Микробиология, 2021, T. 90, № 2, стр. 191-203

Влияние сверхэкспрессии гена rosR на образование биопленок бактериями Rhizobium leguminosarum

З. Р. Вершинина a*, О. В. Чубукова a, Ю. М. Никоноров a, Л. Р. Хакимова a, А. М. Лавина a, Л. Р. Каримова a, Ан. Х. Баймиев a, Ал. Х. Баймиев a

a Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук
450098 Уфа, Россия

* E-mail: zilyaver@mail.ru

Поступила в редакцию 02.09.2020
После доработки 20.11.2020
Принята к публикации 30.11.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Кодируемый геном rosR регуляторный белок участвует в процессах, связанных с адаптацией клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum к изменяющимся условиям окружающей среды. Он влияет на экспрессию многих генов, связанных с синтезом экзополисахаридов, которые играют критическую роль в формировании биопленок бактериями на различных поверхностях. Целью данной работы являлось изучение влияния сверхэкспрессии гена rosR у ризобий R. leguminosarum на образование биопленок на инертных поверхностях и корнях гетерологичных растений-макросимбионтов путем получения рекомбинантных вариантов штаммов с дополнительной копией гена rosR под управлением промотора Pm. Проведенный анализ рекомбинантных штаммов показал, что дополнительные экспрессируемые копии гена rosR позволяли ризобиям преодолевать ингибирующее воздействие на биопленкообразование низких концентраций кальция в среде, воздействие протеаз, детергентов и более эффективно формировать биопленки на поверхности корней томата и клевера. Полученные результаты открывают перспективы для использования rosR в качестве инструмента как для повышения эффективности эндосимбиоза ризобий с бобовыми растениями, так и для формирования устойчивых ассоциативных взаимодействий с другими сельскохозяйственными культурами.

Ключевые слова: Rhizobium leguminosarum, ген rosR, доза гена, биопленка, растительно-микробное взаимодействие, клевер, томат

Одним из наиболее изученных взаимодействий между растениями и микроорганизмами является бобово-ризобиальный симбиоз. Ризобии – это грамотрицательные бактерии, формирующие азотфиксирующие клубеньки на корнях бобовых растений. Симбиоз растений с этими бактериями играет значительную роль в круговороте азота в биосфере, а бобовые растения являются одними из самых важных сельскохозяйственных растений в мире. Rhizobium leguminosarum bv. trifolii в природе вступает в симбиоз с растениями клевера (Trifolium spp.) (Kopycińska et al., 2018). В свободноживущем состоянии этот микросимбионт подвергается воздействию, в том числе и негативному, различных факторов окружающей среды. Чтобы приспособиться к изменяющимся условиям существования, ризобии выработали ряд эффективных стратегий защиты, которые позволяют им выживать в почве. Важнейшей адаптационной формой развития этих бесспоровых бактерий является формирование биопленок на различных поверхностях (Rinaudi et al., 2006; Rachwał et al., 2017).

Биопленки служат для многих бактерий физическим барьером от токсичных соединений и защитой от неблагоприятных условий окружающей среды. Кроме того, для клубеньковых бактерий (ризобий) биопленкообразование является фактором, определяющим конкурентоспособность штаммов ризобий в почвенных условиях. В этом процессе немаловажную роль играют экзополисахариды (ЭПС), биосинтез и функции которых для R. leguminosarum, в отличие, например, от Sinorhizobium meliloti, изучены на сегодняшний день недостаточно. У R. leguminosarum основной набор генов биосинтеза ЭПС (более 20 генов) образует кластер Pss-I в хромосоме (González et al., 2006; Вершинина и соавт., 2020). Данные о регуляции биосинтеза ЭПС в R. leguminosarum очень фрагментарны. До сих пор было описано лишь несколько регуляторных генов, участвующих в этом процессе. К ним относятся гены psiA и psrA, расположенные на симбиотической мегаплазмиде (pSym), и гены exoR, pssB, rosR и expR, расположенные на хромосоме R. leguminosarum (Reeve et al., 1996; Janczarek et al., 1999; Janczarek, Skorupska, 2007; Edwards et al., 2009).

Регуляторный белок, кодируемый геном rosR, необходим для адаптации R. leguminosarum к изменяющимся условиям окружающей среды. Этот белок влияет на экспрессию многих генов, связанных с синтезом ЭПС и поверхностных компонентов клеточной стенки ризобий, выделением внеклеточных белков и другими процессами. Было показано, что RosR, массой 15.7 кДа, содержит структурный мотив “цинковый палец” C2H2, ответственный за связывание с промоторными областями таких генов, как exoB, exoR, prsD, pssA, pssB, pssK и plyA (Janczarek, Skorupska, 2007; Jaszek et al., 2014; Rachwał et al., 2017). Продукт гена rosR R. leguminosarum bv. trifolii принадлежит к семейству регуляторов транскрипции Ros/MucR, которые участвуют в регуляции синтеза ЭПС у нескольких видов ризобий, включая S. meliloti, Rhizobium etli и Agrobacterium tumefaciens (D’Souza-Ault et al., 1993; Keller et al., 1995; Bittinger et al., 1997; Chou et al., 1998). Мутации в rosR и mucR влияют на образование биопленок как свободноживущих ризобий, так и на начальных этапах симбиоза с растениями-хозяевами. Так экспрессия гена rosR необходима R. etli не только для производства ЭПС, а также для колонизации и образования клубеньков на фасоли (Phaseolus spp.) (Bittinger et al., 1997). Мутантный по rosR штамм R. leguminosarum продуцирует значительно меньшее количество ЭПС, чем дикий тип, он более чувствителен к поверхностно-активным веществам (ПАВ), проявляет пониженную подвижность и образует не фиксирующие азот клубеньки на корнях клевера (Rachwał et al., 2015, 2016, 2017). Все эти данные свидетельствуют о том, что RosR является важным белком, участвующим в клеточных процессах на различных этапах становления и функционирования бобово-ризобиального симбиоза.

Целью данной работы являлось изучение влияния сверхэкспрессии rosR на образование биопленок рекомбинантными по данному гену штаммами Rhizobium leguminosarum bv. viciae на инертных поверхностях и корнях гетерологичных растений макросимбионтов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы и растения. В качестве объектов были использованы штаммы R. leguminosarum bv. viciae VSy12 и VSy3 из коллекции клубеньковых и ризосферных бактерий “Симбионт” ИБГ УФИЦ РАН, выделенные из клубеньков дикорастущего бобового растения Южного Урала горошка лесного (Vicia sylvatica L.). Бактерии культивировали на среде YM (масс. % в водном растворе: маннитол – 1, дрожжевой экстракт – 0.04, NaCl – 0.01, MgSO4 – 0.01, K2HPO4 ∙ 3H2O – 0.05) и RDM (Vincent, 1970) при оптимальной температуре 28°C.

Escherichia coli XL1-Blue выращивали на среде LB (масс. % в водном растворе: бактотриптон – 1, дрожжевой экстракт – 0.5, NaCl – 0.5) при температуре 37°C.

В качестве селективного антибиотика для трансформированных штаммов использовали ампициллин в конечной концентрации 100 мг/л (“Fisher scientific”, США). Экспрессию гена rosR, находящегося в составе плазмиды pJB658 под контролем индуцируемого промотора Pm, активировали 1 мM m-толуиловой кислотой (“Sigma Aldrich”, США).

В качестве макросимбионтов были выбраны клевер белый (Trifolium repens L.) сорта Ривендел (“DLF”, Дания) и томат сорта Грунтовый Грибовский 1180 (“СибНИИРС”, Россия). Выбор клевера белого был обусловлен тем, что фенотипические проявления штаммов, трансформированных дополнительной копией гена rosR, ранее изучались на растениях клевера. Это позволило провести сравнения активностей колонизации корней и образования биопленок полученных нами рекомбинантных штаммов с литературными данными. Выбор томата объясняется тем, что ранее была разработана система агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Грунтовый Грибовский 1180 геном лектина гороха посевного psl, что позволило получить устойчивые корневые ассоциации этой важной для сельского хозяйства культуры с ризобиями, защищающими от фитопатогенных грибов (Вершинина и соавт., 2015). Кроме того, трансформация томата ризобиальным агглютинином RapA1 способствовала созданию эффективных симбиотических систем для фиторемедиации почв, загрязненных кадмием (Вершинина и соавт., 2019).

Получение генно-инженерной конструкции, несущей ген rosR, на основе вектора pJB658GFP. В рамках данного исследования были получены векторные конструкции на основе плазмиды широкого круга хозяев pJB658 с копийностью 5–7 на клетку (Blatny et al., 1997). В вектор pJB658 был клонирован ген зеленого флуоресцентного белка gfp под контролем конститутивного промотора T5. Для этого фрагмент ДНК, включающий промотор T5 и ген gfp был вырезан рестриктазой HindIII из полученного ранее вектора pJN105TurboGFP (Баймиев и соавт., 2011) и клонирован по аналогичному сайту в вектор pJB658 (рис. 1). Ризобии, трансформированные полученной плазмидой pJB658GFP, имели устойчивое зеленое окрашивание, что значительно облегчало отбор рекомбинантных штаммов и позволяло отслеживать стабильность данной плазмиды в процессе культивирования бактерий.

Рис. 1.

Этапы получения генно-инженерных конструкций pJB658GFP и pJBGFProsR для экспрессии генов gfp и rosR в клетках ризобий.

Для секвенирования и амплификации полноразмерной последовательности гена rosR из R. leguminosarum VSy3 были использованы праймеры 5'-TACGTACATATGACGGATATAGCGACCGGCAA-3' (с сайтом для рестриктазы NdeI), 5'-TACGATGAATTCTTCGCACGTTCCTGACTGGCT-3' (с сайтом для рестриктазы EcoRI). Праймеры были подобраны к последовательности ДНК R. leguminosarum bv. trifoli штамм 24.1. (AY683453.1). Последующее секвенирование показало идентичность генов rosR для изучаемых штаммов ризобий. Амплификация проводилась с помощью высокоточной термостабильной ДНК полимеразы Q5 (“NEB”, Великобритания). Размер полученного амплификата составил 564 п.н., который включал полноразмерную последовательность гена rosR и 111 п.н. из 3'-нетранслируемой области. Затем плазмиду pJB658GFP и ПЦР продукт расщепляли соответствующими рестрикционными эндонуклеазами NdeI и EcoRI (“NEB”, Великобритания) и лигировали фрагменты ДНК с помощью Т4 ДНК лигазы (“NEB”, Великобритания) (рис. 1). Таким образом, в плазмиду pJB658GFP был направленно клонирован ген rosR под регуляцией индуцируемого промотора Pm. Полученная конструкция была проверена секвенированием, и в дальнейшем ей были трансформированы путем электропорации штаммы R. leguminosarum VSy12 и VSy3.

Выделение бактериальной ДНК, подготовка компетентных клеток и их трансформация, а также электрофорез фрагментов ДНК проводились согласно (Sambrook et al., 1989).

Исследование уровня экспрессии гена rosR в контрольных и рекомбинантных штаммах методом ПЦР в реальном времени. РНК из бактерий выделяли с применением набора FastRNA Pro BlueKit (“MP Biomedicals”, США). Для активации экспрессии гена rosR культура клеток R. leguminosarum предварительно выращивалась в течение 1 сут на среде RDM с добавлением m-толуиловой кислоты (1 мМ) до OD660 0.9–1.0. Для построения кДНК использовали MMLV-ревертазу (“Евроген”, Россия). Для постановки ПЦР в реальном времени использовали праймеры 5'-GTGGAACTGACAGCCGACATTG-3' и 5'‑GTGACGCTTGAGGGACTTGAA-3'. В качестве референсного гена (housekeeping) был использован ген recA, кодирующий белок, необходимый для гомологичной рекомбинации, с праймерами 5'-GGCGAGGGTGTTTCCAAGAC-3' и 5'-GACGCTGGCTGTTATAGGAGAAC-3' согласно исследованию (Rachwał et al., 2017). Для анализа относительного уровня экспрессии генов применяли 2–ΔΔCT метод (Livak, Schmittgen, 2001).

Анализ ризобиальных биопленок, формируемых на инертных поверхностях. Для получения био-пленок использовали среды YM и RDM (Vincent, 1970) с применением 24-луночных пластиковых планшетов (полистирол) (“Corning Inc.”, США). Для этого исходные и рекомбинантные штаммы R. leguminosarum выращивали 48 ч в жидкой среде на качалке при 28°С и 140 об./мин до концентрации 108–109 КОЕ/мл. Концентрация ризобий измерялась на спектрофотометре Benchmark Plus (“Biorad”, США). Затем культуру разводили свежей средой до 106 КОЕ/мл и переносили по 1 мл в лунки 24-луночного пластикового планшета. На данном этапе также добавляли ампициллин, индуктор m-толуиловую кислоту в случае трансформированных штаммов, а также хлорид кальция (Ca2+ 0–4.5 мМ) или додецилсульфат натрия (ДДС) (0.05%, об.) в экспериментах по влиянию Ca2+ и ДДС на относительное количество биомассы в биопленках. Планшеты герметизировали Parafilm (“Amcor”, США) и инкубировали при температуре 18–37°С и 50 об./мин в течение 7 сут. После культивирования из лунок удаляли среду с планктонными клетками. Биопленки промывали 1 М фосфатносолевым буфером (PBS, pH 6.5), окрашивали 5 мин 0.1% об. раствором генциан фиолетового (“Агат-Мед”, Россия) и осторожно промывали водой. Связавшийся с биомассой биопленок краситель растворяли в этаноле и измеряли оптическую плотность при длине волны 590 нм (O’Toole, Kolter, 1998). Оптическую плотность образцов измеряли с помощью прибора Enspire Model 2300 Multilabel Microplate Reader (“PerkinElmer”, США).

Исследование влияния бактерий на ростовые параметры растений. Семена растений в течение 1 мин стерилизовали в 70% спирте, а после – 20 мин в 5% растворе гипохлорита натрия. Далее семена были обработаны трехсуточными культурами ризобий, которые предварительно выращивали на качалках в жидкой среде RDM (перед инокуляцией плотность суспензии ризобий была измерена на спектрофотометре и доведена до 105 КОЕ/мл). Затем инокулированные семена раскладывали на влажную фильтровальную бумагу в чашки Петри. Часть семян оставили неинокулированными в качестве контроля. Неделю инкубировали при комнатной температуре и проводили расчет проросших и не проросших семян.

Для определения ростостимулирующего эффекта ризобактерий на корневую систему проростков измеряли длину корня опытных проростков и сравнивали с длиной контрольных проростков.

Исследование ростовых параметров и биомассы растений. Стерильные семена выращивали в течение 2 нед. в предварительно прокаленном вермикулите в условиях светоплощадки (освещение 5000 Лк, световой день 16 ч). После этого отмытые от вермикулита корни растений обрабатывали штаммами бактерий, которые выращивали до плотности OD660 0.75 при 28°C на среде RDM. Проростки высаживали в торфяной грунт (“Terra Vita”, Россия), прогретый в течение 1 ч при 70°C, и культивировали в теплице. Ростовые параметры и биомассу определяли после роста растений в течение 1 мес. Для анализа использовали по 50 проростков.

Микроскопирование корней растений и обработка корней протеазами. Стерильные семена проращивали в течение 1 нед. на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри. Далее проростки выдерживали при покачивании (25 об./мин) в суспензии ризобий (105 КОЕ/мл) в 50 мМ PBS (рН 7.2). Для приготовления суспензий использовали двухсуточные культуры бактерий, выращенные в жидкой среде RDM и отмытые от PBS. Через 3 ч проростки промывали стерильным PBS и помещали в пробирки, содержащие 10 мл жидкой среды MS (Murashige, Skoog, 1962). Растения выращивали в стерильных условиях 3 сут при 25°С и естественном освещении. Затем проростки однократно отмывали стерильным PBS (5 мин при покачивании 25 об./мин) и корни нарезали на фрагменты длиной 10–15 мм для микроскопирования или обработки протеазами.

Пепсин (“Sigma-Aldrich”, США) растворяли в 10 мМ HCl до концентрации 10 мг/мл. Для эксперимента фермент разводили 1 : 1 дистиллированной водой, проводили через бактофильтр и выдерживали в этом растворе корни растений в течение 2 ч при 37°С. Для оценки количества адгезированных на корнях растений бактерий, фрагменты корней, предварительно взвесив, трижды отмывали стерильной водой по 5 мин на микрошейкере и гомогенизировали в 50 мкл среды RDM. Полученный объем разбавляли в 1000 раз и 50 мкл этой суспензии рассевали на агаризованную RDM среду с ампициллином (100 мг/л) или без антибиотиков и выращивали в термостате при 28°С в течение 2 сут. Количество адгезированных бактерий определяли по числу выросших колоний.

Визуальное наблюдение меченых бактерий на корнях растений проводили на флуоресцентном микроскопе AxioImagerM1 (“CarlZeiss”, Германия).

Статистическая обработка результатов. На всех этапах исследования проводили не менее пяти независимых экспериментов как минимум в пяти повторностях. Результаты обрабатывали с использованием пакета Microsoft Office Excel 2010, доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение трансформированных штаммов бактерий и ПЦР в реальном времени. Для контрольных и рекомбинантных по гену rosR штаммов был исследован уровень экспрессии гена rosR в условиях индукции Pm промотора и без индуктора методом ПЦР в реальном времени. Было показано, что относительное содержание мРНК гена rosR превышает таковое в контрольных штаммах более чем в 5–7 раз даже в отсутствии индуктора (рис. 2а). Этот факт может объясняться в данном случае присутствием, так называемого эффекта “протекания”, т.е. неполным блокированием операторной области Pm промотора, в результате чего РНК-полимераза постоянно транскрибирует ген rosR, находящийся под контролем Pm промотора.

Рис. 2.

(а) – Количественный ПЦР анализ уровня транскрипции гена rosR. По оси Y – условные единицы, обозначающие уровень транскрипции гена rosR в рекомбинантных штаммах относительно дикого штамма. (б, в) – Относительная биомасса биопленок исходных и трансформированных штаммов бактерий после 7 сут культивирования. По оси Y – оптическая плотность кристаллического фиолетового, десорбированного после окрашивания биопленок, образованных на пластиковых планшетах; (б) – среда YM; (в) – среда RDM. (г, д) – Скорость роста штаммов на разных питательных средах. По оси Y – 107 КОЕ/мл; (г) – среда YM; (д) – среда RDM. Обозначения штаммов R. leguminosarum (1–8): 1 – VSy3; 2 – VSy3 при воздействии индуктора; 3 — VSy3 (pJBGFProsR); 4 – VSy3 (pJBGFProsR) при воздействии индуктора; 5 – VSy12; 6 – VSy12 при воздействии индуктора; 7 – VSy12 (pJBGFProsR); 8 – VSy12 (pJBGFProsR) при воздействии индуктора.

Отсутствие реакции на использование индуктора, выраженной в виде повышения экспрессии гена, требует дальнейшего изучения и может частично объясняться тем, что белок RosR распознает и связывается с мотивом RosR-box на хромосоме и негативно регулирует транскрипцию собственного гена rosR у изучаемых штаммов бактерий (Janczarek, Skorupska, 2007; Rachwał et al., 2017).

Подбор оптимальных условий для оценки эффективности биопленкообразования на инертных поверхностях. Была изучена эффективность образования биопленок дикими штаммами ризобий R. leguminosarum VSy12 и VSy3 и штаммами, трансформированных плазмидой pJBGFProsR, на инертных поверностях: 24-луночных пластиковых планшетах и пластиковых чашках Петри на различных питательных средах. Для формирования биопленок использовались углеводные, безбелковые среды YM и RDM. Проведенные исследования показали, что как контрольные, так и трансформированные бактерии эффективно образовывали биопленки на инертных поверхностях в обеих средах. Однако относительное количество биомассы в биопленках диких и трансформированных штаммов ризобий при культивировании на среде RDM превышало соответствующие показатели на среде YM более чем в два раза (рис. 2б, 2в).

Ранее было показано, что ризобии эффективнее образуют биопленки при росте в бедной на питательные вещества среде RDM, а не в более богатых средах, таких как LB или TY (Fujishige et al., 2006). Для ризобий формирование биопленок является стратегией выживания в условиях ограниченного питания, поскольку подобная организация клеток обеспечивает ряд преимуществ, таких как, например, повышение концентрации необходимых для роста питательных веществ, которые могут поглощаться поверхностью биопленки (Wimpenny, Colasanti, 1997; Rinaudi et al., 2006).

В статье Janczarek et al. (2009) было обнаружено, что введение дополнительной копии гена rosR, клонированного в плазмиду pBBR1MCS-2 под управлением собственного промотора, значительно увеличивает скорость роста ризобий. В настоящей работе не было зафиксировано разницы в скорости роста между трансформированными и контрольными бактериями, что, возможно, объясняется особенностями использованных в экспериментах штаммов или конструкции pJB658GFP и требует дальнейшего изучения (рис. 2г, 2д).

Влияние содержания кальция в питательной среде и температуры на образование биопленок исходными и трансформированными штаммами бактерий. Проведенные исследования выявили, что эффективность образования биопленок напрямую зависит от концентрации кальция Ca2+ в культуральной среде. Было показано, что добавление в среду 4.5 мМ Ca2+ увеличивает относительное количество биомассы в биопленках на 80% в среде YM и на 65% в среде RDM (рис. 3а). В связи с этим в экспериментах с воздействием температурного режима была использована концентрация Ca2+ в среде 4.5 мМ. Проведенные исследования показали зависимость биопленкообразования штаммов R. leguminosarum VSy12 и VSy3 от температурных условий. Как контрольные, так и трансформированные бактерии эффективно образовывали биопленки при температуре 28°С. При культивировании в условиях более низкой температуры, способность штаммов формировать биопленки снижалась более чем в 2 раза. При повышении температуры до 38°С статистически значимых различий в эффективности формирования биопленок по сравнению со штаммами, выращенными при 28°С, найдено не было (рис. 3б).

Рис. 3.

Относительная биомасса биопленок исходных и трансформированных штаммов бактерий после 7 сут культивирования при 28°C в зависимости от: (а) – содержания Ca2+ (мМ) в среде; (б) – температуры (°С); (в) – ДДС (об. %). По оси Y – оптическая плотность кристаллического фиолетового, десорбированного после окрашивания биопленок, образованных на пластиковых планшетах. Обозначения штаммов R. leguminosarum (1–8) – как на рис. 2.

Рис. 3.

Окончание

Ранее было показано, что оптимальная концентрация Ca2+ для роста S. meliloti в RDM составляет 0.7 мМ (Flemming et al., 2000). Увеличение концентрации Ca2+ выше этого оптимума стимулировало биопленкообразование, незначительно ингибируя скорость размножения бактериальных клеток. Связано это с тем, что двухвалентные катионы, такие как Ca2+ и Mg2+, неспецифически связываются с отрицательно заряженными группами полисахаридных цепей ЭПС, тем самым обеспечивая большую стабильность образуемой биопленки (Flemming et al., 2000). Известно, что у бактерий Ca2+ принимает непосредственное участие не только в формировании внешнего липополисахаридного слоя и клеточной стенки, но и во многих процессах клеточного цикла и деления. Полученные в настоящей работе результаты объясняются тем, что снижение скорости размножения клеток могло способствовать образованию биопленок, как ответ на стресс, или, наоборот, изначальное присутствие высокого уровня Ca2+ могло стабилизировать ЭПС, способствуя формированию “зрелой” биопленки (Smith, 1995; Rinaudi et al., 2006).

Одним из критически важных абиотических факторов как для размножения ризобий, так и для формирования биопленок является температура. Для большинства ризобий оптимум роста находится между 28 и 31°С, и многие не растут при 37°С. Несмотря на то, что экстремальные температуры отрицательно влияют на рост и биопленкообразование, существуют работы, описывающие устойчивые к высоким температурам штаммы ризобий (Rinaudi et al., 2006). Изучение устойчивости ризобий к повышенным или пониженным температурам необходимо для подбора оптимальных микросимбионтов для растений, обитающих в зоне пустынь и тундр. Штаммы R. leguminosarum, использованные в настоящей работе, растут и эффективно образуют биопленки при 37°С, что в сочетании с их ростостимулирующим эффектом открывает дополнительные перспективы для применения этих микросимбионтов для производства биоудобрений.

Анализ эффективности использования генов, регулирующих биосинтез ЭПС, для изменения биопленкообразования ризобий. Проведенные исследования выявили, что трансформация штаммов R. leguminosarum VSy12 и VSy3 дополнительной копией гена rosR положительно влияет на эффективность образования биопленок. В экспериментах с трансформированными геном rosR штаммами относительное количество биомассы в биопленках увеличивалось в среднем в 1.4 раза по сравнению с контрольными штаммами (при 28°С и 4.5 мМ Ca2+ в среде). Полученные результаты также выявили, что использование индуктора Pm не влияет на этот показатель у трансформированных штаммов ризобий (рис. 2б, 2в, 3а–3в). Данный факт согласуется с результатами ПЦР в реальном времени, описанными выше (рис. 2а).

Ранее было показано, что дополнительные копии гена rosR увеличивают выработку ЭПС у R. leguminosarum bv. trifolii в 1.5–2 раза. Объясняется это тем, что RosR положительно регулирует экспрессию гена pssA, кодирующего ключевой фермент в синтезе ЭПС. При этом интересно, что увеличение копий гена pssA не несет столь же положительного эффекта на количество ЭПС, как дополнительные копии гена rosR (Bittinger et al., 1997; Janczarek, Skorupska, 2007; Janczarek et al., 2009).

Анализ устойчивости исследуемых штаммов к ДДС показал, что данный детергент практически не влияет на образование биопленок трансформированными штаммами, хотя в случае контрольных штаммов относительное количество биомассы в биопленках уменьшалось в среднем в 2 раза (рис. 3в). Ранее было показано, что мутации в гене rosR приводят к повышенной чувствительности штаммов к воздействию детергентов, гипер- и гипоосмотического стресса и бета-лактамных антибиотиков. Связано это, по всей видимости, с тем, что RosR регулирует синтез белков, участвующих в формировании клеточной мембраны. К таким белкам у R. leguminosarum, например, относятся RopA, RopA1 и RopB1. Экспрессия данных белков значительно снижается в мутантных по гену rosR штаммах (Janczarek et al., 2010).

Анализ уровня колонизации корней и образования биопленок, в том числе при воздействии протеаз. Штаммами R. leguminosarum VSy12 и VSy3, контрольными и трансформированными pJBGFPRosR, были обработаны растения клевера лугового. Было показано, что трансформация не оказывает существенного влияния на прорастание семян (рис. 4а), ростовые параметры (рис. 4б) и биомассу растений (рис. 4в) – разница с дикими типами штаммов не имела достоверных различий.

Рис. 4.

Влияние исходных и трансформированных штаммов ризобий на: (а )– всхожесть семян растений (по оси ординат число проросших семян из 100 шт.); (б) – рост корней растений (по оси ординат изменение длины корней в %); (в) – биомассу растений (по оси ординат изменение сухой биомассы растений в %). К – клевер, Т – томат, 0 – без обработки бактериями. Обозначения штаммов R. leguminosarum (1–8) – как на рис. 2.

Анализ уровня колонизации корней после 7 сут совместного культивирования показал незначительное увеличение “заякорившихся” на корнях бактерий в случае трансформированных штаммов по сравнению с контрольными штаммами (рис. 5а). При этом через 3–4 сут микроскопирование выявило образование на корнях клевера и томата бактериальных агломераций и микроколоний преимущественно для трансформированных штаммов (рис. 5б). Также было показано, что штамм VSy12 образует биопленки преимущественно на поверхности корней растений, в отличие от VSy3, сродство которого выше к корневым волоскам (рис. 5в). Эксперимент по обработке протеазами выявил повышение устойчивости клеточных агломераций в случае трансформированных штаммов по сравнению с контрольными штаммами в среднем на 30% (рис. 5г).

Рис. 5.

Анализ колонизации корней бактериями после инокуляции исходными и трансформированными штаммами: (а) – число бактерий, “заякорившихся” на корнях (по оси ординат изменение числа бактерий в %); (б) – агглютинация штаммов на поверхности корней растений через 4 дня совместного культивирования; (в) – образование биопленок на поверхности корней растений томата через 7 дней совместного культивирования; (г) – анализ количества бактерий на корнях растений после обработки пепсином (по оси ординат изменение числа бактерий в % от исходного количества до обработки ферментом). К – клевер, Т — томат. Обозначения штаммов R. leguminosarum (1–8) – как на рис. 2.

Способность ризобиальных клеток прикрепляться к поверхности корней растений-макросимбионтов является критическим фактором взаимодействий, и ЭПС ризобий вносят существенный вклад в бактериальную адгезию (Rinaudi, Gonzalez, 2009). Ранее было показано, что трансформация R. leguminosarum bv. trifolii дополнительными копиями гена rosR приводит к повышению конкурентоспособности рекомбинантных ризобий по сравнению с дикими штаммами, почти в два раза (Bittinger et al., 1997; Janczarek, Skorupska, 2007; Janczarek et al., 2009). Мутантные по гену rosR штаммы образовывали значительно меньше клубеньков на корнях клевера красного; в отличие от диких штаммов, для них были характерны различные дефекты в образовании и развитии инфекционных нитей и низкая колонизация поверхности корня (Janczarek et al., 2010). Кроме очевидного влияния на выработку ЭПС ризобиями, полученные данные указывают на активацию белком RosR экспрессии ряда генов, непосредственно связанных с симбиозом (Janczarek, Skorupska, 2011). Немаловажным является и тот факт, что ЭПС играет защитную роль на ранних и поздних стадиях симбиотических взаимодействий, когда ризобии подвергаются окислительному стрессу со стороны растений-хозяев (Santos et al., 2001; Janczarek et al., 2009).

Таким образом, в данной работе впервые была получена генно-инженерная конструкция для экспрессии дополнительных копий гена rosR под управлением промотора Pm и изучена способность к симбиозу, в том числе и к ассоциативному, у трансформированных полученной плазмидой штаммов ризобий. Было показано, что клубеньковые бактерии с дополнительными копиями гена rosR отличались более эффективным образованием биопленок и обладали значительно большей способностью прилипать к различным поверхностям, включая абиотические поверхности и корни макросимбионтов. Более того, было обнаружено, что повышенная экспрессия гена rosR и опосредованное им усиленное образование био-пленок может защитить эти бактерии от протеаз, детергентов, а также способствовать выживанию ризобий при низком содержании питательных веществ в окружающей среде. Вследствие этого, использование генов, участвующих в образовании ЭПС ризобиями, в качестве трансгенов имеет перспективы не только для создания эффективных биоудобрений для бобовых растений, но и для конструирования ассоциативных взаимодействий ризобий с небобовыми растениями, которые могут найти применение в сельском хозяйстве и биоремедиации.

Список литературы

  1. Баймиев Ан.Х., Ямиданов Р.С., Матниязов Р.Т., Благова Д.К., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro // Мол. биология. 2011. Т. 45. С. 984–991.

  2. Baymiev A.K., Yamidanov R.S., Matniyazov R.T., Blagova D.K., Chemeris A.V. Preparation of fluorescent labeled nodule bacteria strains of wild legumes for their detection in vivo and in vitro // Mol. Biol. (Moscow). 2011. V. 45. C. 904–910.

  3. Вершинина З.Р., Благова Д.К., Нигматуллина Л.Р., Лавина А.М., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Ассоциативный симбиоз трансгенных томатов с ризобиями повышает устойчивость растений к Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici // Биотехнология. 2015. Т. 31. № 3. С. 42–53.

  4. Вершинина З.Р., Хакимова Л.Р., Лавина А.М., Каримова Л.Р., Федяев В.В., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Взаимодействие томатов (Solanum lycopersicum L.), трансформированных rapAl, с бактериями Pseudomonas sp. 102, устойчивыми к высоким концентрациям кадмия, как основа эффективной симбиотической системы для фиторемедиации // Биотехнология. 2019. Т. 35. № 2. С. 38–48.

  5. Вершинина З.Р., Лавина А.M., Чубукова О.B. Экзополисахариды Rhizobium leguminosarum – краткий обзор // Биомика. 2020. Т. 12. С. 27–49.

  6. Bittinger M.A., Milner J.L., Saville B.J., Handelsman J. RosR, a determinant of nodulation competitiveness in Rhizobium etli // Mol. Plant-Microbe Interact. 1997. V. 10. P. 180–186.

  7. Blatny J.M., Brautaset T., Winther-Larsen H.C., Karunakaran P., Valla S. Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria // Plasmid. 1997. V. 38. P. 35–51.

  8. Chou A.Y., Archdeacon J., Kado C.I. Agrobacterium transcriptional regulator Ros is a prokaryotic zinc finger protein that regulates the plant oncogene ipt // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 5293–5298.

  9. D’Souza-Ault M.R., Cooley M.B., Kado C.I. Analysis of the Ros repressor of Agrobacterium virC and virD operons: molecular intercommunication between plasmid and chromosomal genes // J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 3486–3490.

  10. Flemming H.C., Wingender J., Griegbe T., Mayer C. Physico-chemical properties of biofilms // Biofilms: Recent Advances in Their Study and Control / Ed. Evans L.V. Amsterdam: Harwood Academic Publishers, 2000. P. 19–34.

  11. Fujishige N.A., Kapadia N.N., DeHoff P.L., Hirsch A.M. Investigations of Rhizobium biofilm formation // FEMS Microbiol. Ecol. 2006. V. 56. P. 195–206.

  12. González V., Santamaría R.I., Bustos P., Hernández-Gonzalez I., Medrano-Soto A., Moreno-Hagelsieb G., Chandra Janga S., Ramírez M.A., Jiménez-Jacinto V., Collado-Vides J., Dávila G. The partitioned Rhizobium etli genome: genetic and metabolic redundancy in seven interacting replicons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 3834–3839.

  13. Janczarek M., Krol J., Skorupska A. The pssB gene product of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii is homologous to a family of inositol monophosphatases // FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 173. P. 319–325.

  14. Janczarek M., Skorupska A. The Rhizobium leguminosarum bv. trifolii RosR: transcriptional regulator involved in exopolysaccharide production // Mol. Plant-Microbe Interact. 2007. V. 20. P. 867–881.

  15. Janczarek M., Jaroszuk-Ściseł J., Skorupska A. Multiple copies of rosR and pssA genes enhance exopolysaccharide production, symbiotic competitiveness and clover nodulation in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii // Antonie van Leeuwenhoek. 2009. V. 96. P. 471–486.

  16. Janczarek M., Kutkowska J., Piersiak T., Skorupska A. Rhizobium leguminosarum bv. trifolii rosR is required for interaction with clover, biofilm formation and adaptation to the environment // BMC Microbiol. 2010. V. 10. P. 284.

  17. Janczarek M., Skorupska A. Modulation of rosR expression and exopolysaccharide production in Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii by phosphate and clover root exudates // Int. J. Mol. Sci. 2011. V. 12. P. 4132–4155.

  18. Jaszek M., Janczarek M., Kuczyński K., Piersiak T., Grzywnowicz K. The response of the Rhizobium leguminosarum bv. trifolii wild-type and exopolysaccharide-deficient mutants to oxidative stress // Plant and Soil. 2014. V. 376. P. 75–94.

  19. Keller M., Roxlau A., Weng W.M., Schmidt M., Quandt J., Niehaus K., Jording D., Arnold W., Pühler A. Molecular analysis of the Rhizobium meliloti mucR gene regulating the biosynthesis of the exopolysaccharides succinoglycan and galactoglucan // Mol. Plant-Microbe Interact. 1995. V. 8. P. 267–277.

  20. Kopycińska M., Lipa P., Cieś la J., Kozieł M., Janczarek M. Extracellular polysaccharide protects Rhizobium leguminosarum cells against zinc stress in vitro and during symbiosis with clover // Environ. Microbiol. Rep. 2018. V. 10. P. 355–368.

  21. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCT method // Methods. 2001. V. 25. P. 402–408.

  22. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473–497.

  23. O’Toole G.A., Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis // Mol. Microbiol. 1998. V. 28. P. 449–461.

  24. Rachwał K., Matczyńska E., Janczarek M. Transcriptome profiling of a Rhizobium leguminosarum bv. trifolii rosR mutant reveals the role of the transcriptional regulator RosR in motility, synthesis of cell-surface components, and other cellular processes // BMC Genomics. 2015. V. 16. Art. 1111. https://doi.org/10.1186/s12864-015-2332-4

  25. Rachwał K., Boguszewska A., Kopcińska J., Karaś M., Tchórzewski M., Janczarek M. The regulatory protein RosR affects Rhizobium leguminosarum bv. trifolii protein profiles, cell surface properties, and symbiosis with clover // Front. Microbiol. 2016. V. 7. Art. 1302. P. 1–21.

  26. Rachwał K., Lipa P., Wojda I., Vinardell J.M., Janczarek M. Regulatory elements located in the upstream region of the Rhizobium leguminosarum rosR global regulator are essential for its transcription and mRNA stability // Genes. 2017. V. 8. Art. 388.

  27. Reeve W.G., Dilworth M.J., Tiwari R.P., Glenn A.R. Regulation of exopolysaccharide production in Rhizobium leguminosarum biovar viciae WSM710 involves exoR // Microbiology (SGM). 1996. V. 143. P 1951–1958.

  28. Rinaudi L., Fujishige N.A., Hirsch A.M., Banchio E., Zorreguieta A., Giordano W. Effects of nutritional and environmental conditions on Sinorhizobium meliloti biofilm formation // Res. Microbiol. 2006. V. 157. P. 867–875.

  29. Rinaudi L.V., Gonzalez J.E. The low-molecular-weight fraction of exopolysaccharide II from Sinorhizobium meliloti is a crucial determinant of biofilm formation // J. Bacteriol. 2009. V. 191. P. 7216–7224.

  30. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. 1626 p.

  31. Santos R., Herouart D., Sigaud S., Touati D., Puppo A. Oxidative burst in alfalfa-Sinorhizobium meliloti symbiotic interaction // Mol. Plant-Microbe Interact. 2001. V. 14. P. 86–89.

  32. Smith R.J. Calcium and bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1995. V. 37. P. 83–133.

  33. Vincent J.M. A manual for practical study of root nodule bacteria. IBP Handbook No. 15. Oxford: Blackwell Scientific Publishers, 1970. 164 p.

  34. Wimpenny J.W.T., Colasanti R.A. A unifying hypothesis for the structure of microbial films based on cellular automation models // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. V. 22. P. 1–16.

Дополнительные материалы отсутствуют.