Микробиология, 2020, T. 89, № 5, стр. 522-534

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы и условия их культивирования. Объектами исследования являлись штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39Rif^R (далее Rlv VF39) (Ivashina et al., 1994) и его производные с мутациями в генах глюкуронозил-(β-1,4)-глюкозилтрансферазы PssE (Ivashina et al., 2010) и глюкансинтазы NdvB (данная работа). Для трансформации и выделения плазмидной ДНК использовали штамм Escherichia coli DH5α (“Novagen”, США). Конъюгативный перенос плазмиды в клетки Rlv VF39 осуществляли из штамма E. coli S17-1 (Simon et al., 1983). Для стандартного культивирования ризобий использовали среду TY (Beringer, 1974). Для выделения полисахаридов штаммы выращивали в синтетической среде BMM (Ivashina et al., 2010), содержащей D-маннит в концентрации 5 г/л. Бактерии E. coli культивировали в среде LB (Sambrook et al., 1989). Концентрации антибиотиков в селективных средах для E. coli и Rhizobium составляли, соответственно, (мкг/мл): тетрациклина – 10 и 5, канамицина – 20 и 60, рифампицина – 25.

Конструирование штамма с мутацией в гене ndvB осуществляли путем замещения аллеля гена дикого типа на его мутантный аллель в результате гомологичной рекомбинации. Для введения мутации в ген ndvB, кодирующий глюкансинтазу, сконструирована плазмида pEX∆ndvB-Km. Фрагмент ДНК длиной 6748 п.н., содержащий ОРС ndvB с окаймляющими последовательностями геномной ДНК, амплифицировали с использованием праймеров ndvB_f (AAGAATTCAACCAGCACGCCAAATG) и ndvB_r (TTGGTACCCCCACCTTCCGCA) и клонировали в векторе pEX18Tc (Hoang et al., 1998) по сайтам EcoRI и KpnI. В результате была получена плазмида pEXndvB. Для введения делеции длиной 1296 п.н. в ген ndvB плазмиду pEXndvB гидролизовали эндонуклеазой рестрикции XhoI, два сайта которой расположены в кодирующей последовательности гена, и лигировали в условиях образования кольцевых молекул. Для маркирования делеции и последующей селекции мутантов в XhoI-сайт вводили Km^R-кассету из плазмиды pUC4K (“Pharmacia LKB”, Швеция). Конъюгативный перенос плазмиды pEX∆ndvB-Km в клетки штамма Rlv VF39 осуществляли из штамма E. coli S17-1 с отбором Rif^RTc^SKm^RSuc^R-клонов. Наличие мутации подтверждали методом ПЦР с использованием праймеров ndvB_f и nd-vB_r.

Выделение полисахаридов. Культуру бактерий, выращенную в среде TY до ранней стационарной фазы, вносили в 50 мл среды BMM до начальной оптической плотности 0.1. Бактерии выращивали в течение 4 сут при 28°С в колбах объемом 750 мл на роторной качалке (200 об./мин). Клетки дважды осаждали центрифугированием при 8000 об./мин (“Beckman J2-21”, США) в течение 30 мин при 4°С. Высокомолекулярные формы экзополисахарида осаждали из надосадочной жидкости добавлением 3-х объемов 96% этанола с последующим центрифугированием при 13 000 об./мин в течение 1 ч при 4°С. Супернатант, содержащий экзоолигосахариды, концентрировали на роторном испарителе. ЭОС осаждали добавлением 10 объемов охлажденного 96% этанола с последующим центрифугированием при 19 000 об./мин в течение 1 ч при 4°С (“Beckman J2-21”) и хранили при –20°С.

Концентрацию сахаров определяли антроновым методом (Loewus, 1952). Для построения калибровочных кривых использовали растворы D-глюкозы в диапазоне концентраций 20–200 мкг/мл.

Ионообменную хроматографию низкомолекулярных олигосахаридов выполняли на ВЭЖ хроматографе ProStar (“Varian”, США). Образец ЭОС (2.4 мг в 20 мМ трис-HCl буфере, pH 8.0) наносили на колонку MonoQ 5/50 GL (“GE Healthcare”, Швеция). Для удаления не связавшихся нейтральных сахаридов колонку промывали этим же буфером. Кислые ЭОС элюировали линейным градиентом NaCl (0–0.35 М) в 20 мМ трис-HCl буфере, pH 8.0. Скорость потока составляла 0.6 мл/мин. Начиная с 3-ей минуты, собирали 72 фракции по 0.4 мл и анализировали на присутствие углеводов антроновым методом. Фракции, образующие один пик, объединяли. Олигосахариды осаждали 10 объемами охлажденного 96% этанола, растворяли в 500 мкл 0.1 M NH₄ОAc буфера, pH 6.9 и фракционировали с помощью гель-филь-трации.

Гель-фильтрацию ЭОС проводили на колонке Superdex Peptide 10/300 GL (“GE Healthcare”, Швеция) с использованием хроматографа ProStar (“Varian”, США). В качестве элюента использовали 0.1 M NH₄ОAc, pH 6.9. Скорость потока составляла 0.6 мл/мин. Начиная с 12-й минуты, собирали 30 фракций по 500 мкл. Фракции из одного хроматографического пика объединяли, ЭОС осаждали 10 объемами 96% этанола и лиофилизировали.

Масс-спектрометрический анализ экзоолигосахаридов выполняли в режиме регистрации отрицательных ионов на приборе Orbitrap ELITE (“Thermo Scientific,” Германия), снабженном источником ионизации нанораспылением (NSI). ЭОС растворяли в смеси 30% ацетонитрил, 0.1% муравьиная кислота и 10 мМ NH₄HCO₃. Ввод образца ЭОС (50–200 пмоль/мкл) выполняли с помощью боросиликатного эмиттера (“Thermo Scientific”, США). Напряжение на входном конусе во время ионизации образцов варьировали в диапазоне 0.9–1.3 кВ. Температура прогреваемого капилляра составляла 200°С. Панорамное сканирование для регистрации ионов выполнялось в диапазоне m/z 500–4000. Для получения MS/MS спектров использовали режим HCD (диссоциация, активированная соударением в высокоэнергетической камере) с диапазоном сканирования ионизированных фрагментов с m/z 100–2000. Нормализованная энергия столкновений HCD составляла 25–50%. Все измерения выполняли при разрешении не ниже 200 000. Масс-спектры регистрировали и обрабатывали с использованием стандартного программного обеспечения от производителя (“Xcalibur 2.2”). При расчете молекулярных масс ионов ЭОС и их фрагментов использовали следующие значения: D-глюкоза (Glc) – 180.06 Да, D-галактоза (Gal) – 180.06 Дa, D-глюкуроновая кислота (GlcA) – 194.04 Да, пирувил (Pyr) – 72.02 Да, О-ацетил (Ac) – 43.02 Да, гидроксибутаноил (Hb) – 87.04 Да. В зависимости от типа рассматриваемого масс-спектра, панорамный спектр или спектр фрагментации, мы использовали массы углеводов с учетом потери одной или двух молекул воды.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фракционирование экзоолигосахаридов. Для анализа секретируемых в культуральную среду полисахаридов бактерии Rlv VF39 выращивали в синтетической среде BMM. Анализ культуральной жидкости на присутствие полисахаридов после осаждения и удаления высокомолекулярного ЭПС выявил наличие низкомолекулярных полисахаридов, концентрация которых была сопоставима с концентрацией высокомолекулярного ЭПС (соответственно, 598 ± 86 и 586 ± 26 мкг/мл). Суммарный препарат экзоолигосахаридов был разделен с помощью анионообменной хроматографии на колонке MonoQ 5/50GL. В результате показано, что только 70% ЭОС связывалось с носителем. Возможно, как и в случае других штаммов ризобий, не связавшиеся ЭОС представляют собой нейтральные полисахариды или β-глюканы (Breedveld, Miller, 1994).

Известно, что помимо нейтральных глюканов штаммы S. meliloti, R. leguminosarum bv. viciae и R. leguminosarum bv. trifolii синтезируют глицерофосфорилированные β-1,2-глюканы (Zevenhuizen et al., 1990; Breedveld, Miller, 1994; Mendis et al., 2016). Сравнительный хроматографический анализ экзоолигосахаридов, продуцируемых штаммом дикого типа и его мутантами c полностью блокированным синтезом кислого ЭПС (pssE) и глюканов (ndvB) (рис. 2), позволил заключить, что наблюдаемые на хроматограмме ЭОС штамма Rlv VF39 являются формами кислого ЭПС c разной степенью полимерности (рис. 2а).

Рис. 2.

Ионообменная хроматография экзоолигосахаридов штамма Rlv VF39 (а) и его производных с мутациями в генах pssE (б) и ndvB (в) на колонке MonoQ 5/50 GL. (◻) – профиль элюции ЭОС по данным антронового теста. () – фракции ЭОС, формирующие пики М1–М4, объединяли и фракционировали с помощью гель-фильтрации.

В профиле элюции ЭОС штамма Rlv VF39 можно выделить 4 основных пика: М1–М4 (рис. 2а). ЭОС из отдельных пиков М1–М4 были дополнительно фракционированы с помощью гель-фильтрации (рис. 3). При этом была выявлена относительная однородность исследуемых олигосахаридов: большая часть ЭОС из пиков М1 и М2 формировали на гель-хроматограммах мажорные пики S1 и S2, максимумы которых приходились соответственно на 22.5 и 18.5 минуты элюции (рис. 3а, 3б). Наибольшее количество ЭОС из пика М3 элюировалось между 16 и 18 минутами (пик S3, рис. 3в). ЭОС из пика М4 элюировались практически в свободном объеме колонки, что свидетельствовало об их большой молекулярной массе (пик S4, рис. 3г). Высокая степень полимерности ЭОС из пика S4 подтверждена фракционированием на колонке Superdex 200 10/300 GL (данные не представлены). Основываясь на результатах ионообменного фракционирования и масс-спектрометрического анализа ЭОС, полученных при гидролизе высокомолекулярного ЭПС штамма Rlv VF39 гликозилгидролазой PssW (неопубликованные данные), мы предположили, что олигосахариды из пиков S1, S2 и S3 являются, соответственно, мономерами, димерами и тримерами повторяющегося октасахаридного звена кислого ЭПС (рис. 3). Это предположение подтверждено результатами масс-спектрометрического анализа. ЭОС из пика S4 в силу их высокой полимерности были исключены из хода дальнейших исследований.

Рис. 3.

Гель-фильтрация кислых экзоолигосахаридов из пиков М1 (а), М2 (б), М3 (в) и М4 (г) на колонке Superdex Peptide 10/300 GL. (◻) – профиль элюции ЭОС по данным антронового теста. () – фракции ЭОС, формирующие пики S1, S2 и S3, объединяли и анализировали методом масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрический анализ экзоолигосахаридов пика S1. На масс-спектре олигосахаридов из пика S1 выявлены три серии двухзарядных отрицательных ионов (рис. 4). Установлено, что серия ионов с m/z 731.19, 752.20, 773.20, 774.21, 795.21 и 816.22 соответствует дегидратированным ионам октасахаридного звена (М₈) высокомолекулярного ЭПС, содержащего два остатка пировиноградной кислоты, и отличающихся степенью ацетилирования и наличием Hb-группы (табл. 1). Кроме того, идентифицированы ионы гидратированной формы октасахарида (${\text{M}}_{{\text{8}}}^{{\text{h}}}$) с соответствующими модификациями, а также ионы их Na⁺ и K⁺ аддуктов. Группу мажорных ионов составляют ионы октасахаридов с одной ацетильной группой (M₈Ас), с ацетильной и гидроксибутаноильной группами (M₈АсHb), а также ионы октасахарида (M₈). Ионы октасахаридов M₈Ас₂, M₈Hb и M₈Ас₂Hb присутствовали в значительно меньших количествах (табл. 1).

Рис. 4.

Фрагмент NSI масс-спектра экзоолигосахаридов из хроматографического пика S1. Обозначены двухзарядные отрицательные ионы октасахарида М₈ и его модифицированных производных, а также ионы гидратированных форм гептасахаридов $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ и $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}.$ M – олигосахарид, содержащий две Pyr группы; h и ⚫ – гидратированные формы и Na⁺ аддукты соответственно. ^аM₇ и ^bM₇ – гептасахариды, лишенные остатков глюкуроновой кислоты (GlcA-c, ∆ 158.02 Да) и глюкозы (Glc-b, ∆144.04 Да) соответственно.

Две другие серии ионов с m/z 652.18, 673.18, 695.20, 716.20 и 659.17, 680.17, 701.18, 702.19, 723.19, 744.20 представлены двухзарядными ионами гептасахаридов $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 652.18) и $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 659.17). У гептасахаридов из четырех гексоз главной цепи октасахаридного звена ЭПС отсутствуют либо остаток GlcA-с ($^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$), либо остаток Glc-b ($^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$). На это указывают значения ∆158.02 Да (GlcA) и ∆144.04 Да (Glc) между ионами с m/z 652.18 и m/z 659.17 соответствующих гептасахаридов и ионом октасахарида М₈ (m/z 731.19). Из двух гептасахаридов мажорным является $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}.$ Ионы гептасахарида $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ с двумя Ac группами ($^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$Ас₂ и $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$Ас₂Hb) обнаруживаются в следовых количествах, а $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$Ac₂ и $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$Ac₂Hb отсутствуют (табл. 2).

Результаты HCD фрагментации подтвердили наши предположения относительно состава ЭОС из пика S1 и позволили получить дополнительные сведения об их структуре. Так, фрагментация двухзарядного отрицательного иона октасахарида М₈ (m/z 731.19) приводила к отщеплению одного или двух остатков GlcA, в результате чего на спектре появлялись пики ионов $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 1305.36) и $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 1129.33) (рис. 5а). В главной цепи этих олигосахаридов помимо остатка Glc-a с присоединенной боковой цепью сохранялся второй остаток Glc-b (рис. 1). Отщепление остатка Glc-b зафиксировано при фрагментации двухзарядного гидратированного иона октасахарида (${\text{M}}_{{\text{8}}}^{{\text{h}}},$ m/z 740.19) (рис. 5б). В доминирующей на спектре серии однозарядных ионов идентифицирован пик иона пентасахарида (${\text{M}}_{{\text{5}}}^{{\text{h}}}$) c m/z 967.28, у которого помимо двух остатков GlcA отсутствует и остаток Glc-b.

Рис. 5.

Спектры HCD фрагментации двухзарядных отрицательных ионов октасахарида М₈ c m/z 731.19 (a) и его гидратированной формы ${\text{M}}_{{\text{8}}}^{{\text{h}}}$ c m/z 740.20 (б); в – схема фрагментации октасахарида. R – боковая цепь (Glc₃GalPyr₂). * – ионы, наблюдаемые на спектре; () – ионы, образующиеся в случае расположения остатка Glc на противоположном восстанавливающем конце октасахарида.

Необходимо отметить, что на этом же спектре зафиксированы пики ионов с m/z 1319.34 ($^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$) и 1143.31 ($^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{6}}}^{{\text{h}}}$). Известно, что в достаточно мягких условиях фрагментации первыми разрываются гликозидные связи, прилежащие к восстанавливающему концу олигосахарида. Таким образом, обнаружение ионов с m/z 1319.34 и 1143.31 допускает существование мономеров, у которых на восстанавливающем^{конце расположен остаток глюкозы. Однако интенсивность ионов $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ и $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{6}}}^{{\text{h}}}$ в несколько раз меньше интенсивности ионов $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 1305.36) и $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{6}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 1129.33). Этот факт, наряду с данными по фрагментации М₈ (m/z 731.19), позволяет говорить, что основной формой мономера является октасахарид, у которого на восстанавливающем конце расположен фрагмент GlcA-GlcA. На основании данных расшифровки HCD спектров (табл. 3) предложена схема фрагментации октасахарида с использованием принятых номенклатурных обозначений (рис. 5в) (Domon, Costello, 1988).}

Результаты фрагментации двухзарядных отрицательных ионов гептасахаридов $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 659.17) (рис. 6а) и $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$Hb (m/z 702.19) подтвердили наличие в составе главной цепи гептасахарида $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ двух остатков GlcA и отсутствие остатка Glc-b (данные не представлены). Об этом свидетельствует разница в 176.03 Да (GlcA) между зафиксированными на HCD спектре ионом исходного гептасахарида и продуктами его фрагментации: гекса- ($^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{6}}}^{{\text{h}}}$) и пентасахаридами (${\text{M}}_{{\text{5}}}^{{\text{h}}}$). Схема фрагментации и структурная формула $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}},$ а также данные расшифровки HCD спектра данного олигосахарида представлены, соответственно, на рис. 6б и в табл. 4.

Рис. 6.

а – Спектр HCD фрагментации двухзарядного отрицательного иона гептасахарида $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 659.17). Обозначены ионы гекса- ($^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{6}}}^{{\text{h}}}$) и пентасахаридов (${\text{M}}_{{\text{5}}}^{{\text{h}}}$), лишенные одного и двух остатков GlcA соответственно. б – Схема фрагментации гептасахарида ^bM₇. R – боковая цепь (Glc₃GalPyr₂). * – ионы, наблюдаемые на спектре.

Анализ спектра HCD фрагментации иона гептасахарида $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ (m/z 652.18) (данные не представлены) подтвердил наличие остатка Glc-b и отсутствие остатка GlcA-с в его составе, что объясняет отсутствие на масс-спектре $^{{\text{a}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$ с двумя Ас группами. Результаты фрагментации ионов с m/z 702.19 и 752.20, предварительно идентифицированных как ионы $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}$Hb и M₈Ас, подтвердили наличие Hb и Ac групп в составе этих олигосахаридов. Необходимо отметить, что используемый в ходе HCD фрагментации энергетический режим приводил к дроблению лишь главной цепи олигосахаридов, практически не затрагивая боковой цепи. Исключение составило отщепление терминального фрагмента Gal-Pyr боковой цепи, наблюдаемое при фрагментации и M₈ и $^{{\text{b}}}{\text{M}}_{{\text{7}}}^{{\text{h}}}.$

Анализ экзоолигосахаридов пика S2. Установлено, что ЭОС из пика S2 являются димерными формами октасахарида (рис. 7а). Подобно описанным выше мономерам, каждое звено димера содержало две Pyr группы. Число других неуглеводных заместителей варьировало (табл. 5). Сравнивая интенсивности сигналов, соответствующих ионам D, DAc, DAc₂, DAc₃, и DAc₄ (табл. 5) и учитывая суперпозиции изотопных распределений ионов в разной степени модифицированных форм димеров (рис. 7б и 7в), мы обнаружили, что на спектре доминировали формы с высоким содержанием модифицирующих групп, а формы D и DAc попадали в разряд минорных. Результаты фрагментации ионов димерных форм ЭОС подтвердили наличие характерных для ЭПС неуглеводных заместителей. Показано, что мажорным является димер, на восстанавливающем конце которого расположен остаток Glc: интенсивность иона фрагмента GlcA-Glc в несколько раз превышала интенсивность иона фрагмента GlcA-GlcA (данные не представлены).

Рис. 7.

(а) Фрагмент NSI масс-спектра экзоолигосахаридов хроматографического пика S2. Представлена область двухзарядных отрицательных ионов (m/z 1460–1680); (б и в) примеры изотопного распределения ионов DAc и суперпозиции изотопных распределений ионов димеров с различным содержанием Ac и Hb групп. D – димер октасахарида, содержащий 4 Pyr-группы.

Анализ экзоолигосахаридов пиков S3. Определить структуру ЭОС из пика S3 не удалось в силу их недостаточного количества. Однако мы полагаем, что эти ЭОС являются тримерами повторяющегося октасахаридного звена кислого ЭПС. Данное предположение основывается на совпадении времени элюции олигосахаридов из пика S3 со временем элюции тримеров октасахарида, полученных в результате гидролиза высокомолекулярного ЭПС гликозилгидролазой PssW, и тримеров октасахарида, продуцируемых штаммом Rlv VF39 с мутацией в гене полисахаридлиазы PlyB. В обоих случаях степень полимеризации и структура выделенных ЭОС были подтверждены масс-спектрометрическим анализом (данные не приведены).

Таким образом, полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что выделенные из культуральной жидкости кислые ЭОС представлены моно-, ди- и тримерами повторяющегося октасахаридного звена высокомолекулярного ЭПС штамма Rlv VF39. В культуральной жидкости обнаружены также гептасахариды, соответствующие по структуре октасахариду без остатков GlcA-с или Glc-b в главной цепи. Известно, что одним из механизмов образования ЭОС у ризобий является гидролиз ЭПС специфическими гидролазами (York, Walker, 1998a; Finnie et al., 1998; Staehelin et al., 2006). Возможно, что и в случае изучаемого штамма ЭОС возникают в результате деполимеризации ЭПС гидролитическими ферментами, гены которых идентифицированы как в геноме исследуемого штамма, так и в геномах других штаммов ризобий (Ivashina, Ksenzenko, 2012).

Сравнительный анализ интенсивностей сигналов ионов мономеров и димеров (табл. 1 и 5) выявил следующую закономерность: среди мономеров на спектре доминировали ионы неацетилированного октасахарида и октасахарида с одной ацетильной группой. Напротив, среди димеров и тримеров преобладали формы с высоким содержанием О-ацетильных групп. Нестехиометрическое ацетилирование повторяющихся звеньев ЭПС описано в ряде работ (O’Neill et al., 1991; Muszyński et al., 2016). Более того, продемонстрировано влияние неуглеводных заместителей в составе полисахаридов на их гидролиз. Так, например, мутация в гене exoZ, блокирующая ацетилирование сукциногликана, приводила к повышенной продукции его низкомолекулярных форм (York, Walker, 1998b). Показано также, что предпочтительным субстратом для глюкуронанлиазы S. meliloti M5N1CS является деацетилированный глюкуронан. При этом гидролиз полисахарида с промежуточной степенью ацетилирования происходил на неацетилированных последовательностях, а близкое расположение к сайту гидролиза двух O‑ацетилированных остатков ингибировало этот процесс (Da Costa et al., 2003). Результаты нашего исследования указывают на то, что in vivo до мономерных форм ЭОС также расщепляются наименее ацетилированные участки высокомолекулярного ЭПС штамма Rlv VF39. Следовательно, установленная in vitro корреляция между степенью ацетилирования ЭПС и его устойчивостью к действию гликозилгидролаз реализуется и in vivo. Этот факт является еще одним косвенным доказательством в пользу высказываемого в литературе предположения о том, что избирательное ацетилирование/деацетилирование бактериальных полисахаридов может влиять на различные процессы, протекающие с их участием (Sutherland, 2001; Vuong et al., 2004; Downie, 2010).