Микробиология, 2021, T. 90, № 3, стр. 304-314

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор образцов. Пробы донных осадков были отобраны в ходе 73-го рейса НИС “Академик Мстислав Келдыш” в октябре 2018 г. в море Лаптевых. Для данной работы взяты поверхностные осадки на 6 станциях из 3 различных районов (рис. 1). Две станции (АМК6005 и АМК6009) располагались в районе влияния дельты р. Лены. Три станции находились в районе краевого шельфа. Из них две располагались в районе метановых сипов (АМК6027 и АМК6045), а одна (АМК6053) являлась фоновой, не подверженной прямому влиянию сипов. Еще одна станция (АМК6068) отобрана в верхней части континентального склона. Координаты отбора и описание исследованных осадков приведены в табл. 1.

Рис. 1.

Карта-схема расположения исследованных станций, распределение интегральных величин (рассчитанных под 1 м² для верхних 10 см осадка) (1) концентрации метана (СН₄, мкмоль/дм³) и (2) интенсивности микробного окисления метана (МО, мкмоль/дм³ сут) в море Лаптевых.

В работе использован комплекс радиоизотопных, газо-геохимических, микробиологических и молекулярно-биологических методов. Немедленно после подъема на борт судна коробчатого дночерпателя типа “Box-corer” вставляли в осадок пластиковую трубку диаметром 15 см и отбирали осадочный керн. Затем в судовой лаборатории послойно отбирали образцы донных осадков для измерения содержания и скорости окисления метана, проведения молекулярно-биологического анализа и посевов на селективную минеральную среду для метанотрофов.

Концентрацию метана в придонной воде и донных отложениях измеряли на газовом хроматографе Кристалл-2000-М (ЗАО СКБ “Хроматэк”, Россия) с пламенно-ионизационным детектором методом фазово-равновесной дегазации (Egorov, Ivanov, 1998). Погрешность измерения не превышала 5%.

Измерение скорости окисления метана радиоизотопным методом. Скорость окисления метана (МО) определяли радиоизотопным методом с ¹⁴С-метаном, растворенным в дегазированной дистиллированной воде. Из каждого горизонта ненарушенные осадки в количестве 2.5 см³ отбирали пластиковыми шприцами (общий объем 5 см³) с резиновым поршнем и обрезанным краем, герметично закрывали пробкой из бутиловой резины. 0.2 мл меченого ¹⁴С-метана (1 мкКи на пробу) вносили туберкулиновым шприцем, прокалывая резиновую пробку иглой по центру и равномерно распределяя субстрат по длине шприца с осадком. Контролем служили пробы, фиксированные 1 мл 0.5 н раствора КОН и выдержанные в холодильнике 6 ч до внесения меченого субстрата. После внесения меченого метана образцы донных осадков инкубировали в течение 2 сут при температуре, близкой к температуре in situ. После инкубации пробы фиксировали и транспортировали в стационарную лабораторию для дальнейшего определения продуктов микробного окисления и трансформации С-метана: в углекислоту (СО₂), в биомассу микроорганизмов (БМ) и в растворенный органический углерод (РОУ) в составе растворенного органического вещества (РОВ). Обработку проб и расчеты интенсивности метанокисления проводили по ранее описанной методике (Русанов и соавт., 1998; Ivanov et al., 2002). Радиоактивность (¹⁴С) продуктов микробного процесса МО измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике PackardTRI-CarbTR 2400 (США). Для расчетов численных показателей интенсивности образования продуктов микробного окисления и трансформации углерода метана использовали среднюю величину, полученную из двух повторностей измерений для каждого образца.

Определение состава микробных сообществ методом высокопроизводительного секвенирования гена 16S рРНК. Суммарная ДНК была выделена из 3 г осадка с помощью DNeasy PowerMax Soil Kit (“Qiagen”, Carlsbad, CA, США). ПЦР фрагменты гена 16S рРНК были получены с использованием универсальных праймеров 341F (5'-CCTAYGGGDBGCWSCAG-3') и 806R (5'-GGACTACNVGGGTHTCTAAT-3') (Frey et al., 2016). ПЦР фрагменты были баркодированы с помощью Nextera XT Index Kit v.2 (“Illumina”, США) и очищены с использованием Agencourt AMPure beads (“Beckman Coulter”, Brea, CA, США). Концентрация полученных ПЦР продуктов была подсчитана с помощью Qubit dsDNA HS Assay Kit (“Invitrogen”, Carlsbad, CA, США). Затем все ПЦР фрагменты были смешаны в равных количествах и секвенированы на Illumina MiSeq (2 × 300 нт с обоих концов). Парные чтения были объединены с использованием FLASH v.1.2.11 (Magoc, Salzberg, 2011). Полученные последовательности были кластеризованы в операционные таксономические единицы (ОТЕ) при 97% идентичности с помощью программы Usearch (Edgar, 2010); низкокачественные чтения, химерные и единичные последовательности были удалены при кластеризации с использованием алгоритма Usearch. Таксономическая идентификация была выполнена по базе SILVA v.132 с использованием алгоритма VSEARCH (Rognes et al., 2016). Полученные последовательности были депонированы в GenBank NCBI в рамках проекта PRJNA679168.

Получение и анализ накопительных культур. Для получения накопительных культур метанотрофных бактерий использовали минеральную среду следующего состава: (г/л): КNO₃ – 0.25; NH₄Cl – 0.25; MgSO₄ · 7H₂O – 0.4; СaCl₂ – 0.1; NaCl – 20.0; КCl – 1.5; Na₂HPO₄ – 0.358; KH₂PO₄ – 0.13. Микроэлементы 1 мл/л состава: (мг/100 мл): нитрилтриуксусная кислота (НТА) – 150; MnSO₄ ⋅ ⋅ 2H₂O – 50; FeSO₄ ⋅ 7H₂O – 10; CoCl₂ – 10; ZnSO₄ – 10; CuSO₄ ⋅ 5H₂O – 1; AlK(SO₄)₂ – 1; H₃BO₃ – 1; Na₂MoO₄ ⋅ 2H₂O – 1; рН готовой среды составлял 6.8–7.2.

Во флаконы объемом 120 мл помещали 10 мл среды, 0.5 г образца осадка, герметично закрывали резиновой пробкой. В газовую фазу шприцем добавляли 30% метана. Инкубировали статично при 15°С в течение 1 мес.

После инкубации отбирали аликвоты накопительных культур объемом 2 мл. Выделение тотальной ДНК и секвенирование фрагментов гена 16S рРНК проводили аналогично описанной выше методике.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика районов исследования и микробного окисления метана. На рис. 1 представлено расположение станций отбора образцов. Две станции располагались в авандельте р. Лены (ст. АМК73-6005 и АМК73-6009), две станции в районе метановых сипов (АМК73-6027 и АМК73-6045) и две станции были условно фоновыми, не подверженными прямому влиянию выноса реки или метановых сипов – в районе краевого шельфа (АМК73-6053) и верхнего склона (АМК73-6068). На каждой станции было исследовано 3–4 горизонта осадка от поверхности до глубины 8–10 см. Глубины станций отбора, а также некоторые характеристики исследованных осадков представлены в табл. 1. Верхние 2–4 см всех осадков были представлены окисленными алеврито-песчанистыми или алеврито-пелитовыми илами. Глубже осадки приобретали сероватый оттенок, характерный для слабо окисленных или слабо восстановленных илов.

Содержание метана в верхних горизонтах большинства исследованных станций характеризовалось достаточно высокими величинами и варьировало в интервале 1–2 мкмоль дм^–3. Исключение составляют осадки станции АМК73-6045, расположенной в зоне сипа. Концентрация метана на этой станции уже в верхнем горизонте осадка составляла 2.6 мкмоль дм^–3, а к 10 см практически линейно увеличилась на порядок до 20.3 мкмоль дм^–3 (рис. 1 и 2, табл. 2).

Рис. 2.

Профили распределения величин концентрации метана (мкмоль/дм³) и интенсивности микробного окисления метана (мкмоль/дм³ сут) в верхних горизонтах исследованных станций в море Лаптевых: а, б – авандельта р. Лены (ст. АМК73-6005 и АМК73-6009); в, г – станции над сипами (АМК73-6027 и АМК73-6045); д, е – станция верхнего склона (АМК73-6068) и фоновая станция на шельфе (АМК73-6053).

Послойное распределение концентрации метана по горизонтам, в верхнем 10 см слое, также различалось для осадков из разных районов отбора. На станциях авандельты (АМК73-6005 и АМК73-6009) и на станции (АМК73-6068) верхней части склона после поверхностного относительного максимума следовал подповерхностный минимум (рис. 2). Затем с глубиной концентрация метана плавно нарастала. Это может объясняться схожестью в скоростях осадконакопления, наличием лабильного органического вещества на поверхности и интенсивностью микробиологических процессов. В осадках краевого шельфа, как в районе сипов (ст. АМК73-6027 и АМК73-6045), так и на фоновой станции АМК73-6053, слабо подверженной влиянию сипов, наблюдался другой профиль в распределении метана. Начиная от поверхности, концентрация метана практически линейно, плавно или резко, нарастала с глубиной осадка. Максимальное увеличение детектировано на “сиповой” станции АМК73-6045 (рис. 2).

Наибольшие величины скорости МО выявлены в поверхностных окисленных горизонтах 0–1 и 1–3 см осадочной толщи (рис. 2). Ниже окисленной зоны активность метанотрофов резко снижалась на всех исследованных станциях. Максимальные значения величин МО зафиксированы на сиповой станции АМК73-6045, где от поверхностных горизонтов к глубине 1–3 см скорость процесса возрастала в 2 раза от 0.56 до 1.16 мкмоль СН₄ л^–1 сут^–1, а затем на глубине 3–7 см резко уменьшалась до 0.4 мкмоль СН₄ л^–1 сут^–1 (рис. 2).

Профиль распределения продуктов микробного окисления и трансформации углерода метана (до ${\text{НСО}}_{{\text{3}}}^{ - }$, БМ и РОУ) на большинстве станций различался между собой. При этом во всех исследованных осадках наблюдалась общая закономерность. Основным продуктом микробной утилизации метана для всех исследованных образцов являлся ${\text{НСО}}_{{\text{3}}}^{ - }$ (до 68%), в экзометаболиты (РОУ) переходит 30–60% углерода метана, а в биомассу включается до 2%. Исключение составляет осадок с глубины 10 см станции АМК73-6068, где до СО₂ окисляется лишь 17% метана.

Характеристики накопительных культур. Первичные накопительные культуры содержали большоеколичество минеральных частиц из образца осадка, поэтому визуально оценить рост метанокисляющих микроорганизмов было практически невозможно. Последующие пересевы на минеральную среду с метаном в качестве источника углерода показали стабильный рост для культур, полученных из образцов осадков со станций АМК73-6005 и АМК73-6009. Равномерный рост характерен для культуры 11L и хлопьевидный рост для культур 13L, 14L и 16L. В фазах экспоненциального и линейного роста преобладали одиночные клетки или диплоформы, в фазе замедленного роста и стационарной фазе за счет выделяемой метанотрофами слизи образовывались скопления, которые выглядели как хлопья.

Идентификация метанотрофов в нативных осадках и накопительных культурах. В результате секвенирования фрагментов генов 16S рРНК для нативных образцов и первичных накопительных культур было получено 4 202 726 и 187 820 последовательностей соответственно. Дальнейшая их кластеризация и анализ по базе SILVA выявили метанотрофных бактерий, относящихся к порядку Methylococcales класса Gammaproteobacteria (рис. 3).

Рис. 3.

Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа частичных последовательностей гена 16S рРНК и отображающее положение выявленных в ходе данного исследования ОТЕ.

Таксономическое разнообразие метанотрофов в нативных образцах оказалось невелико, были выявлены представители Methylococcaceae, отнесенные только к 4 ОТЕ (табл. 3). Их доля составляла от 0.01 до 1.93% от общего числа последовательностей всех микроорганизмов. На филогенетическом дереве последовательности формировали отдельный кластер вместе с родом Methyloprofundus (рис. 3).

В результате секвенирования и филогенетического анализа первичных накопительных культур после инкубирования в среде с метаном были выявлены метанокисляющие бактерии, отличные от организмов в нативных осадках (рис. 3).

Для накопительных культур 11L (культура получена из образца со станции АМК73-6005, 0–1 см), 13L (АМК73-6005, 7–8 см), 14L (АМК73-6009, 0–1 см) и 16L (АМК73-6009, 4–5 см) было получено дополнительно 5 ОТЕ, относящихся к метанотрофам (табл. 4).

В накопительных культурах обнаружены метанотрофы родов Methylomonas (0.01–18.78% от общего числа прочтений) и Methylobacter (9.64–61.88% от общего числа последовательностей). Представители рода Methyloprofundus выявлены не были (в отличие от данных секвенирования для нативных образцов).

ОБСУЖДЕНИЕ

Микробные сообщества осадков Арктических морей активно изучаются с применением методов молекулярной биологии (Koch et al., 2009; Kirchman et al., 2010; Z-eng et al., 2013; Lin et al., 2017). При анализе результатов секвенирования гена 16S рРНК основное внимание, как правило, уделяется крупным таксонам на уровне семейств и выше (Bienhold et al., 2012; Yergeau et al., 2017; Savvichev et al., 2018). Детекция метанотрофов методом секвенирования гена 16S рРНК в сложных микробных сообществах затруднена ввиду того, что эти физиологические группы не являются монофилетичными, и их доля в сообществе обычно невелика (Bapteste, 2005; Knittel, 2009).

Микробиологические исследования метановых сипов в Арктических морях вызывают особый интерес, поскольку в районах газовых высачиваний формируются уникальные бентосные сообщества, основу трофической цепи которых составляют метанотрофные бактерии и археи (Pimenov et al., 1999; Pimenov et al., 2000; Lӧsekann et al., 2007; Savvichev et al., 2018).

Для сравнения на каждой станции нами были рассчитаны интегральные величины для верхнего 10-сантиметрового слоя с площадью 1 м². Распределение интегральных величин концентрации метана и интенсивности его микробного окисления были сходными на станциях авандельты р. Лены (ст. АМК73-6005 и АМК73-6009), фоновой станции краевого шельфа (АМК73-6053) и станции верхнего склона (АМК73-6068). На “сиповой” станции АМК73-6027 эти величины были несколько выше, а на ст. АМК73-6045 многократно превосходили значения, полученные на других станциях (рис. 1).

Присутствие метанотрофных бактерий было показано на всех исследованных станциях в результате секвенирования последовательностей гена 16S рРНК. Их доля в сообществе резко возрастала в осадках, отобранных в районах метановых сипов (станции АМК73-6027 и АМК73-6045), что обусловлено высоким содержанием метана глубинного происхождения. Данные о процентном соотношении метанотрофов в сообществах согласуются с высокими скоростями микробного метанокисления в этих районах.

Наибольшая доля метанотрофов и интенсивности окисления метана выявлены на сиповой станции АМК73-6045. Осадки этой станции характеризуются резким увеличением количества метана с увеличением глубины осадочной толщи. В условиях разгрузки глубинного метана здесь формируется микробное сообщество, в котором метанотрофы составляют до 1%, что является весьма высоким показателем для этой группы организмов в зонах газопроявления.

Заметному влиянию метановых сипов подвержено микробное сообщество станции АМК73-6027, расположенной на расстоянии 30 миль от станции АМК73-6045. Здесь содержание метана и интегральные интенсивности процесса МО в поверхностных осадках были почти в 2 раза ниже. Однако метанотрофы составляли на этой станции также значительную величину (до 1.94% от всех бактерий), что может быть обусловлено как разгрузкой глубинного метана, так и распространением метана в составе придонных течений на значительные расстояния от площадок активных газовыделений (Shakhova et al., 2010, 2014, 2015). С увеличением расстояния уменьшается влияние сипов: для станций АМК73-6053 и АМК73-6068 зафиксированы невысокие скорости процесса МО и низкая доля метанокисляющих бактерий в микробном сообществе, что согласуется с низким содержанием метана в поверхностных осадках этих станций.

В образцах нативных осадков для всех станций были обнаружены последовательности генов 16S рРНК, принадлежащие метанокисляющим организмам (рис. 3), входящим в кластер “Deep-Sea” 1 (Luke, Frenzel, 2011). Обнаруженные метанотрофы являются филогенетически близкими и характерны для морских экосистем, в том числе для районов, где наблюдаются разгрузки метановых сипов (Bessette et al., 2017; Тихонова и соавт., 2020). Единственным культивируемым организмом в кластере “Deep-Sea” 1 на данный момент является Methyloprofundus sedimenti WF1 (Tavormina et al., 2014), который детектируется во многих морских экосистемах. Этот организм микроаэрофилен, способен расти при низких температурах и высоких значениях солености. Кроме того, показана его способность к образованию эндосимбиотических связей с морскими моллюсками.

Большее таксономическое разнообразие аэробных метанокисляющих бактерий было выявлено методом культивирования для станций АМК73-6005 и АМК73-6009. Здесь количество метана не возрастает с увеличением глубины осадка, процессы его микробного окисления не превышают 0.22 мкмоль СН₄ л^–1 сут^–3. Метан-окисляющие бактерии в составе сообщества не превышали 0.02%, однако их разнообразие оказалось выше, чем в глубоководных станциях. Помимо найденных в нативных образцах представителей кластера “Deep-Sea” 1, характерных для глубоководных морских экосистем, в накопительных культурах были обнаружены организмы, близкие к метанотрофам, населяющим пресноводные экосистемы. В накопительных культурах, полученных из образцов осадков, отобранных на станциях АМК73-6005 и АМК73-6009, обнаружены представители родов Methylomonas и Methylobacter. Их количество в нативных образцах было ниже уровня детекции молекулярно-биологическими методами. Обнаружение этих организмов стало возможным лишь в результате анализа первичных накопительных культур. Вероятно, пресноводные микроорганизмы попадают в осадочную толщу на частицах речной взвеси и сохраняют жизнеспособность в условиях значительного распреснения районов, подверженных влиянию речного стока. Однако низкое содержание метана в поверхностных осадках этих станций не позволяет метанотрофным микроорганизмам активно развиваться и составлять значительную долю в структуре микробного сообщества.

Неожиданным оказалось отсутствие достоверного роста в накопительных культурах из образцов осадков станций АМК73-6027, АМК73-6045, АМК73-6053, АМК73-6068, где наблюдались высокое содержание метана, скорости его микробного окисления, а также в нативных образцах выявлено присутствие метанотрофов. По-видимому, нам не удалось подобрать условия для получения активных накопительных культур этих микроорганизмов. Известно, что представители рода Methyloprofundus и близкие к ним организмы, являются трудно культивируемыми и для получения накопительных культур этих метанотрофов требуется не менее 12 месяцев (Tavormina et al., 2014).

Результаты наших исследований позволяют заключить, что метанотрофные бактерии кластера “Deep-Sea” 1, филогенетически близкие к единственному культивируемому представителю организму Methyloprofundus sedimenti, доминируют в составе сообщества метанотрофов в поверхностных осадках районов газопроявления в море Лаптевых.