Микробиология, 2021, T. 90, № 1, стр. 100-109

Идентификация фитат-гидролизующих ризобактерий рода Pantoea на основе фенотипических признаков и мультилокусного анализа

А. Д. Сулейманова a*, Д. Л. Иткина a, Д. С. Пудова a, М. Р. Шарипова a

a Казанский (Приволжский) федеральный университет
420008 Казань, Россия

* E-mail: aliya.kzn@gmail.com

Поступила в редакцию 03.05.2020
После доработки 21.08.2020
Принята к публикации 28.08.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В связи с гомологичной рекомбинацией, которая может нарушать границы видов, точная идентификация бактерий рода Pantoea тяжело достижима. В настоящее время в определении видов бактерий максимально эффективным является комплексный подход. Биохимическая идентификация с помощью системы API20E, филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК и MLSA анализ на основе частичных последовательностей генов fusA, pyrG, leuS, gyrB и rpoB показал, что выделенные почвенные фитат-гидролизующие штаммы являются членами рода Pantoea, а именно вида Pantoea brenneri. Изучение способности штаммов к фиксации атмосферного азота позволило отнести их к диазотрофам.

Ключевые слова: Pantoea, идентификация, MLSA, API20E, фиксация азот

Род Pantoea был впервые описан<французским ученым Gavini et al. (1989) и состоял из двух видов – Pantoea agglomerans sp. nov. и Pantoea dispersa sp. nov. На сегодняшний день род представлен 29 видами (http://www.bacterio.net/pantoea.html). Представители рода Pantoea выделяются из различных сред обитания, таких как почва, вода, продукты питания, растения, животные и люди (Chen et al., 2017). Одни из первых изолятов были признаны патогенами растений, вызывающими галлы, увядание, мягкую гниль и некрозы ряда сельскохозяйственных культур (Brady et al., 2008; Herrera et al., 2008). Другие же изоляты Pantoea, напротив, продуцируют антимикробные соединения и широко используются в качестве коммерческих биопрепаратов (Johnson et al., 1993). Например, бактерии вида P. ananatis обладают способностью разлагать гербициды без образования токсичных побочных продуктов и могут найти применение в биоремедиации почв (Pileggi et al., 2012). Вид P. agglomerans был первоначально идентифицирован как возбудитель болезней у широкого круга растений, однако многие штаммы, принадлежащие к этому виду, напротив, проявляют свойства, способствующие росту и развитию растений и биоконтролю над фитопатогенами (Dutkiewicz et al., 2016). Повсеместность, универсальность и генетическая пластичность изолятов Pantoea делают этот род идеальной группой не только для изучения характерных для нее процессов адаптации и оппортунизма, но и для разработки коммерческих продуктов с целью применения их в медицине и сельском хозяйстве (Walterson, Stavrinides, 2015).

Филогенетический анализ и сравнение с другими родами семейства Erwiniaceae показал, что род Pantoea весьма разнообразен. Биохимическая гетерогенность внутри рода усложняет идентификацию штаммов до вида. Точная идентификация бактерий рода Pantoea тяжело достижима, особенно учитывая тот факт, что гомологичная рекомбинация и латеральный перенос генов могут нарушать границы видов. В настоящее время в определении видов бактерий используется комплексный подход, включающий в себя как геномные, так и фенотипические характеристики штаммов (Deletoile et al., 2009).

Использование 16S рРНК является важным инструментом для классификации и систематики представителей рода Pantoea. Однако последовательности генов 16S рРНК демонстрируют низкое разрешение на внутриродовом уровне (Gonzalez et al., 2013), что делает невозможной надежную идентификацию бактерий до видов и подвидов. Таким образом, определение вида новых штаммов требует проведения более точного анализа, с использованием улучшенных таксономических методов, таких как мультилокусный филогенетический анализ (MLSA) (Gevers et al., 2005). В настоящее время определение видов бактерий основано на анализе мультилокусных последовательностей генов домашнего хозяйства, таких как fusA, gyrB, leuS, pyrG, rplB и rpoB, которые регулярно используются для уточнения межвидовых филогенетических позиций видов из рода Pantoea (Brady et al., 2008; Deletoile et al., 2009; Palmer et al., 2017; Tambong, 2019) Установлено, что подход MLSA, основанный на шести генах (leuS, fusA, gyrB, pyrG, rpoB и rplB), обеспечивает надежное разграничение видов у рода Pantoea (Tambong, 2019). Кроме того, анализ MLSA повышает качество филогенетической реконструкции и сводит к минимуму вес событий рекомбинации (Deletoile et al., 2009).

В данной работе мы сообщаем о таксономической характеристике выделенных нами штаммов Pantoea sp. 3.1, 3.2, 3.5.2 и 3.6.1 с использованием полифазного подхода, включающего в себя фенотипические, генотипические и филогенетические данные. Оценивается способность штаммов к фиксации молекулярного азота, которая, вкупе с установленной ранее фитат-гидролизующей активностью, может способствовать росту и развитию растений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы, питательные среды и условия культивирования. Все исследуемые бактерии были выделены из образцов почвы Республики Татарстан в 2009 г. по признаку максимальной фитат-гидролизующей активности (Suleimanova et al., 2015). Отбор штаммов производили на агаризованной среде PSM (phytase-screening medium), которая содержит фитат кальция в качестве единственного источника фосфора. С помощью ряда биохимических тестов штаммы были отнесены к порядку Enterobacterales, а анализ последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК, позволил идентифицировать изоляты как Pantoea sp. 3.1, 3.2, 3.5.2 и 3.6.1. Видовую принадлежность установить не удалось.

Для культивирования бактерий использовали cреду LB (Лурия–Бертони) (г/л): триптон – 10.0, дрожжевой экстракт – 5.0, NaCl – 5.0. Бактерии культивировали в термостате-шейкере фирмы “KA®KS 4000” (Германия) при 37°C и интенсивности качания 200 об./мин. Оптическую плотность культуры измеряли на спектрофотометре iMark™ (“Bio-Rad”, США) при длине волны 590 нм.

Биохимические тесты проводили с использованием метода API (Analytical Profile Index) 20E “bioMеrieux” (Франция). Стрипы API 20E использовали в соответствии с инструкцией производителя (“bioMеrieux”). Все тесты были проведены в трех биологических повторностях. Профили аналитических индексов были установлены через 24 и 48 ч инкубации при 37°C. Идентификация проводилась с использованием базы данных Биохимической идентификации “ABIS” (https://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html).

Амплификация, очистка и секвенирование ДНК. Для амплификации и секвенирования внутренних участков шести генов домашнего хозяйства fusA, gyrB, leuS, pyrG, rplB, rpoB, гена, кодирующего 16S rRNA и гена repA (с плазмиды патогенности) использовали праймеры, представленные в табл. 1 по протоколу, описанному в работе Deletoile et al. (2009). Олигонуклеотиды были синтезированы в компании “Евроген” (Москва).

Таблица 1.

Праймеры и условия, используемые для амплификации и секвенирования

Ген Праймер Программа ПЦР Последовательность (5'–3') Размер п.о. Назначение праймеров
16S rRNA 27 F 94°C – 4 мин
94°C – 1 мин
49°C – 1 мин
72°C – 1 мин
(35 циклов);
72°C –7 мин
GAGTTTGATCCTG 633 Амплификация
1492 R TACCTTGTTACGACT Реамплификация
repA Rep23220_5 94°C – 4 мин
94°C – 30 с
45°C – 30 с
72°C – 1 мин
(30 циклов);
72°C – 5 мин
TACATCACACCAAATTAAT   Амплификация
Rep25101_3 ATACTGTTAATGTAGTGATA Реамплификация
gyrB gyrB3 94°C – 2 мин
94°C – 1 мин
60°C – 1 мин,
72°C – 1 мин
(10 циклов);
94°C – 1 мин,
50°C – 1 мин,
72°C – 1 мин
(21 цикл);
72°C – 5 мин
GCG TAA GCG CCC GGG TAT GTA 417 Амплификация
gyrB4 CCG TCG ACG TCC GCA TCG GTC AT Реамплификация
gyrB3i AAC GCW ATC GAC GAA GC Амплификация, секвенирование
gyrB4i TGG AAV CCR TCR TTC CAC Реамплификация, секвенирование
leuS leuS3 CAG ACC GTG CTG GCC AAC GAR CAR
GT
642 Амплификация
leuS4 CGG CGC GCC CCA RTA RCG CT Реамплификация
fusA fusA3 CAT CGG TAT CAG TGC KCA CAT CGA 633 Амплификация
fusA4 CAG CAT CGC CTG AAC RCC TTT GTT   Реамплификация
pyrG pyrG3 GGG GTC GTA TCC TCT CTG GGT AAA
GG
306 Амплификация
pyrG4 GGA ACG GCA GGG ATT CGA TAT CNC
CKA
Реамплификация
rplB rplB3 CAG TTG TTG AAC GTC TTG AGT ACG
ATC C
333 Амплификация
rplB4 CAC CAC CAC CAT GYG GGT GRT C Реамплификация
rpoB Vic3 94°C – 4 мин
94°C – 30 с
50°C – 30 с
72°C – 30 с
(30 циклов);
72°C – 5 мин
GGC GAA ATG GCW GAG AAC CA 501 Амплификация
Vic4 GAG TCT TCG AAG TTG TAA CC Реамплификация

Для ПЦР-амплификации использовали DreamTaq ДНК-полимеразу “Thermo Scientific™” (США) (5 ед./мкл) – 0.08 мкл; 10× DreamTaq буфер (с добавлением 20 мМ MgCl2) – 1.5 мкл; праймеры (5 мкМ) – 0.5 мкл; смесь dNTP (10 мМ) – 0.5 мкл; безнуклеазную воду “Invitrogen™” (США) – 6.92 мкл. В качестве ДНК-матрицы использовали ресуспендированные в стерильной дистиллированной воде колонии свежей 18 ч культуры бактерий, выращенной при 37°С на агаризованной среде LB. ПЦР-амплификацию проводили с помощью амплификатора “T100™ Thermal Cycler Bio-Rad” (США), условия проведения реакций представлены в табл. 1. Полученные продукты очищали с помощью набора для очистки продуктов ПЦР GeneJET PCR Purification Kit (“Thermo Scientific™,” США). Секвенирование полученных ПЦР-продуктов проводили на секвенаторе SOLiD xl 5500 Wildfire (“Life Technologies”, США) Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ.

Мультилокусный филогенетический анализ. Первичный анализ полученных последовательностей проводили с использованием программы BLAST сервера NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Конкатенированные последовательности генов сравнивали с таковыми у типовых штаммов рода Pantoea, которые указаны в базе данных BacDive (https://bacdive.dsmz.de/). Филогенетический анализ исследуемых штаммов проводили в программе MEGA7 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 27004904). Всего в исследовании использовали последовательности генов 55 представителей рода Pantoea, которые были загружены из базы данных GenBank NCBI (табл. S1 ). Множественное выравнивание последовательностей было выполнено, используя программу ClustalW (Thompson et al., 1994). Выровненные последовательности генов использовались для построения филогенетического дерева по методу максимального правдоподобия (ML), основанного на Общей Обратимой модели времени (GTR), и по методу присоединения соседей (NJ), с использованием модели замен Jukes–Cantor (JC). Показатель достоверности порядка ветвления для деревьев ML и NJ оценивали с помощью бутстреп-анализа (1000 повторностей) и указывали в узлах ветвей в виде процентов, при этом оставляя значения достоверности свыше 70%. Последовательности генов fusA, leuS, pyrG, gyrB, rplB и rpoB всех четырех штаммов были депонированы в базу данных GenBank NCBI под номерами: для гена fusA – MT415378, MT415382, MT415386, MT415390; leuS – MT415379, MT415383, MT415387, MT415391; pyrG – MT415380, MT415384, MT415388, MT415392; rpoB – MT415381, MT415385, MT415389, MT415393; gyrB – MT646765, MT646766, MT646767, MT646768; rplB – MT646769, MT646770, MT646771, MT646772.

Способность штаммов к фиксации атмосферного азота. Для установления азотфиксирующей способности изолятов использовали селективную питательную среду Эшби (г/л дистиллированной воды): K2HPO4 – 0.1; KH2PO4 – 0.4; MgSO4 – 0.2; NaCl – 0.1; MgSO4 ∙ 7H2O – 0.08, CaCl2 – 0.02; FeCl3 – 0.01; Na2MoO4 – 0.002; сахароза – 20; pH 6.9 (Subba, 1977). Питательная среда Эшби не содержит в себе источника азота, поэтому только бактерии, обладающие способностью фиксировать азот из атмосферы, образуют колонии на данной среде. Изоляты инкубировали при 37°С в течении 24 ч, затем оценивали рост микроорганизмов.

Исследовали накопление биомассы бактериями на жидкой среде Эшби. Посевным материалом служил предварительно выращенный на среде Эшби инокулят исследуемых штаммов. Для посева использовали 2% инокулята и вносили в стерильную среду. Культивирование проводили на качалке при 37°С и 200 об./мин в течение 44 ч. Плотность клеток измеряли на спектрофотометре iMark™ (“Bio-Rad”, США) при ОП600.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика бактериальных изолятов. Почвенные изоляты рода Pantoea представляют собой грамотрицательные, факультативно анаэробные, не образующие спор мелкие палочки. Величина клеток односуточной культуры на питательной среде LB составляла 3–6 × 0.6 мкм. Исследуемые штаммы при росте на агаризованной среде синтезировали пигмент желтого цвета, за исключением изолята Pantoea sp. 3.5.2, который образовывал пигмент кремового цвета.

Вирулентность P. agglomerans, как патогена растений, связана с плазмидой pPATH, которая несет в себе островки патогенности (Manulis et al., 1991). Чтобы определить наличие или отсутствие плазмиды pPATH в исследуемых штаммах, мы провели ПЦР-анализ с использованием праймеров Rep23220_5 и Rep25101_3 (табл. 1). Данная пара праймеров позволяет амплифицировать ген repA, который кодирует репликазу А плазмиды pPATH. Установили, что ни один из исследуемых нами штаммов Pantoea sp. не несет в своем геноме ген repA. Таким образом, плазмида pPATH в изучаемых изолятах отсутствует, что указывает на авирулентность исследуемых нами штаммов по отношению к растениям.

Биохимические свойства. На основании тестов API 20E все почвенные изоляты имели типичные характеристики для рода Pantoea, к которому они относятся: они не обладали способностью ни расщеплять уреазу, ни декарбоксилировать аргинин, лизин и орнитин, ни выделять H2S из тиосульфата, не образовывали индол (табл. 2). У всех штаммов была положительная реакция на β-галактозидазу. При ферментации сахаров использовали глюкозу, маннозу, инозит, арабинозу, также они были способны гидролизовать желатин. Тест на цитохром С-оксидазу у всех штаммов был отрицательным.

Таблица 2.  

Биохимические свойства исследуемых штаммов Pantoea sp. 3.1, Pantoea sp. 3.2, Pantoea sp. 3.5.2, Pantoea sp. 3.6.1

Тест Обозначение теста Pantoea 3.1 Pantoea 3.2 Pantoea 3.5.2 Pantoea 3.6.1 Pantoea brenneri sp. nov.
ONPG Фермент
β-галактозидаза
+ + + + +
ADH Декарбоксилирование аргинина
LDC Декарбоксилирование лизина
ODC Декарбоксилирование орнитина
CIT Использование цитрата как единственного источника углерода + + +
H2S Производство сероводорода
URE Фермент уреаза
TDA Фермент триптофан-деаминаза + + + +  
IND Производство индола
VP Производство ацетоина + + + + +
GEL Разжижение желатина + + + + +
Ферментация сахаров:  
GLU Глюкоза + + + + +
MAN Манноза + + + + +
INO Инозит + + + + +
SOR Сорбит
RHA Рамноза + +
SAC Сахароза +
MEL Мелибиоза + + +
AMY Амигдалин + + +  
ARA Арабиноза + + + + +
ОХ Тест на цитохром с оксидазу

Однако штаммы отличались друг от друга по некоторым свойствам (табл. 2). Например, при ферментации сахаров изолят Pantoea sp. 3.2 обладал способностью ферментировать рамнозу и сахарозу, в отличие от отрицательных реакций на данные сахара у других штаммов. В свою очередь, штамм Pantoea sp. 3.5.2 не ферментировал мелибиозу и амигдалин, и не обладал способностью использовать цитрат в качестве единственного источника углерода, в отличие от других штаммов.

Идентификацию штаммов проводили путем считывания шкалы API 20E, отметив каждый тест выставленным баллом в триплетах с использованием базы данных биохимической идентификации “ABIS” (табл. 3). Изоляты Pantoea sp. 3.1 и Pantoea sp. 3.6.1, обладающие одинаковым биохимическим профилем, идентифицированы как Pantoea stewartii subsp. indologenes (88 и 91% идентичности). Единственный штамм, ферментирующий рамнозу и сахарозу, Pantoea sp. 3.2, был идентифицирован как P. ananatis (91%). Изолят Pantoea sp. 3.5.2, не использующий цитрат как единственный источник углерода и не ферментирующий мелибиозу и амигдалин, идентифицирован как Pantoea agglomerans (83%) (табл. 3). Процент точности идентификации видов бактерий с помощью ABIS считается допустимым в диапазоне от 88 до 99%.

Таблица 3.

Идентификация почвенных изолятов с помощью базы данных “ABIS”

Почвенный изолят Штамм Процент идентичности
Pantoea 3.1 P. stewartii subsp. indologenes 88
Pantoea 3.2 P. ananatis 91
Pantoea 3.5.2 P. agglomerans 83
Pantoea 3.6.1 P. stewartii subsp. indologenes 91

Идентификация штаммов в системе API 20E часто оказывается на уровне предположительной и требует дополнительной верификации (Афанасьев и соавт., 2014). При использовании системы API 20E существует ряд ограничений в интерпретации результатов: оценка изменения цвета ячейки может быть субъективной, длительная ручная обработка изолятов, усложненная система архивации и поиска информации в оценочных листах API. Например, при идентификации 58 штаммов Burkholderia pseudomallei и 23 штаммов B. mallei с использованием данной системы корректное определение вида наблюдалось лишь в 60% случаев (Glass, Popovic, 2005). Для более достоверной идентификации видов необходимо дополнительно применение других молекулярно-генетических методов.

Филогенетический анализ. Идентификацию изолятов проводили путем анализа гена, кодирующего 16S рРНК. Последовательность гена 16S рРНК исследуемых штаммов имела высокую степень гомологии (более 99%) с генами других видов рода Pantoea: 99.8% со штаммами P. agglomerans, 99.6% co штаммами P. vagans, 99.4% со штаммами P. ananatis, P. conspicua и 99.2% со штаммами P. anthophila. Таким образом, анализ последовательности генов, кодирующих 16S рРНК штаммов 3.1, 3.2, 3.5.2, 3.6.1 позволил подтвердить принадлежность выделенных микроорганизмов к семейству Erwiniaceae, роду Pantoea, но не позволил однозначно определить вид исследуемых изолятов. Установлено, что порог сходства генов для классификации видов составляет 98.7–99% (Stackebrandt et al., 2006). Предыдущие исследования показали ограничения последовательности гена 16S рРНК как единственного маркера для сравнительных филогенетических исследований – 16S рРНК часто имеет слабую дискриминационную силу, может не отражать общие взаимосвязи и может быть неточным в идентификации некоторых видов (Janda et al., 2007). Полученные нами результаты демонстрируют, что разнообразие 16S рРНК внутри рода Pantoea выше данного значения, подтверждая, что ген 16S рРНК не содержит достаточных вариаций для дифференциации видов в пределах данного рода.

Мультилокусный анализ (MLSA) был предложен как лучший альтернативный подход к определению филогении новых изолятов (Palmer et al., 2017; Tambong et al., 2019), в частности, видовую идентификацию внутри рода Pantoea. Уровень генетического полиморфизма в генах домашнего хозяйства достаточно высок для оценки филогенетического родства между микроорганизмами (Maiden, 2006). Ген leuS кодирует лейцил-тРНК-синтетазу, ген pyrG кодирует CTP-синтазу; ген rpoB кодирует β-субъединицу РНК-полимеразы, ген gyrB является структурным геном для β-субъединицы ДНК-гиразы, ген fusA кодирует фактор элонгации белковой цепи (EFG) (Holmes et al., 2004). Мультилокусный филогенетический анализ был основан на сравнении последовательностей пяти генов домашнего хозяйства – fusA, leuS, pyrG, gyrB и rpoB (Tambong et al., 2014). Кроме вышеперечисленных генов, были секвенированы локусы гены rplB, однако использовать их для филогенетического анализа не удалось, поскольку последовательности этого гена в базе данных представлены лишь для 28 штаммов из 55 используемых представителей.

Для четырех исследуемых штаммов были получены частичные последовательности пяти кодирующих белок генов, которые впоследствии были объединены в следующем порядке: fusA (588 п.н.), leuS (642 п.н.), pyrG (372 п.н.), rpoB (409 п.н.) и gyrB (774 п.н.). Таким образом, общая длина конкатенированной последовательности составила 2785 п.н. Сравнение с помощью BLAST NCBI объединенных последовательностей исследуемых и типовых штаммов рода Pantoea позволило провести идентификацию изолятов. Процент гомологии среди штаммов варьировал от 80.0 до 99% (табл. S2 ). При этом все четыре штамма показали высокий процент гомологии с типовым штаммом вида P. brenneri LMG 5343 – более 99%.

Филогенетическое дерево, полученное при сравнении выровненных объединенных последовательностей генов по методу максимального правдоподобия (ML), показало наличие четырех основных филогенетических подгрупп рода PantoeaP. stewartii, P. ananatis, P. agglomerans и P. vagans (рис. 1). При этом исследуемые штаммы образовали отдельный кластер с представителями вида P. breneriiP. brenerii В024858 и P. brenerii В016381, который четко отделен от остальных филогрупп, демонстрируя процент достоверности узла равный 91%. Кроме того, степень достоверности данного узла так же была подтверждена построением филогенетического дерева по методу присоединения соседей (NJ) (рис. 1).

Рис. 1.

Филогенетическое дерево 59 представителей рода Pantoea, основанное на анализе объединенных последовательностей генов fusA, leuS, pyrG, gyrB и rpoB. Дерево построено в программе MEGA7 методом максимального правдоподобия (ML). Черными кругами обозначены узлы, которые подтверждены алгоритмом присоединения соседей (NJ). Цифрами в узлах филогенетического дерева показана достоверность ветвления на основе бутстреп-анализа 1000 альтернативных деревьев (в %), при этом значащими признаются значения больше 70%. Шкала масштаба показывает эволюционное расстояние, соответствующее 2 заменам на каждые 100 нуклеотидов.

Ранее, при сравнении филогенетических деревьев, построенных на основе одного гена, с деревьями, полученными на основе сцепленных последовательностей, было выявлено, что ген leuS является надежным филогенетическим маркером для идентификации новых штаммов рода Pantoea (Tambong et al., 2014). Исходя из этого, нами дополнительно было построено филогенетическое дерево на основе гена домашнего хозяйства leuS, с использованием методов NJ и ML. Дерево в целом демонстрирует схожую топологию с деревом на основе сцепленных последовательностей, однако есть штаммы, которые меняют свое местоположение (рис. S1 ). В данном случае исследуемые штаммы образовали обособленный кластер со всеми представителями вида P. brenneri, используемыми в данном исследовании. Это различие в топологии штаммов может быть следствием различных процессов эволюции, которые претерпевают гены, используемые в мультилокусном анализе. Тем не менее, исходя из полученных данных, можно предположить, что исследуемые изоляты являются представителями вида P. brenneri.

Идентификация изолятов с помощью тест-системы API 20E не подтверждается результатами филогенетического анализа. Виды P. stewartii sub-sp. indologenes, P. ananatis и P. agglomerans образуют отдельные филогенетические кластеры, которые не включают в себя изучаемых изолятов (рис. 1). Биохимические свойства штаммов незначительно отличаются друг от друга и от типового штамма P. brenneri (табл. 2). Однако известно, что представителям рода Pantoea присуща биохимическая гетерогенность даже в рамках одного вида. Например, в геноме P. vagans C9-1 обнаружены два кластера генов для утилизации сорбитола, которые отсутствуют у других штаммов P. vagans (Smits et al., 2011). Следовательно, эти данные не противоречат идентификации выделенных штаммов как P. brenneri.

Способность штаммов к фиксации атмосферного азота. Изучали способность четырех бактериальных штаммов P. brenneri к фиксации атмосферного азота с помощью дифференциальной питательной среды Эшби. Рост колоний был зафиксирован через 12 ч культивирования при 37°С, что говорит о способности штаммов к использованию молекулярного азота, поскольку источник азота в питательной среде отсутствовал. Исследуемые бактерии при росте на твердой питательной среде Эшби образуют плоские, блестящие, гладкие с ровными краями колонии (рис. 2а). На данной питательной среде пигмент не образовывался, все колонии были кремового цвета.

Рис. 2.

Рост бактериальных штаммов Pantoea sp. на дифференциальной питательной среде Эшби: a – образование колоний на агаризованной среде; б – динамика роста бактерий на жидкой безазотной среде Эшби.

Для подтверждения способности штаммов P. brenneri к азотфиксации изучали динамику накопления биомассы на жидкой безазотной среде Эшби, используя в качестве инокулятов 12-часовые культуры штаммов на этой же среде. Все исследуемые штаммы успешно росли в жидкой безазотной среде, демонстрируя стандартную кривую роста (рис. 2б). В течении первых 10 ч культивирования наблюдался активный рост культуры, затем бактерии переходили в длительную стационарную фазу, после которой происходило снижение уровня накопления биомассы. Аналогичная кривая роста с активным накоплением биомассы в первые часы культивирования наблюдалась у штамма P. agglomerans на безазотной среде Эшби (Doty et al., 2009).

Таким образом, с помощью фенотипических методов установили, что исследуемые бактерии можно отнести к группе азотфиксирующих бактерий (диазотрофы) (Quispel, 1988). Способность к фиксации азота бактериями рода Pantoea отмечается несколькими авторами (Loiret et al., 2004; Dutkiewicz et al., 2016). Была отмечена способность к фиксации азота штаммом P. agglomerans. Бактериальный штамм способен фиксировать азот как в чистой культуре, так и в сочетании с растениями пшеницы в гидропонике (Merbach et al., 1997).

В заключение отметим, что только с помощью MLSA на основе частичных последовательностей генов fusA, pyrG, leuS, gyrB и rpoB нам удалось произвести идентификацию почвенных изолятов до вида – P. brenneri. Установлено, что штаммы P. brenneri 3.1, 3.2, 3.5.2 и 3.6.1, помимо гидролиза почвенных фитатов, также обладают способностью к фиксации молекулярного азота, что может способствовать росту и развитию растений за счет увеличения доступности макроэлементов. Соответственно, штаммы P. brenneri 3.1, 3.2, 3.5.2 и 3.6.1 могут быть рассмотрены в качестве кандидатов для создания экологически чистого биопрепарата, заменяющего ряд химических удобрений.

Список литературы

  1. Афанасьев М.В., Миронова Л.В., Басов Е.А., Остяк А.С., Куликалова Е.С., Урбанович Л.Я., Балахонов С.В. MA-LDI-TOF масс-спектрометрический анализ в ускоренной идентификации микроорганизмов рода Vibrio // Мол. генет., микробиол. вирусол. 2014. № 3. С. 22–28.

  2. Brady C., Cleenwerck I., Venter S., Vancanneyt M., Swings J., Coutinho T. Phylogeny and identification of Pantoea species associated with plants, humans and the natural environment based on multilocus sequence analysis (MLSA) // Syst. Appl. Microbiol. 2008. V. 31. P. 447–460.

  3. Chen C., Xin K., Liu H., Cheng J., Shen X., Wang Y., Zhanga L. Pantoea alhagi, a novel endophytic bacterium with ability to improve growth and drought tolerance in wheat // Sci. Rep. 2017. V. 7. Art. 41564.

  4. Deletoile A., Decre D., Courant S., Passet V., Audo J., Grimont P., Arlet G., Brisse S. Phylogeny and identification of Pantoea species and typing of Pantoea agglomerans strains by multilocus gene sequencing // Bacteriology. 2009. V. 47. P. 300–310.

  5. Doty S.L., Oakley B., Xin G., Kang J.W., Singleton G., Khan Z., Vajzovic A., Staley J.T. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow // Symbiosis. 2009. V. 47. P. 23–33.

  6. Dutkiewicz J., Mackiewicz B., Lemieszek M.K., Golec M., Milanowski J. Pantoea agglomerans: a mysterious bacterium of evil and good. Part IV. Beneficial effects // Ann. Agric. Environ. Med. 2016. V. 23. P. 206–222.

  7. Gavini F., Mergaert J., Beji A., Mielcarek C., Izard D., Kers-ter S.K., De Ley J. Transfer of Enterobacter agglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 to Pantoea gen. nov. as Pantoea agglomerans comb. nov. and description of Pantoea dispersa sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1989. V. 39. P. 337–345.

  8. Gevers D., Cohan F.M., Lawrence J.G., Spratt B.G., Coenye T., Feil E.J., Stackebrandt E., Van de Peer Y., Vandamme P., Thompson F.L., Swings J. Re-evaluating prokaryotic species // Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3. P. 733–739.

  9. Glass M.B., Popovic T. Preliminary evaluation of the API 20NE and RapID NF Plus Systems for rapid identification of Burkholderia pseudomallei and B. mallei // Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 479–483.

  10. Gonzalez A.J., Cleenwerck I., De Vos P., Fernandez-Sanz A.M. Pseudomonas asturiensis sp. nov., isolated from soybean and weeds // Syst. Appl. Microbiol. 2013. V. 36. P. 320–324.

  11. Herrera C., Koutsoudis M., Wang X., Bodman S. Pantoea stewartii subsp. stewartii exhibits surface motility, which is a critical aspect of stewart’s wilt disease development on maize // Mol. Plant Microbe Interact. 2008. V. 21. P. 1359–1370.

  12. Holmes D.E., Nevin K.P., Lovley D.R. Comparison of 16S rRNA, nifD, recA, gyrB, rpoB and fusA genes within the family Geobacteraceae fam. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1591–1599.

  13. Janda J.M., Abbott S.L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls // J. Clin. Microbiol. 2007. V. 45. P. 2761–2764.

  14. Johnson K.B., Stockwell V.O., McLaughlin R., Sugar D., Loper J.E., Roberts R.G. Effect of antagonistic bacteria on establishment of honey bee-dispersed Erwinia amylovora in pear blossoms and on fire blight control // Phytopathology. 1993. V. 83. P. 995–1002.

  15. Loiret F.G., Ortega E., Kleiner D., Ortega-Rodes P., Rodes R., Dong Z. A putative new endophytic nitrogen-fixing bacterium Pantoea sp. from sugarcane // J. Appl. Microbiol. 2004. V. 97. P. 504–511.

  16. Maiden M.C. Multilocus sequence typing of bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2006. V. 60. P. 561–588.

  17. Manulis S., Gafni Y., Clark E., Zutra D., Ophir Y., Barash I. Identification of a plasmid DNA probe for detection of strains of Erwinia herbicola pathogenic on Gypsophila paniculata // Phytopathology. 1991. V. 81. P. 54–57.

  18. Merbach W., Ruppel S., Schulze J. Dinitrogen fixation of microbe-plant associations as affected by nitrate and ammonium supply // Isotopes Environ. Health Stud. 1997. V. 33. P. 67–73.

  19. Palmer M., Steenkamp E.T., Coetzee M.P., Chan W.Y., van Zyl E., De Maayer P., Coutinho T.A., Blom J., Smits T.H., Duffy B., Venter S.N. Phylogenomic resolution of the bacterial genus Pantoea and its relationship with Erwinia and Tatumella // Antonie van Leeuwenhoek. 2017. V. 110. P. 1287–1309.

  20. Pileggi M., Pileggi S.A., Olchanheski L.R., Silva P.A., Munoz A.M., Koskinen W.C., Barber B., Sadowsky M.J. Isolation of mesotrione-degrading bacteria from aquatic environments in Brazil // Chemosphere. 2012. V. 86. P. 1127–1132.

  21. Quispel A. Hellriegel and Wilfarth’s discovery of (symbiotic) nitrogen fixation hundred years ago // Nitrogen Fixation: Hundred Years after / Eds. Bothe H., de Bruijn F.J., Newton W.E. Stuttgart–N.Y.: Gustav Fischer Verlag, 1988. P. 3–12.

  22. Smits T.H.M., Rezzonico F., Kamber T., Blom J., Goesmann A., Ishimaru C.A., Frey J.E., Stockwell V.O., Duffy B. Metabolic versatility and antibacterial metabolite biosynthesis are distinguishing genomic features of the fire blight antagonist Pantoea vagans C9-1 // PLoS One. 2011. V. 6. Art. e22247.

  23. Suleimanova A.D., Beinhauer A., Valeeva L.R., Chastukhina I.B., Balaban N.P., Shakirov E.V., Greiner R., Sharipova M.R. Novel glucose-1-phosphatase with high phytase activity and unusual metal ion activation from soil bacterium Pantoea sp. strain 3.5.1 // Appl. Environ. Microbiol. 2015. V. 81. P. 6790–6799.

  24. Stackebrandt E., Ebers J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards // Microbiol. Today. 2006. V. 33. P. 152–155.

  25. Subba R. Soil Microorganisms and Plant Growth. Oxford and IBH Publishing Co., India, 1977. 287 p.

  26. Tambong J.T., Xu R., Kaneza C.A., Nshogozabahizi J.C. An in-depth analysis of a multilocus phylogeny identifies leuS as a reliable phylogenetic marker for the genus Pantoea // Evol. Bioinform. 2014. V. 10. P. 115–125.

  27. Tambong J.T. Taxogenomics and systematics of the genus Pantoea // Front. Microbiol. 2019. V. 10. P. 24–63.

  28. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4673–4680.

  29. Walterson A.M., Stavrinides J. Pantoea: insights into a highly versatile and diverse genus within the Enterobacteriaceae // FEMS Microbiol. Rev. 2015. V. 39. P. 968–984.

Дополнительные материалы

скачать EMS_1.jpg
Рис. S1. Филогенетическое дерево 59 представителей рода Pantoea, основанное на анализе последовательности гена leuS. Дерево построено в программе MEGA7 методом максимального правдоподобия (ML). Черными кругами обозначены узлы, которые подтверждены алгоритмом присоединения соседей (NJ). Цифрами в узлах филогенетического дерева показана достоверность ветвления на основе бутстреп-анализа 1000 альтернативных деревьев (в %), при этом значащими признаются значения больше 70%. Шкала масштаба показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов.
 
 
скачать EMS_2.docx
Таблица S1. Названия микроорганизмов, используемых в данном исследовании.
 
Таблица S2. Сравнение конкатенированных последовательностей генов исследуемых и типовых штаммов рода Pantoea. Степень гомологии указана в процентах.