Микробиология, 2022, T. 91, № 6, стр. 742-748

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эндофитные грибы были выделены из клубеньков трех актиноризных растений, произрастающих в Сухумском Ботаническом саду (Грузия, СССР) на желтоземных почвах, ‒ лоха колючего (Elaeagnus pungens), восковницы восконосной (Myrica cerifera) и кориарии миртолистной (Coriaria myrtifolia) (Kochkina et al., 1994) (табл. 1).

Изучение культурально-морфологических признаков грибов проводили на мальт-экстракт агаре (MEA), картофельно-глюкозном агаре (PDA), овсяном агаре (OA) при различных температурах (5, 15, 20, 25, 30, 37°С) в течение 6 нед. Оценивались макроскопические (морфология колоний, цвет, диаметр) и микроскопические (репродуктивные структуры, форма и размер конидий) признаки на 14‒30 сут роста. Цвет колоний определяли по специальным цветовым картам (Kornerup, Wanscher, 1978).

Для молекулярно-генетического изучения выделенных культур биомассу получали на среде PDA с целлофаном при 25°C. ДНК грибов выделяли с помощью набора Фитосорб (“Синтол”, Москва, Россия). Концентрацию ДНК измеряли с использованием флуориметра Qubit 3.0 (“Life Technologies”, Карлсбад, Калифорния, США).

Участок ДНК с увеличением длины секвенирования до 1500 п.н. (Vasilenko et al., 2018), включающий фрагмент гена малой субъединицы рРНК (SSU), регион ITS (ITS1, 5.8S рРНК, ITS2) и D1‒D3 домены большой субъединицы рРНК (LSU) всех изолятов амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами ITS1F (Gardes, Bruns, 1993) и LR5 (Tedersoo et al., 2008).

Реакции ПЦР проводили в 25 мкл конечного объема с 5 мкл шаблонной ДНК (концентрация 20‒70 мкг/мл), 0.5 мкл каждого праймера (10 пмоль/мкл), 1.5 мкл MgCl₂ (25 мМ), 10 мкл мастер-микса (Реакционная смесь для ПЦР-РВ, “Синтол”, Москва, Россия) и 7.5 мкл ddH₂O. Параметры термоциклера (“Bio-Rad”, Hercules, CA, США) были следующими: первый период денатурации при 95°C в течение 5 мин, затем 34 цикла денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 53°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин 30 с. Окончательное удлинение при 72°C в течение 5 мин завершало реакцию. Ампликоны очищали с помощью набора Cleanup Standard (“Евроген”, Москва, Россия). Автоматизированное секвенирование ДНК проводилось компанией “Синтол’ (Москва, Россия) с использованием праймеров ITS1F, LR5, ITS3, ITS4, NL-3AOV.

Сборку последовательностей осуществляли с помощью программ BioEdit версии 7.1.11 (Hall, 1999), DNASTAR (SaqMan Pro v. 11.1.0). Все последовательности были депонированы в Генбанк (табл. 1).

Сходство последовательностей исследуемых культур и типовых/референтных штаммов (Chen et al., 2016) ближайших видов оценивали с использованием программы BLAST (NCBI). Филогенетическое древо строили по методу максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) на основе модели замен семейства GTR (General Time Reversible Model) (Nei, Kumar, 2000) c использованием программного обеспечения MEGA X (Kumar et al., 2018). Для филогенетических построений использовали последовательности ITS и LSU, доступные из GenBank для всех референтных штаммов (табл. 2), и полученные нами нуклеотидные последовательности для грибов из актиноризных клубеньков (табл. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение полученных последовательностей шести эндофитных штаммов грибов (табл. 1) показало, что они идентичны или практически идентичны (100 и 99.9%). По последовательностям ITS и LSU рДНК эндофиты были наиболее близки к организмам рода Pezicula (максимальный уровень сходства выявлен с Pezicula radicicola). Величины сходства между P. radicicola CBS 640.94 (типовой штамм вида) и штаммами из клубеньков по ITS (552 п.н.) достигали 99.82‒100% (отличия по одному нуклеотиду или полная идентичность) и по LSU (877 п.н.) – 99.88‒99.89%.

Сходство ITS исследуемых штаммов и другого наиболее близкого вида, P. melanigena, было 99.07‒99.28%, что ниже предложенной границы разделения видов ‒ 99.6% (Vu et al., 2019). Показатели сходства с другими видами были еще ниже.

На филогенетическом древе, построенном на основе комбинированных последовательностей ITS региона рДНК и фрагментов генов LSU рДНК, все изученные штаммы формировали монофилетическую группу в составе рода Pezicula, включающую также типовой штамм P. radicicola CBS 640.94, и обособлялись от организмов других видов (рис. 1).

Рис. 1.

Филогенетическое дерево изученных и типовых/референтных штаммов видов рода Pezicula на основе комбинированных последовательностей ITS и LSU ядерной рДНК, построенное по методу максимального правдоподобия (Maximum Likelihood). Шкала соответствует 0.005 замены нуклеотидов на позицию.

Результаты филогенетического анализа согласуются с данными фенотипического изучения культур. Известно (Kowalski, Bartnik, 1995; Verkley et al., 2003; Sigler et al., 2005), что для получения конидиогенных структур in vitro у изолятов Pezicula используется набор разнообразных условий культивирования (сред и температур). Установлено, что все шесть изученных штаммов росли в интервале температур от 5 до 30°С, при температуре 37°С рост отсутствовал.

При оценке роста штаммов во всех изученных вариантах культивирования было отмечено, что культуральные признаки наиболее выражены на среде PDA при оптимальной для роста температуре культивирования 25°С. Диаметр колоний на PDA через 14 сут роста достигал: 76‒84 мм (ВКМ F-4854, ВКМ F-4855, ВКМ F-4857) и 60‒67 мм (ВКМ F-3184, ВКМ F-4853, ВКМ F-4856). Колонии плотные, войлочные, края ровные или лопастные, цвет варьировал от белого (3A1) до красноватого светло-коричневато-оранжевого (5C3), центры колоний были наиболее пигментированы. Цвет реверса варьировал от белого (3A1) до сернистого (4C5), оранжево-серого (5A2) и табачно-коричневого (5F6). Наиболее интенсивный цвет колоний был обнаружен у штаммов ВКМ F‑3184, ВКМ F-4853 и ВКМ F-4857. Ни один штамм не образовал плодовые тела в чистой культуре. Штамм ВКМ F-4857 остался стерильным независимо от условий культивирования. Пять штаммов сформировали макроконидии (19‒35 × 5.0‒ 7.5 мкм), типичные по форме и размерам для P. radicicola, как на одиночных конидиеносцах, так и в спородохиях разной формы ‒ от полукруглой до сферической (рис. 2). Микроконидии (3.5‒7.5 × × 1.5‒2.5 мкм), отмеченные при описании вида P. radicicola, образовались только у штаммов ВКМ F-4853 и ВКМ F-4854. Сетаподобные гифы, описанные у P. radicicola, удалось обнаружить только у штамма ВКМ F-3184, строму ‒ у штамма ВКМ F-4853.

Рис. 2.

Конидиогенные структуры штамма ВКМ F‑4853.

Фенотипические характеристики изученных штаммов достаточно сильно различаются по отдельным признакам, таким как интенсивность окраски колоний, наличие/отсутствие конидий, сетозных (жестких, толстостенных, темноокрашенных) гиф и стромы, однако в целом соответствуют описанию P. radicicola (Kowalski, Bartnik, 1995). Ранее при описании видов рода Pezicula также отмечалась значительная фенотипическая вариабельность штаммов (Sigler et al., 2005).

Таким образом, на основании результатов сравнительного анализа последовательностей ITS, фрагментов LSU рДНК и фенотипических признаков изученные штаммы могут быть отнесены к виду Pezicula radicicola (T. Kowalski et C. Bartnik 1995) P.R. Johnston 2014, типовой штамм которого был выделен с корней дуба Quercus robur. В настоящее время грибы этого вида найдены на корнях осины (Wang et al., 2007), ясеня, ели (Stroheker et al., 2021) и других растений. Из клубеньков актиноризных растений субтропической зоны, где они являются одними из основных микосимбионтов, эти грибы были выделены впервые.

Для понимания экологической роли эндофитов P. radicicola в клубеньках была оценена встречаемость и доля представителей этого вида среди всех ассоциативных симбионтов, изученных нами ранее (Ivanushkina et al., 1994). Микобиота корневых клубеньков этих растений представлена анаморфами аскомицетов и базидиомицетов, а также большим количеством стерильного мицелия, как темного, так и светлоокрашенного. Большая часть всех идентифицированных штаммов принадлежала к видам рода Cylindrocarpon: C. didymum, C. effusum, C. obtusisporum и C. theobromicola. Хорошо известно, что представители этого рода являются патогенами растений (Capote et al., 2022), однако в нашем случае никаких видимых признаков заболевания обнаружено не было. Эндофиты вида P. radicicola оказались вторыми по обилию (отношению числа штаммов данного рода к общему числу выделенных штаммов) и первыми по частоте встречаемости (отношение числа образцов, в которых встретился таксон к общему числу образцов) среди всех выделенных из клубеньков грибов. Частота встречаемости P. radicicola оказалась выше 80%, что больше, чем у других ассоциативных микосимбионтов. Очень небольшое количество изолятов принадлежало родам Fusarium, Acremonium, Zalerion и некоторым другим (Ivanushkina et al., 1994).

Виды рода Pezicula обычно встречаются в умеренных регионах мира. Они могут быть сапротрофами на гниющей древесине и опаде, а также способны выступать как эндофитные грибы, локализуясь в разных частях растений.

Подробно спектр растений, из которых выделяются грибы этого рода, представлен в масштабном таксономическом труде, посвященном грибам рода Pezicula и близким родам (Chen et al., 2016), где было изучено 211 штаммов из крупнейшей коллекции грибов CBS (Collection of yeasts and filamentous fungi, The Westerdijk Fungal Biodiversity Institute). Показано, что около трети всех штаммов было изолировано из растений порядка Pinales (сосновые) – это сосна, ель, лиственница и пихта. В отделе Magnoliophyta (цветковые) наибольшее число штаммов было выделено из порядков Fagales (буковые) и Rosales (розоцветные) ‒ 16 и 14% соответственно. Штаммы выделяли с разных частей растений, но более всего ‒ из корневой системы. Авторы отметили, что некоторые виды Pezicula могут быть слабыми патогенами растений, вызывающими заболевания исключительно у ослабленных хозяев.

Выделенные нами штаммы связаны с растениями лох колючий (Rosales, розоцветные), восковница восконосная (Fagales, буковые) и кориария миртолистная (Cucurbitales, тыквоцветные). С растений последнего порядка штаммы этого рода были выделены впервые.

Роль этих грибов в клубеньках актиноризных растений до конца не изучена. Однако известно, что эндофиты растений продуцируют целый пул метаболитов с разнообразной структурой, которые активно участвуют в жизни растений и могут служить важнейшими ресурсами для разработки новых эффективных фунгицидов (Xu et al., 2019).

Грибы рода Pezicula ‒ неисчерпаемые источники разнообразных вторичных метаболитов, полезных для растений. Они образуют различные биологически-активные вещества (Schulz et al., 1995), например, эхинокандины, представляющие собой противогрибные липопептиды, элиминирующие фитопатогенные грибы и позволяющие осуществлять защиту растений, и при этом сами не испытывают влияния микоцида вследствие уникального генетического механизма саморезистентности (Yue et al., 2018). Кроме того, эти грибы продуцируют и другие антибиотики, такие как меллеин, микоризин, криптоспориопсин, криптокандин (Chen et al., 2016). Они синтезируют летучие соединения, активные в отношении фитопатогенных грибов Sclerotinia sclerotiorum и Setosphaeria turcica, ингибирующие их развитие (Zhang et al., 2018). Недавно был выделен штамм Pezicula sp., образующий целый спектр метаболитов, активных в отношении различных фитопатогенных грибов, особенно против Botrytis cinerea и Fulvia fulva, что переводит эти грибы в разряд перспективных для биотехнологии (Wang et al., 2014). В США получен патент на способ производства средств для профилактики и борьбы с грибными заболеваниями растений на основе сложных эфиров грибов Pezicula sp. (Xu et al., 2019).

Изучение грибов, ассоциированных с микоризами, показало, что грибы рода Pezicula встречаются в корневой системе микоризных растений наряду с Glomus и другими эндомикоризными грибами. Предполагается, что это также связано с продукцией вторичных метаболитов, активных в отношении фитопатогенов. Но это только одна из функций. Все большее число исследований показывает, что немикоризные эндофитные грибы могут снабжать растение-хозяина фосфором, потенциально играя ту физиологическую роль, которая свойственна грибам микоризы (Almario et al., 2017; Toju, Sato, 2018).

Было сделано предположение, что грибы-эндофиты, связанные с различными таксономическими группами растений в широком географическом диапазоне, могут опосредовать косвенные взаимодействия между арбускулярными микоризными и эктомикоризными видами растений через подземные мицелиальные связи, создавая целые “метасообщества” (Toju et al., 2018). В Японии с помощью метагеномного секвенирования были получены данные о корневых ассоциациях грибов с растениями на территории восьми хвойных лесов Японского архипелага, включающие информацию о 150 видах деревьев и более 8000 ОТЕ грибов. Детальный сетевой анализ полученных сведений позволил выявить среди тысяч видов “метакоммуникативные” узловые виды грибов (“hub” species), которые играют ключевую роль в синхронизации процессов масштаба “метасообщества” в растительно-микробных ассоциациях, способствуя росту растений-хозяев и устойчивости их к патогенам. Список “метакоммуникативных” эндофитных грибов не слишком велик, но включает грибы рода Pezicula (Toju et al., 2018).

Данный вывод согласуется с нашими исследованиями, которые показывают, что роль этих грибов в клубеньках актиноризных растений может не исчерпываться какой-то одной функцией и быть гораздо сложнее, чем взаимодействие растение‒гриб. Проведенное нами изучение взаимоотношений между грибами рода Pezicula и основным симбионтом актиноризных клубеньков актиномицетами рода Frankia указывает на мутуалистические отношения между этими микроорганизмами. Известно, что актиномицеты рода Frankia образуют розовые или красно-коричневые пигменты, идентифицированные как бензонафтан-хиноны, которые, как было показано, ингибируют рост некоторых грамположительных бактерий, дрожжей и грибов. Более детальное изучение состава антимикробных соединений, выделенных из штаммов Frankia (изоляты из Alnus incana и Pinus sylvestris), показало, что это антибиотические вещества кальцимицинового класса и пироэфирные ионофоры (Sarma et al., 2003). Нами показано, что пигмент, образованный актиномицетами Frankia, выделенными из тех же клубеньков, что и штаммы Pezicula radicicola, положительно повлиял на развитие последних, увеличивая скорость роста в среднем на 40%. В то же время рост грибов Fusarium oxysporum, которые не встречались в клубеньках, но были обнаружены в желтоземах вокруг них, значительно замедлялся (Kochkina et al., 1995). Очевидно, что можно говорить о селективном воздействии пигмента на грибы из разных мест обитания.

Этот факт может быть подтверждением избирательности клубеньков по отношению к микромицетам, что выражается в наличии в клубеньке специфического комплекса микроорганизмов, в котором впервые найденные грибы рода Pezicula могут играть значительную роль.