Микробиология, 2020, T. 89, № 4, стр. 488-492

Биопленки – это погруженные во внеклеточный матрикс структурированные сообщества микроорганизмов, которые являются основной формой существования микроорганизмов в природе (Ножевникова и соавт., 2015). Micrococcus luteus повсеместно встречается в воде и почве (Mauclaire, Egli, 2010), кроме того, является одним из доминирующих представителей микробиоты кожи человека (Kloos et al., 1974, Daeschlein et al., 2012). Показано, что его клетки локализуются преимущественно в роговом слое кожи, а также в полостях волосяных фолликулов (Lange-Asschenfeldt et al., 2011). Помимо кожи, M. luteus может быть компонентом микробиоты слизистых оболочек человека (например, влагалища, – Chen et al., 2017; Ako-Nai, Omo-Omorodion, 2019). Вероятно, вследствие адаптации к обитанию на коже, M. luteus обладает одним из самых коротких геномов среди свободноживущих бактерий – около 2.5 млн пар оснований (Young et al., 2009), что накладывает на M. luteus ряд метаболических ограничений, например, неспособность расти на среде с глюкозой (и рядом других сахаров) как единственным источником углерода. При этом M. luteus может представлять интерес в области биотехнологии как потенциальный источник биотоплива в виде биологически синтезируемых алкенов, поскольку обладает соответствующим набором генов метаболизма аминокислот и жирных кислот (Young et al., 2010; Surger et al., 2018). Также M. luteus, благодаря кератинолитической активности, может быть интересен как потенциальный агент для утилизации отходов птицефабрик (Laba et al., 2015). Несмотря на это, процесс формирования биопленок M. luteus и возможность регуляции этого процесса только начинают изучаться, прямые исследования биопленок M. luteus малочисленны (Matsuura, 2013).

Согласно результатам, полученным в последнее время, микробиота кожи играет важную роль в функционировании кожного покрова, иммунной системы человека и тесным образом взаимосвязана с системами гуморальной регуляции (Erin Chen et al., 2018). Логично предположить, что макроорганизм-хозяин, в свою очередь, может воздействовать на биопленки: регуляторные соединения организма человека, не обладающие прямым антимикробным действием, способны оказывать влияние на рост микроорганизмов. Это показано для натрийуретических пептидов (Gannesen et al., 2018, Ганнесен и соавт., 2018), вещества P (N’Diaye et al., 2016), катехоламинов (Lyte et al., 2003; Frank, Patel, 2008). Подобное влияние может быть следствием длительной коэволюции организма человека и его комменсалов. Ранее уже было показано воздействие адреналина на ряд микроорганизмов-комменсалов человека, в том числе на формирование биопленок (например, Bansal et al., 2007), хотя прямым антимикробным действием адреналин не обладает (Boyanova, 2017). Более детально исследовано влияние адреналина на некоторых представителей энтеробактерий, у которых обнаружена сигнальная система, основу которой составляют молекулы катехоламинов – адреналин и норадреналин (Lesouhaitier et al., 2009). Это свидетельствует о развившейся в ходе эволюции способности эукариотического макроорганизма регулировать рост прокариотических комменсалов, что важно с точки зрения изучения метаболизма данных микроорганизмов. При этом сведений о влиянии адреналина на грамположительные микроорганизмы очень мало, а его влияние на M. luteus не исследовано вовсе.

Будучи комменсалом кожи человека, M. luteus также подвергается воздействию регуляторных молекул хозяина. В настоящей работе мы исследовали влияние эпинефрина (адреналина) на M. luteus в различных модельных системах формирования биопленок. В работе использовали штамм M. luteus С01, выделенный с кожи здорового добровольца (Журина и соавт., 2017). Поскольку неизвестно, какова концентрация адреналина в экологической нише M. luteus как комменсала человека, в работе использовали концентрацию адреналина, равную 900 пг/мл, указанную в обзоре Boyanova et al. (2017). В этой концентрации адреналин не является субстратом для роста M. luteus, поскольку данное количество вещества слишком мало, чтобы быть значимым источником углерода и энергии.

Бактерии выращивали на обогащенной клостридиальной среде (reinforced clostridial medium, RCM) состава (г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт – 13; пептон – 10; глюкоза – 5; NaCl – 5; ацетат натрия – 3; крахмал – 1; гидрохлорид цистеина – 0.5; pH среды 6.8–7.0. Инкубацию проводили при 33°С, что соответствует температуре экологической ниши, в которой обитает данная бактерия на коже (Boutcher et al., 1995; Lange-Asschenfeldt et al., 2011). Результаты представляли в виде медиан относительных значений (% от контроля). Эксперименты проводили не менее чем в трех независимых повторностях. Статистическую обработку данных проводили при помощи определения непараметрического критерия Манна–Уитни при р < 0.05 с использованием пакета Excel 2010.

В работе применены две модельные системы для исследования биопленок. В первой системе использовали химически чистые тефлоновые кубики размером 4 × 4 × 4 мм в качестве носителя биопленок (Ганнесен и соавт., 2015). Кубики погружали в жидкую среду, в которую вносили инокулят. В этом случае биопленки формируются в равновесии с планктонной культурой. По окончании инкубации (72 ч) измеряли условную оптическую плотность планктонной культуры на спектрофотометре ПЭ-5400ВИ (“Экрос”, РФ) при длине волны 540 нм (ОП₅₄₀). Биопленки на кубиках отмывали от планктонных клеток и окрашивали красителем кристаллическим фиолетовым (КФ), как описано ранее (Ганнесен и соавт., 2015). Оптическая плотность экстракта красителя является количественным показателем роста биопленок. Вторая модельная система включает выращивание биопленок на мелкопористых стекловолоконных фильтрах марки Whatman GF/F (Плакунов и соавт., 2016). В данной системе, после нанесения инокулята на фильтр, биопленки формируются без планктонной культуры, поскольку фильтры располагаются на поверхности агаризованной среды в чашках Петри. Таким образом, стадия обратимой адгезии клеток к поверхности протекает практически мгновенно.

Была предварительно исследована динамика роста биопленок M. luteus С01 (рис. 1а). В ходе работы было принято исследовать зрелые биопленки (в стационарной фазе) и формирующиеся (в экспоненциальной фазе). Показно, что биопленки M. luteus C01 достигали стационарной фазы к 60 ч инкубации, а после 24 ч биопленки находились в стадии формирования. На основании данных о динамике роста был принят период культивирования M. luteus C01 в дальнейшей работе, равный 72 ч (соответствующий зрелым биопленкам). С помощью планшетного спектрофотометра XMark (“Biorad”, США) исследовали также динамику роста планктонных культур и влияние на него адреналина (рис. 1б). Показано, что в контрольных образцах время удвоения составляло 4.25 ч (удельная скорость роста 0.163 ч^–1), тогда как в присутствии адреналина оно сокращалось до 3.25 ч (удельная скорость роста 0.21 ч^–1). Максимальная ОП₅₄₀ в контроле составляла 1.985, тогда как в присутствии адреналина – 2.03 (102.3% от контроля).

Рис. 1.

Динамика роста биопленок (а) и планктонных культур (б) M. luteus C01: 1 – контроль, 2 – образцы с 900 пг/мл адреналина.

Результаты исследования роста биопленок M. luteus С01 в присутствии адреналина (“Sigma”) на тефлоновых кубиках при помощи окрашивания КФ по стандартной методике (Ганнесен и соавт., 2015) представлены на рис. 2. После 72 ч инкубации условная ОП₅₄₀ планктонной культуры в присутствии адреналина не отличалась значительно от ОП₅₄₀ в контроле без его добавления (104.2% от контроля, рис. 2, а), т.е. урожай клеток был так же немного выше, чем в контроле. При этом рост биопленок значительно стимулировался в присутствии адреналина (189.5% от контроля, рис. 2, б). Таким образом, при отсутствии воздействия на планктонные культуры, в исследуемой концентрации адреналин стимулировал рост биопленок M. luteus С01 практически в два раза, что является свидетельством в пользу регуляторной функции адреналина в отношении клеток данного микроорганизма с биопленочным фенотипом.

Рис. 2.

Влияние адреналина на рост планктонных культур (а) и биопленок (б–д) M. luteus C01: 1 – контрольные образцы без добавок; 2 – образцы c 900 пг/мл адреналина. Обозначения: а – планктонные культуры после 72 ч инкубации; б – биопленки на тефлоновых кубиках после 72 ч инкубации (окраска КФ); в – биопленки на тефлоновых кубиках после 72 ч инкубации (окраска МТТ); г – биопленки на тефлоновых кубиках после 24 ч инкубации (окраска МТТ); д – биопленки на стекловолоконных фильтрах после 72 ч роста (окраска МТТ).

С целью изучения механизма действия адреналина использовали другую стратегию для изучения биопленок M. luteus С01 в той же модели с кубиками: количественное определение метаболической активности бактерий в составе биопленки. Для этого биопленки окрашивали 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ) по методике, разработанной ранее (Плакунов и соавт., 2016; Журина и соавт., 2017). Если окрашивание универсальным красителем КФ позволяет определять тотальную биомассу биопленок (матрикс и клетки), то окрашивание МТТ позволяет детектировать только метаболически активные клетки в составе биопленки (рис. 2, в; 2, г). МТТ, будучи акцептором электронов от электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), восстанавливается в нерастворимый формазан. Величина ОП экстракта формазана пропорциональна количеству метаболически активных клеток.

Окрашивание МТТ биопленок, выращенных на тефлоновых кубиках в течение 72 ч (рис. 2, в), показало отсутствие стимулирующего эффекта адреналина (отличие от окрашивания КФ): метаболическая активность бактерий не отличалось значительно от контрольных образцов (102.5%). Однако при окрашивании 24-часовых биопленок МТТ наблюдали значимый стимулирующий эффект адреналина: метаболическая активность бактерий в составе биопленок была на 52.3% выше, чем в контроле (рис. 2, г). Таким образом, в первые сутки инкубации адреналин оказывал стимулирующий эффект на рост (или дыхательный метаболизм) бактерий, который при продолжении инкубации нивелировался. Чтобы определить причину этого явления, использовали вторую модельную систему для формирования биопленок. Существует принципиальное различие между этими моделями: в модели с кубиками происходит параллельный рост как биопленки, так и планктонной культуры в динамическом равновесии между ними, при котором клетки могут переходить из планктонной культуры в биопленку и наоборот. На модели с фильтрами этого не происходит, после адгезии клеток к поверхности образуется только биопленка. После инкубации 72 ч на стекловолоконных фильтрах биопленки M. luteus C01 на среде с исследуемой концентрацией адреналина проявляли большую, чем в контроле, метаболическую активность (125.3% от контроля, рис. 2, д). Таким образом, в этой системе количество метаболически активных клеток в биопленках по истечении 72 ч инкубации в присутствии в среде адреналина увеличивалось, а в системе с кубиками оно оставалось на уровне контроля. Однако в системе с кубиками, где биопленки росли в динамическом равновесии с планктонной культурой, стимуляция метаболической активности адреналином наблюдалась по истечении 24 ч инкубации, тогда как после 72 ч инкубации значительно увеличивалась тотальная биомасса биопленок, окрашиваемая КФ. На основании полученных данных можно предположить, что один из механизмов действия адреналина на биопленки M. luteus С01 заключается в стимуляции синтеза внеклеточного полимерного матрикса биопленок. Количество метаболически активных клеток в биопленках на кубиках практически идентично контролю, в то время как в системе с фильтрами метаболическая активность биопленок в присутствии адреналина выше. Можно полагать, что адреналин ускоряет процесс созревания микробных биопленок, а также оказывает стимулирующий эффект на синтез внеклеточного матрикса.

Таким образом, нами впервые показан регуляторный эффект адреналина на рост биопленок M. luteus С01 в модельных экспериментах. Действие адреналина выражено в стимуляции роста биопленок, по-видимому, за счет активации процесса синтеза внеклеточного полимерного матрикса. Детальный механизм этого явления требует дальнейшего изучения.