Микробиология, 2020, T. 89, № 5, стр. 619-622

Новая плазмида pALWVS1.4 штамма Acinetobacter lwoffii VS15, несущая ген устойчивости к хлорамфениколу

А. Я. Ермакова a, А. В. Белецкий a, А. В. Марданов a, М. А. Петрова b, Н. В. Равин a, А. Л. Ракитин a*

a Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН
119071 Москва, Россия

b Институт молекулярной генетики РАН
123182 Москва, Россия

* E-mail: rakitin@biengi.ac.ru

Поступила в редакцию 19.04.2020
После доработки 07.05.2020
Принята к публикации 08.05.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В результате секвенирования и анализа генома устойчивого к хлорамфениколу штамма Acinetobacter lwoffii VS15, выделенного из вечной мерзлоты, обнаружена кольцевая плазмида длиной 11964 п.о., названная pALWVS1.4. Помимо генов, обеспечивающих поддержание плазмиды и ее мобилизацию, pALWVS1.4 содержит ген cflA, кодирующий мембранный белок семейства MFS транспортеров. Близкие гомологи cflA встречаются у бактерий рода Psychrobacter, но отсутствуют в геномах Acinetobacter. Ген cflA фланкирован двумя копиями IS элемента семейства IS4, что указывает на его приобретение штаммом VS15 за счет горизонтального переноса в составе предполагаемого составного транспозона. Получен рекомбинантный штамм Escherichia coli – продуцент CflA и показано, что в условиях индуцированной экспрессии штамм обладает устойчивостью к хлорамфениколу.

Ключевые слова: Acinetobacter, вечная мерзлота, устойчивость к антибиотикам, плазмида, горизонтальный перенос генов

Бактерии рода Acinetobacter повсеместно распространены благодаря своей способности адаптироваться к различным экологическим нишам (Touchon et al., 2014). Некоторые виды, прежде всего A. baumannii, являются клинически важными патогенами, другие, например, A. calcoaceticus, A. johnsonii, A. haemolyticus и A. lwoffii, широко распространены и в природе, и в клинике, а большинство видов обитает в водных экосистемах и почвах (Doughari et al., 2011). Такая пластичность штаммов Acinetobacter во многом обеспечивается большим набором разнообразных плазмид. Распространение детерминант устойчивости к антибиотикам, входящих в состав различных мобильных элементов, и связанный с этим рост числа резистентных клинических штаммов Acinetobacter является важной проблемой для медицины (Da Silva, Domingues, 2016). Источником мобильных элементов с генами устойчивости могут быть как природные штаммы Acinetobacter, так и другие виды бактерий.

В настоящее время выявлено четыре основных механизма устойчивости бактерий к антибиотикам: (1) модификация мишени действия антибиотика, (2) ферментативная инактивация антибиотика, (3) снижение проницаемости мембран микробной клетки, (4) активное выведение антимикробных препаратов из клетки с помощью различных транспортеров (Nikaido, 2009; van Hoek et al., 2011).

Механизм устойчивости, обусловленный активным выведением молекул антибиотика из клетки, основывается на работе специализированного набора белков, образующих трансмембранные транспортеры. Такие трансмембранные помпы способны транспортировать токсичные вещества, ксенобиотики, в том числе и антибиотики большинства известных на данный момент классов, из внутриклеточного пространства во внешнюю среду (Marquez, 2005). На данный момент описано несколько семейств бактериальных транспортеров (Marquez, 2005; Biswas et al., 2008; Li et al., 2010): ABC суперсемейство (ATP-binding Cassette), MFS суперсемейство (Major Facilitator Superfamily), MATE семейство (Multidrug And Toxic Compound Extrusion), SMR семейство (Small Multidrug Resistance) и RND суперсемейство (Resistance-Nodulation-Division). MFS транспортеры составляют одно из самых широко распространенных суперсемейств. Они способны переносить широкий круг биологически активных веществ: моно и олигосахариды, антибиотики, аминокислоты, нуклеозиды, фосфорорганические эфиры, метаболиты цикла Кребса (Pao et al., 1998; Kumar et al., 2020). Энергия для переноса обеспечивается катионным градиентом, чаще всего H+ или Na+ (Law et al., 2008).

Ранее из многолетнемерзлых пород Колымской низменности, имеющих возраст 20–40 тыс. лет, нами был выделен штамм Acinetobacter lwoffii VS15, и было установлено, что он устойчив к стрептомицину (100 мг/мл), спектиномицину (100 мг/мл) и хлорамфениколу (20 мг/мл) (Mindlin et al., 2009). Нами было показано, что устойчивость к стрептомицину и спектиномицину детерминирована геном aadA27, который несет плазмида pALWED1.8 (Kurakov et al., 2016).

Целью данной работы являлся определение нуклеотидной последовательности и анализ генетической структуры другой плазмиды, pALWVS1.4, из этого штамма и функциональная характеристика содержащегося в ней гена устойчивости к хлорамфениколу.

Для секвенирования генома штамма A. lwoffii VS15 использовали технологии Illumina (“Illumina”, США) и мономолекулярного нанопорового секвенирования (“Oxford Nanopore”, Великобритания). В результате секвенирования библиотеки геномной ДНК на Illumina MiSeq было получено 1.1 млн пар чтений (2 × 300 нт). Дополнительно геномную ДНК секвенировали с помощью системы MinION (“Oxford Nanopore”, Великобритания), в результате чего было получено 52924 чтения со средней длиной 6610 нт (всего 349.9 млн нт). Для сборки контигов из всех чтений использовали программу Unicycler v. 0.4.8 (Wick et al., 2017). В результате была получена полная кольцевая последовательность хромосомы длиной 3 260 140 нт и 8 кольцевых контигов размером 134 096, 32 788, 15 780, 11 964, 10 985, 6814, 4677, 4135 нт, вероятно, представляющих плазмиды. Плазмида длиной 4135 нт соответствовала ранее описанной pALWED1.8, а плазмида длиной 11964 нт, обозначенная pALWVS1.4, была исследована в настоящей работе.

Плазмида pALWVS1.4 (GenBank MT319099) является низкокопийной, средняя кратность прочтения соответствующего контига при секвенировании генома в 3.47 раза превышала среднюю кратность прочтения хромосомы. Генетическая организация плазмиды представлена на рис. 1. Плазмида содержит гены белков, ответственных за инициацию репликации (repB), конъюгативный перенос за счет мобилизации конъюгативными плазмидами (mobA, mobC) и токсин-антитоксиновый модуль (relB, relE), обеспечивающий стабильное наследование плазмиды в популяции за счет действия механизма постсегрегационного киллинга (Gotfredsen, Gerdes, 1998). Перед геном repB расположен сайт инициации репликации (ori). Также в плазмиде содержится оперон, включающий гены диоксигеназы и транспортера лизина (lysO). Участки плазмиды pALWVS1.4, включающие все эти гены (с 1 по 6532 и с 7347 по 7514 нуклеотид), более чем на 99% идентичны по нуклеотидной последовательности плазмидам pALWED1.5 (GenBank CP032114), pALWEK1.7 (GenBank CP032109), и pZS-6 (GenBank CP019151) из двух древних (также выделенных из вечной мерзлоты) и современного штаммов A. lwoffii (рисунок).

Рис. 1.

Генетическая организация плазмиды pALWVS1.4. Координаты указаны (в нт) в соответствии с последовательностью pALWVS1.4 (GenBank MT319099). Гены базового модуля выделены серыми стрелками, гены транспозаз – черными стрелками, гены устойчивости к антибиотикам cflA, oxa235 и ampC – стрелками без заливки. IS элементы плазмиды pALWVS1.4 показаны прямоугольниками. В нижней правой части рисунка изображена структура транспозонов Tn6252 из pO237-4 и Tn6168 из pJ9-3; черными стрелками обозначены копии ISAba1. duf4105 – ген белка с консервативным доменом DUF4105, функция которого неизвестна. Серой заливкой соединены участки плазмид с идентичностью нуклеотидных последовательностей выше 99%.

Два участка плазмиды pALWVS1.4 (с 6533 по 7346 и с 7515 по 11964 нуклеотид), в этих родственных плазмидах отсутствует. Эти участки содержит одну копию IS элемента ISAlw31 семейства IS5 и две идентичные копии IS элемента ISAba1 семейства IS4 (рисунок). Обнаруженные в pALWVS1.4 мобильные элементы лишь единичными нуклеотидными заменами отличаются от последовательностей ISAlw31 и ISAba1, обнаруженных в A. lwoffii ZS207 и A. baumannii CLA-1. В обоих IS элементах содержатся открытые рамки считывания, кодирующие транспозазы, однако в них имеется по одной точке сдвига рамки считывания. Вероятно, образование полноразмерной транспозазы обеспечивается программируемым сдвигом рамки считывания, что было показано для ISAba1 из A. baumannii (Mugnier et al., 2009).

Между двумя копиями ISAba1 в плазмиде pAL-WVS1.4 расположен ген cflA, кодирующий MSF транспортер семейства Bcr/CflA (InterPro IPR004812). Предположительно, это ген устойчивости к хлорамфениколу. Инсерционные элементы ISAba1 часто встречаются в плазмидах и хромосомах Acinetobacter, реже у некоторых других гамма-протеобактерий. В ряде случаев они образуют составные транспозоны, состоящие из двух копий ISAba1, между которыми располагаются гены устойчивости к антибиотикам. К настоящему времени описано два таких транспозона: Tn6252 (Hamidian, Nigro, 2019), содержащий ген устойчивости к карбапенемам oxa235, входящий в состав плазмиды pO237-4 из A. baumannii 11A14CRGN003, и Tn6168 (Hamidian et al., 2019) с геном резистентности к цефалоспоринам – ampC в плазмиде pJ9-3 из A. baumannii J9 (рисунок). Однако структура, в которой между двумя копиями ISAba1 располагался бы гомолог гена cflA, ранее не была описана. Способность к транспозиции обнаруженного нами элемента требует экспериментальной проверки.

Сравнение pALWVS1.4 и сходных по нуклеотидным последовательностям плазмид pALWED1.5, pZS-6 и pALWEK1.7 показало, что они являются для нее предковыми формами. pALWVS1.4 отличается от этих плазмид только наличием двух вставок – IS элемента ISAlw31 и составного транспозона, включающего две копии ISAba1 и ген cflA между ними (рис. 1).

Ген cflA кодирует белок, состоящий из 398 аминокислотных остатков, с расчетной молекулярной массой 43.1 кД. Анализ вторичной структуры СflA с помощью TMHMM Server v. 2.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) выявил наличие 12 трансмембранных спиралей, что указывает на мембранную локализацию белка. Поиск сходных последовательностей в GenBank показал, что cflA по нуклеотидной последовательности полностью идентичен транспортеру MSF семейства (WP_075107253) из Psychrobacter sp. C_20.9, выделенного из морских моллюсков в Испании (Lasa, Romalde 2017). Белки, сходные по аминокислотным последовательностям на 60–78%, встречаются у различных гамма-протеобактерий. Гомологи cflA имеются и в геномах различных штаммов Acinetobacter, однако уровень идентичности аминокислотных последовательностей не превышает 61%.

Для функциональной характеристики СflA соответствующий ген был клонирован в экспрессионном векторе pQE30, в котором предварительно был делетирован собственный ген cat устойчивости к хлорамфениколу (вектор pQE30ΔCm). Рекомбинантную плазмиду pQE30ΔCm_cflA вводили в штамм Escherichia coli DLT1270, в котором индуцируемая экспрессия может осуществляться путем внесения IPTG в среду. Единичной колонией беcплазмидного штамма DLT1270, штамма с “пустым” вектором DLT1270/pQE30ΔCm и штамма DLT1270/pQE30ΔCm_cflA инокулировали 5 мл среды LB (для штаммов с плазмидами добавляли 100 мкг/мл ампициллина) и выращивали на шейкере при 37°С в течение 16 ч. Затем полученные культуры засевали в соотношении 1 : 100 в среду LB с добавлением 1 мМ IPTG и выращивали до достижения OD600 = 0.5. Культуры разводили физиологическим раствором до оптической плотности OD600 = 0.1 и рассевали на чашки с агаром, содержащем 1 мМ ИПТГ и хлорамфеникол в концентрациях 0, 2.5, 5 и 10 мкг/мл. Чашки выдерживали в термостате при 37°С в течение 3 сут, регистрируя рост колоний. Опыт повторяли 3 раза. В результате установлено, что плазмида pQE30ΔCm_cflA придает клеткам штамма DLT1270 устойчивость к хлорамфениколу в концентрации 2.5 мкг/мл, при которой бесплазмидный штамм и штамм с “пустым” вектором колоний не образовывали. При концентрациях хлорамфеникола 5 и 10 мкг/мл рост колоний не наблюдался ни для одного из тестируемых штаммов. В отсутствии ИПТГ образование колонии на чашках с хлорамфениколом не наблюдали. Таким образом, белок CflA способен придавать клеткам штамма E. coli DLT1270 низкий уровень устойчивости к хлорамфениколу, по-видимому, обеспечивая экспорт антибиотика из клетки.

Хотя штамм A. lwoffii VS15 был выделен из многолетнемерзлых отложений на Северо-Востоке Сибири, ген транспортера хлорамфеникола плазмиды pALWVS1.4 оказался полностью идентичен гену cflA из “морского” штамма бактерий рода Psychrobacter, выделенного в Испании, а близкие гомологи в геномах других Acinetobacter отсутствовали. При этом фланкирующий cflA мобильный элемент почти полностью (1 замена на 1180 нт) идентичен ISAba1 из клинического штамма A. baumannii CLA-1. По-видимому, инсерция гена cflA в плазмиду-предшественник pALWVS1.4 произошла за счет перемещения составного транспозона несколько десятков тысяч лет назад. Полученные данные позволяют предполагать, что подобные составные транспозоны могут участвовать в переносе генов лекарственной устойчивости между природными и клиническими штаммами Acinetobacter.

Список литературы

  1. Biswas S., Raoult D., Rolain J.M. A bioinformatic approach to understanding antibiotic resistance in intracellular bacteria through whole genome analysis // Int. J. Antimicrob. Agents. 2008. V. 32. P. 207–220.

  2. Da Silva G.J., Domingues S. Insights on the horizontal gene transfer of carbapenemase determinants in the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii // Microorganisms. 2016. V. 4. pii: E29.

  3. Doughari H.J., Ndakidemi P.A., Human I.S., Benade S. The ecology, biology and pathogenesis of Acinetobacter spp.: an overview // Microbes Environ. 2011. V. 26. P. 101–112.

  4. Gotfredsen M., Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a new toxin-antitoxin gene family // Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 1065–1076.

  5. Hamidian M., Hawkey J., Wick R., Holt K.E., Hall R.M. Evolution of a clade of Acinetobacter baumannii global clone 1, lineage 1 via acquisition of carbapenem- and aminoglycoside-resistance genes and dispersion of ISAba1 // Microb. Genom. 2019. V. 5. e000242.

  6. Hamidian M., Nigro S.J. Emergence, molecular mechanisms and global spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii // Microb. Genom. 2019. V. 5. e000306.

  7. Kumar S., Lekshmi M., Parvathi A., Ojha M., Wenzel N., Varela M.F. Functional and structural roles of the Major Facilitator Superfamily bacterial multidrug efflux pumps // Microorganisms. 2020. V. 8. pii: E266.

  8. Kurakov A., Mindlin S., Beletsky A., Shcherbatova N., Rakitin A., Ermakova A., Mardanov A., Petrova M. The ancient small mobilizable plasmid pALWED1.8 harboring a new variant of the non-cassette streptomycin/spectinomycin resistance gene aadA27 // Plasmid. 2016. V. 8. P. 36–43.

  9. Lasa A., Romalde J.L. Genome sequence of three Psychrobacter sp. strains with potential applications in bioremediation // Genomics Data. 2017. V. 12. P. 7–10.

  10. Li X.Z., Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update // Drugs. 2010. V. 69. P. 1555–1623.

  11. Marquez B. Bacterial efflux systems and efflux pumps inhibitors // Biochimie. 2005. V. 87. P. 1137–1147.

  12. Mindlin S.Z., Petrova M.A., Gorlenko Zh.M., Soina V.S., Khachikian N.A., Karaevskaya E.A. Multidrug-resistant bacteria in permafrost: isolation, biodiversity, phenotypic and genotypic analysis // New permafrost and glacier research / Eds. Krugger M.I. and Stern H.P. Hauppauge. N.Y.: Nova Science, 2009. P. 89–105.

  13. Mugnier P.D., Poirel L., Nordmann P. Functional analysis of insertion sequence ISAba1, responsible for genomic plasticity of Acinetobacter baumannii // J. Bacteriol. 2009. V. 191. P. 2414–2418.

  14. Nikaido H. Multidrug resistance in bacteria // Annu. Rev. Biochem. 2009. V. 78. P. 119–146.

  15. Pao S.S., Paulsen I.T., Saier M.H. Jr. Major facilitator superfamily // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 1–34.

  16. Touchon M., Cury J., Yoon E.J., Krizova L., Cerqueira G.C., Murphy C., Feldgarden M., Wortman J., Clermont D., Lambert T., Grillot-Courvalin C., Nemec A., Courvalin P., Rocha E.P. The genomic diversification of the whole Acinetobacter genus: origins, mechanisms, and consequences // Genome Biol. Evol. 2014. V. 6. P. 2866–2882.

  17. van Hoek A.H., Mevius D., Guerra B., Mullany P., Roberts A.P., Aarts H.J. Acquired antibiotic resistance genes: an overview // Front. Microbiol. 2011. V. 2. Article 203.

  18. Wick R.R., Judd L.M., Gorrie C.L., Holt K.E. Unicycler: resolving bacterialgenome assemblies from short and long sequencing reads // PLoS Comput. Biol. 2017. V. 13. e1005595.

Дополнительные материалы отсутствуют.