Микробиология, 2021, T. 90, № 5, стр. 613-617

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения исследований противобактериальной активности магниевых сплавов был разработан метод лазерной обработки листов и пластин сплава МА8, приводящий к формированию на поверхности многомодальной шероховатости и значительному увеличению эффективной площади поверхности. Метод основан на растровом сканировании поверхности материала лазерным пучком наносекундной длительности и длиной волны 1.064 мкм. Для обработки образцов использовали лазерную установку “Аргент-М” (Россия) мощностью 20 Вт с иттербиевым волоконным лазером, имеющим диаметр пятна контакта с поверхностью 40 мкм, и блоком управления перемещением лазерного луча RAYLASE MS10 2 (Германия). В результате предварительных экспериментов был выбран режим лазерной обработки поверхности с частотой импульсов 20 кГц, длительностью импульсов 200 нс, плотностью растрового сканирования 50 линий/мм и скоростью движения лазерного пучка 200 мм/с.

Описанный режим лазерной обработки приводил к формированию высокопористой супергидрофильной поверхности, в которую капиллярное впитывание капли исследуемой бактериальной суспензии происходило полностью в течение нескольких секунд. Для сравнения антибактериальной активности поверхностей исходного магниевого сплава (обозначенного в наших экспериментах как контроль) и супергидрофильного покрытия использовали пластины размером 10 × 10 × 1 мм.

В данной работе исследовали бактерицидную активность магниевых пластин по отношению к суспензии, содержащей клетки E. coli K12 C600 (В-7158; ГКПМ-Оболенск). Для приготовления бактериальной суспензии суточную бактериальную культуру E. coli вносили в мясопептонный бульон (МПБ; “Медгамал”) и инкубировали при 37°C в течение 18 ч. Для экспериментов использовали суспензии бактериальных клеток с исходным титром 5 × 10⁷ КОЕ/мл.

Необходимое в соответствии с экспериментальным протоколом количество контрольных и супергидрофильных пластинок помещали в стерильные бюксы с предварительно созданными влажными условиями. Увлажнение обеспечивали размещением вдоль боковых стенок бюкса фильтровальной бумаги, смоченной физиологическим раствором. Поддержание насыщения водными парами препятствовало испарению воды из суспензии и поддерживало режим “влажного” контакта суспензия–подложка. Бактериальную загрязненность пластинки измеряли через определенное время (15 и 30 мин, 1, 2, 4, 6, 8 и 24 ч). Для количественной оценки бактерицидного действия после фиксированного времени контакта пластины с каплей суспензии, пластину помещали в пробирку с 1 мл стерильного физиологического раствора и встряхивали на шейкере при 250 об./мин в течение 10 мин. Из полученной бактериальной суспензии готовили 10-кратные разведения и по 0.1 мл из каждого разведения равномерно распределяли в чашках Петри по поверхности агара Мюллера–Хинтона (“HiMedia Laboratories Pvt. Limited”), и после 24 ч инкубации в термостате при 37°C определяли титр бактерий. Для каждого временного интервала использовали отдельные пластины, и каждый эксперимент повторяли не менее двух раз.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 8.0. Различия считали статистически значимыми при доверительной вероятности >0.95, что соответствует требованиям, предъявляемым к медико-биологическим исследованиям.

Морфологию бактериальных клеток, контактировавших с супергидрофильной поверхностью магниевого сплава, и текстуру самих супергидрофильных пластин исследовали во вторичных электронах с применением растрового электронного микроскопа, входящего в комплекс Helios Nanolab 600 (“FEI”, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфология супергидрофильного покрытия на магниевом сплаве, бактерицидные свойства которого исследовали в данной работе, представлена на рис. 1а.

Рис. 1.

Электронно-микроскопическое изображение супергидрофильного покрытия на магниевом сплаве (а) и клетки E. coli (б, указана стрелкой), подвергшейся бактериолизу вследствие нарушения целостности наружной мембраны при ее перфорировании наночастицами при контакте с поверхностью покрытия.

Полученная после лазерной обработки поверхность характеризуется многомодальной шероховатостью, формируемой наночастицами и их микроагрегатами. Согласно закону Дерягина–Венцеля, такая шероховатость, в комбинации с гидрофильностью исходного магниевого сплава, обеспечивает супергидрофильное состояние поверхности.

При контакте капли бактериальной суспензии с такой поверхностью, как уже упоминалось выше, происходит капиллярная пропитка текстуры бактериальной суспензией. При этом, благодаря 100% влажности в бюксе, жидкость сохранялась в порах в течение всего эксперимента, и бактериальные клетки в исследуемой системе находились как в планктонной форме, так и в виде клеток, осажденных на поверхность стенок текстуры. На контрольной пластине сплава магния суспензия сохраняла форму капли, практически не меняющейся за время наблюдения.

На гистограмме (рис. 2) представлено изменение во времени титра жизнеспособных клеток E. coli в суспензиях, контактировавших с супергидрофильной и контрольной пластинами; пунктирной линией показан титр исходной суспензии. Полученные данные показывают, что даже кратковременный контакт бактериальных клеток с поверхностью магниевого сплава и процедуры изолирования клеток от подложки вызывают значительное снижение титра, по отношению к титру суспензии, исходно помещаемой на подложку. Однако при более длительном контакте бактерицидное действие супергидрофильной магниевой пластины проявляется значительно быстрее, чем контрольной. Так, уже через 4 ч титр бактерий был порядка 10² КОЕ/мл, что на 5 порядков ниже исходного и, по существу, может рассматриваться, как безопасная концентрация. После 24 ч контакта с бактериальной суспензией супергидрофильная пластина была полностью деконтаминирована. Жизнеспособность бактериальных клеток, контактировавших с контрольной пластиной, была значительно выше, и даже после 8 ч контакта бактериальный титр оставался на уровне 10⁴ КОЕ/мл. После 24 ч концентрация жизнеспособных клеток оставалась на уровне 10² КОЕ/мл, что указывает на значимые бактерицидные свойства даже исходной пластины сплава МА8.

Рис. 2.

Изменение титра бактериальных клеток E. coli при различных временах контакта капли бактериальной суспензии с супергидрофильной (1) и контрольной (2) магниевой пластинами. Вертикальные отрезки показывают стандартное отклонение экспериментальных данных, пунктирной линией показан титр исходной суспензии.

Остановимся теперь на механизмах бактерицидной активности магниевого сплава, как для гладкой пластины, так и для супергидрофильной пластины, многомодальная поверхность которой обеспечивает значительное увеличение эффективной площади поверхности по отношению к геометрической или кажущейся площади.

Бактериальные клетки, попадающие на такую поверхность вследствие седиментации, погибают в результате действия комбинации различных факторов. С одной стороны, имеет место нарушение целостности наружной мембраны бактериальной клетки при ее перфорировании наночастицами, осаждающимися на поверхность в процессе лазерной обработки (Tripathy et al., 2017; Boinovich et al., 2018). Далее происходит деформация клетки, потеря внутриклеточной жидкости и бактериолиз (рис. 1б). С другой стороны, взаимодействие магния с коррозионно-активной средой, роль которой в данном исследовании играет мясопептонный бульон, приводит к выделению водорода и резкому подщелачиванию жидкой среды. Ранее нами было показано (Емельяненко и соавт., 2019; Emelyanenko et al., 2020), что белки из МПБ адсорбируются на поверхность металла и стимулируют коррозию. Как отмечается в ряде исследований (Luque-Agudo et al., 2020; Lin et al., 2021), именно повышение pH среды и является одним из основных элементов токсического действия магния. Этот механизм приводит к гибели как планктонной формы бактерий, так и бактерий, находящихся на поверхности сплава. Здесь важно подчеркнуть, что если первый из указанных механизмов играет значительную роль только для поверхности с многомодальной шероховатостью, то механизм, связанный с ростом pH, важен и для гладких поверхностей, и для шероховатых. Однако скорость подщелачивания пропорциональна площади контакта подложки с коррозионной средой, а значит, будет выше именно для супергидрофильной поверхности, приводя к ускорению бактерицидного действия. Экспериментальные исследования эволюции pH в суспензиях, контактирующих с контрольной и супергидрофильной пластинами (Emelyanenko et al., 2021), подтверждают приведенный выше анализ.

Наконец, третьим важным механизмом гибели бактериальных клеток вблизи поверхностей из магниевого сплава является повышение концентрации ионов магния в жидкой среде, приводящее к осмотическим эффектам в клетке (Luque-Agudo et al., 2020). Выполненные нами недавно исследования концентрации ионов магния в бактериальных суспензиях (Emelyanenko et al., 2021) показали, что, как правило, концентрация ионов магния в жидкой среде оказывается того же порядка, что и типичные внутриклеточные концентрации (Jahnen-Dechent and Ketteler, 2012; Luque-Agudo et al., 2020), что позволяет для обсуждаемой здесь системы не рассматривать механизм, связанный с осмотическими клеточными эффектами, как значительно влияющий на гибель бактерий в дисперсионной среде.

Таким образом, представленные здесь данные по действию пластин магниевого сплава на планктонную и осажденную на подложку формы бактериальных клеток E. coli показывают, что эффективность бактерицидного действия магния оказывается близкой к таковому для меди (Емельяненко и соавт., 2019), рассматриваемой в литературе как один из самых сильных бактерицидных металлов. Однако широкому использованию антибактериальных свойств меди препятствует ее токсичность для человека. Для магниевых сплавов, при практически таком же значительном, как и для меди, антибактериальном эффекте, упоминания о токсичности в литературе отсутствуют. Полученные здесь данные показывают, что антибактериальные свойства используемого в работе супергидрофильного покрытия значительно превосходят отмеченные для гладкой контрольной пластины. Это открывает дальнейшие перспективы по подбору морфологии поверхности супергидрофильных покрытий, которая позволит в значительной степени усилить бактерицидный эффект магния.