Микробиология, 2021, T. 90, № 2, стр. 243-246

Исследования последних лет свидетельствуют о существовании оси кишечник–мозг и вовлеченности микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в этиологию расстройств аутистического спектра (РАС) у детей (обзор см. Bezawada et al., 2020). Последние исследования показали эффективность трансплантации фекальной микробиоты в терапии РАС (Kang et al., 2020). Одной из групп бактерий, повышенную численность которых обнаруживают у детей с РАС, являются сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) рода Desulfovibrio (Finegold, 2011; Finegold et al., 2012; De Angelis et al., 2013; Weston et al., 2015; Liu et al., 2019). Более того, была отмечена корреляция между численностью Desulfovibrio и интенсивностью проявлений РАС (Tomova et al., 2015). Современные биоинформатические исследования показали связь численности Desulfovibrio в кишечнике с биополярными нарушениями у детей (Cheng et al., 2020). Однако возможные механизмы, связывающие численность этой группы с патофизиологией, остаются неясными. В качестве гипотез рассматривают токсичное действие образуемого бактериями сероводорода, образование липополисахаридов и возможное участие в воспалительных процессах (Weston et al., 2015). Мы предполагаем, что одним из возможных механизмов влияния СРБ может быть иммобилизация железа в бионедоступные формы. Недостаток железа является одной из известных характеристик пациентов с РАС. Повышенное содержание СРБ, включая Desulfovibrio, может приводить к биоминерализации железа в форме сульфидов в ЖКТ.

Эксперименты, направленные на прояснение возможной связи СРБ с патофизиологией РАС, затруднены отсутствием чистых культур. Нам не известны сообщения о культивируемых формах СРБ, выделенных из фекалий пациентов с РАС. В этом исследовании мы впервые выделили чистые культуры Desulfovibrio из микробиоты кишечника детей с РАС и оценили их способность выводить железо из раствора путем осаждения в малорастворимые сульфиды.

Для получения накопительных культур сульфидогенов были использованы фекалии детей возрастной группы от 7 до 13 лет с диагностированным РАС. При получении накопительных культур сульфидогенов использовали среду Видделя–Бака (WB) с лактатом в качестве донора электронов и добавлением растворов микроэлементов, витаминов, селената-вольфрамата, сульфида натрия в качестве восстановителя (Widdel, Bak, 1992) и модифицированную добавлением элементного железа (Карначук и соавт., 2006; Karnachuk et al., 2019). Инкубацию проводили в анаэробных условиях при температуре 37°С. Накопительные культуры, активно восстанавливающие сульфат, отбирали для получения колоний на агаризованной (1.5%) среде. После выделения колоний окончательную очистку культур проводили методом десятикратных разведений. В результате были выделены два морфологически однородных изолята, обозначенные штамм AY5 и штамм 981. Для определения филогенетического положения изолятов амплифицировали ген 16S рРНК с праймерами 27F-1492R. Выделение ДНК и условия амплификации аналогичны описанным ранее (Frank et al., 2016). Филогенетический анализ последовательности гена 16S рРНК показал, что оба штамма относятся к роду Desulfovibrio (рис. 1). Ближайшим валидно описанным родственником штамма AY5 является типовой штамм Desulfovibrio desulfuricans DSM 642, сходство последовательностей гена 16S рРНК с которым составляло 99.72%. Штамм 981 был близок к другому модельному сульфатредуктору, Desulfovibrio vulgaris, со сходством последовательностей 99.02%.

Рис. 1.

Дерево, показывающее филогенетическое положение штаммов AY5 и 981 на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК, определенное методом Neighbor-Joining. Бутстрепы рассчитаны из 1000 итераций. Дерево построено с использованием MEGA X.

Эксперименты по изучению иммобилизации железа D. desulfiricans AY5 были проведены в периодической культуре в сывороточных бутылях объемом 250 мл с использованием той же среды, что и для выделения чистых культур, и дополнительным внесением двухвалентного железа в концентрации 100 мг/л. Инкубировали пробы в течение 8, 24 и 32 сут при оптимальной температуре роста 37°С, после чего образованный осадок осаждали центрифугированием и проводили дифракционный анализ как описано ранее (Ikkert et al., 2103). В осадке, образованном штаммом AY5, обнаружили кристаллические сульфиды железа, грейгит (Fe₃S₄) и пирит (FeS₂) (рис. 2). Грейгит образовывался уже на 8-е сут, в то время как пирит обнаруживали только после 32 сут культивирования. Обе кристаллические фазы иммобилизуют железо из раствора и с трудом подвержены ре-окислению. Исследование штамма AY5 показало присутствие микровезикул на клеточной стенке, которые могут выполнять роль дополнительных сайтов нуклеации микрокристаллов сульфидов (рис. 2). Дефицит железа является известной характеристикой аутистов (Yanagimoto et al., 2020). Выведение железа из раствора за счет связывания в трудно окисляемые кристаллические формы, хорошо известно для природных экосистем, например, осадков морей. Реакции образования кристаллических сульфидов железа могут происходить и в ЖКТ индивидуумов с РАС, аналогично тому, как это происходит в природе. Кроме того, микрокристаллы грейгита обладают магнитными свойствами и могут влиять на биологические структуры через образование магнитных полей. По последним данным магнитные поля ферромагнитных минералов оказывают влияние на ионные каналы в мембране и вызывают изменение структуры, функций и морфологии клеток (обзор см. Svobodova et al., 2019).

Рис. 2.

Вверху: дифрактограммы осадка из эксперимента по биоминерализации железа штаммом D. desulfuricans AY5. Обозначения: 1 – инкубация в течение 24 сут; 2 – инкубация в течение 32 сут; Gr – грейгит, Fe₃S₄; Py – пирит, FeS₂. Внизу: трансмиссионная электронная микрофотография ультратонких срезов клеток штамма AY5 с электронно-плотными кристаллами (предположительно, сульфида железа) на клеточной стенке и везикулами (показаны стрелками).