвы зависит от большего числа факторов, и одним из оказывающих существенное влияние является вид растения.

Исследование стало первой попыткой анализа ризосферных сообществ ржи и пшеницы на контрастных почвах с использованием системного подхода к анализу биоразнообразия. В ходе работы была применена комплексная методика отбора ризосферных образцов, а также дополнены методы статистической поддержки метагеномного анализа сообщества, позволяющие рассчитать требуемое количество повторностей эксперимента.

В ходе исследования было показано, что именно почвенное микробное сообщество является основой для формирования растением ризосферного микробиома. Также были выявлены таксоны, достоверно принимающие участие в формировании специфического ризосферного микробиома ржи и пшеницы. Были выявлены как общие ризосферные таксоны (Oxalobacteriaceae), так и видо- (Micrococcaceaе, Sphingobacteriaceae и др.) и сортоспецифичные. Изменение состава микробиома отчетливее проявляется на бедных почвах. Можно предположить, что растение “отбирает” из почвенного сообщества те или иные бактериальные таксоны, основываясь не на их таксономическом положении, но на функциональной роли в новой, формирующейся экологической системе.

Данное направление исследования, безусловно, является существенным как для разработки систем адаптивного земледелия, так и для расширения фундаментальных знаний о формировании и особенностях экологии ризосферых сообществ.