Микробиология, 2023, T. 92, № 2, стр. 197-203

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились образцы хитозана, полученного из хитина крабов: хитозан с молекулярной массой 28 кДа, степенью дезацетилирования (СД) 94% и индексом полидисперсности 1.75 (ООО “Биопрогресс”, Россия) и хитозан кватернизированный с молекулярной массой 28 кДа и степенью замещения 60%, полученные по методикам, описанным ранее (Шагдарова и соавт., 2016). Образцы хитозана растворяли в стерильной деионизованной воде (1 мг/мл) с добавлением уксусной кислоты до концентрации 0.1%.

Антибактериальную активность растворов хитозана исследовали на тест-бактериях: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli M-17, Enterococcus faecalis NCIMB 13280, Mycobacterium smegmatis mc² 155, Pseudomonas fluorescens ATCC 948, Staphylococcus epidermidis ATCC 29887. Бактерии выращивали до поздней логарифмической фазы на питательной среде Luria-Bertani (LB), содержащей (г/л дистиллированной воды): триптон – 10, дрожжевой экстракт – 5, KCl – 6.4. Культивирование проводили на орбитальном шейкере (160 об./мин) при 37°С в течение 16‒18 ч. Готовили суспензии бактерий в свежей питательной среде LB, содержащие 10⁶ колониеобразующих единиц в 1 мл среды (КОЕ/мл).

Для работы использовали растворы красителей: основного и кислого фуксинов, кристаллического фиолетового, конго красного. Стоковые 1% растворы готовили по стандартной методике (Теппер и соавт., 1972), а затем разводили в 500 раз в буфере (рН 7.1) следующего состава (г/л): К₂НРО₄ · 3Н₂О – 22.2, КН₂РО₄ – 7.26, NH₄NO₃ – 1.8, МgSО₄ · 7Н₂О – 0.2 (Rosenberg, 1984).

Антибактериальную активность растворов хитозана определяли методом двукратных серийных разведений в стерильных полистироловых планшетах (“Медполимер”, Россия). В качестве инокулума использовали суспензии тестируемых бактерий, содержащие 10⁶ КОЕ/мл. Планшеты инкубировали в термостате при оптимальной для каждого вида бактерий температуре в течение 18‒20 ч. За минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) принимали минимальную концентрацию хитозана, при которой не наблюдалось заметного невооруженным глазом роста тест-бактерий.

Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) хитозана из лунок, в которых не наблюдалось роста бактерий, удаляли содержимое, и вносили в них по 100 мкл свежей питательной среды LB. Планшеты вновь помещали в термостат с оптимальной для роста температурой и инкубировали не менее 48 ч. Бактерии оставшиеся живыми, после удаления антибактериального агента, возобновляли свой рост. Концентрация раствора хитозана, при удалении которого рост бактерий в свежей среде не возобновлялся, принималась за МБК.

Для оценки уровня гидрофобности бактерий, их клетки дважды промывали и ресуспендировали в указанном выше буфере до оптической плотности (ОП₆₀₀) 0.2‒0.4 (спектрофотометр PD-303; “Apel”, Япония). Гидрофобность бактерий определяли по их сродству к растворителю н-гексадекану (“Вектон”, Санкт-Петербург), используя МАТН-метод (Microbial Adhesion to Hydrocarbons) (Rosenberg, 1984). Для этого в стеклянные обезжиренные пробирки вносили 1 мл бактериальной суспензии в буфере и наслаивали 200 мкл н-гексадекана. Содержимое пробирок интенсивно встряхивали с помощью вихревого встряхивателя Vortex FS 16 (“BioSan”, Латвия) в течение 2 мин. После 20 мин отстаивания смеси измеряли оптическую плотность водной фазы при 600 нм (PD-303; “Apel”, Япония). Процент гидрофобности определяли, умножая на 100 разницу между оптической плотностью исходной суспензии и таковой после смешивания с углеводородом и деля на оптическую плотность исходной суспензии.

Для определения интенсивности связывания красителей с бактериями использовали бактериальные суспензии с ОП₆₀₀ = 1.2‒1.3. По 0.5 мл суспензии каждого вида бактерий в 5 повторах вносили в пробирки для центрифугирования. Клетки осаждали при 12 000 об./мин в течение 3 мин (Microspin 12; “BioSan”, Латвия). Осадок клеток ресуспендировали в 1 мл красителя, разбивали на вихревом встряхивателе и продолжали перемешивать с красителем в течение 15 мин, а затем вновь осаждали на центрифуге. По 100 мкл надосадочной жидкости переносили в 96-луночные планшеты. Оптическую плотность исходных растворов красителей и растворов, полученных после сорбции красителей на клетках, измеряли на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (“BioRad”, США). Оптическую плотность растворов фуксина определяли при длине волны (λ) 545 нм, конго красного – при λ = 490 нм, кристаллического фиолетового – при λ = 585 нм. Полученные значения оптической плотности растворов в каждой пробе усредняли, рассчитывали среднеквадратичное отклонение и доверительный интервал (при α = 0.05). По разнице оптической плотности исходных растворов красителей и плотности растворов после взаимодействия с клетками рассчитывали процент связывания красителя с бактериями.

Все эксперименты были проведены не менее чем в 3-х повторностях. Статистическую и графическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы MS Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Под тинкториальными свойствами бактерий, грибов и простейших понимают их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом (Красильников, 1999). Исследованные в настоящей работе бактерии обладали различными тинкториальными свойствми. Так B. subtilis ATCC 6633, S. epidermidis ATCC 29887, Ent. faecalis NCIMB 13280 и M. smegmatis mc² 155 являются грамположительными бактериями, а E. coli M-17 и P. fluorescens АТСС 948 ‒ грамотрицательными. В то же время, бактерии M. smegmatis mc² 155 обладают кислотоустойчивостью, благодаря наличию в их клеточной стенке миколовых кислот, а бактерии B. subtilis ATCC 6633 формируют споры, обладающие особыми поверхностными характеристиками и отношением к красителям. Таким образом, в работе были использованы представители бактерий, имеющих принципиальные различия в строении клеточных стенок и обладающие разным сродством к красителям.

При изучении антибактериальных эффектов двух образцов хитозана было установлено, что бактерии разных видов обладают неодинаковой чувствительностью к исследуемым соединениям. Так, наименьшие значения МИК и МБК хитозана были выявлены для бактерий M. smegmatis mc² 155 и S. epidermidis ATCC 29887. Высокая чувствительность (низкие значения МИК) к хитозану была обнаружена у грамотрицательных бактерий E. coli М-17 и P. fluorescens ATCC 948, однако бактерицидные концентрации были в 8 раз выше, чем МИК. Кватернизированный хитозан практически не проявлял ингибирующей активности в отношении грамотрицательных бактерий (табл. 1).

Исследование антибактериальной активности хитозана и его кватернизированной формы показали существенные различия в характере их действия на тестируемые бактерии. Антибактериальная активность кватернизированной модификации оказалась несколько выше, чем у исходного хитозана. Низкие концентрации кватернизированного хитозана оказывали подавляющее и бактерицидное действие на исследованные грамположительные бактерии: B. subtilis, Ent. faecalis, M. smegmatis, S. epidermidis. Причем наиболее выраженный антибактериальный эффект был отмечен в отношении M. smegmatis. Однако в отношении грамотрицательных бактерий кватернизированый хитозан обладал наиболее слабым ингибирующим действием. Только высокие концентрации данного соединения были способны подавлять рост E. coli и P. fluorescens, при этом бактерицидного действия не отмечалось совсем.

Что касается исходного хитозана с высокой СД, то малые его концентрации оказывали ингибирующие и бактерицидные эффекты только для M. smegmatis и S. epidermidis. В отношении E. coli и P. fluorescens хитозан в малых концентрациях был способен подавлять рост, однако для бактерицидного воздействия на эти бактерии необходимы были гораздо более высокие концентрации хитозана. Наименьшее антибактериальное действие хитозан оказывал на B. subtilis и Ent. faecalis, которые были высоко чувствительными к хитозану в кватернизированной форме.

Поверхностные свойства бактериальных клеток определяют их сродство к различным соединениям – антибиотикам, красителям, питательным субстратам. Связывание хитозана с бактериями-мишенями также может зависеть от природы их поверхностей. Одной из важных поверхностных характеристик бактериальной клетки является степень ее гидрофобности (Панькова и соавт., 2011).

Проведенные исследования показали, что наиболее гидрофобной поверхностью обладали микобактерии, что характерно для их оболочек, содержащих большое количество липидов, составляющих до 60% от массы клеточной стенки (Шульгина и соавт., 2018). Равной степенью гидрофобности обладали бактерии B. subtilis, Ent. faecalis и S. epidermidis, свойства поверхности которых в большей степени определяются поверхностно-ассоциированными белками (Vadyvaloo, Otto, 2005). Грамотрицательные бактерии, исследованные в работе, обладали выраженными гидрофильными свойствами (табл. 2).

Анализ корреляционной зависимости между МИК хитозана и степенью гидрофобности тест-бактерий показал для исследуемых соединений разнонаправленные результаты. Для исходного хитозана была выявлена слабая положительная корреляция с коэффициентом r = 0.35. МИК кватернизированного хитозана, напротив, оказалась в сильной обратной зависимости (r = ‒0.98) от уровня гидрофобности бактерий (рис. 1). Выявленная корреляция и слабое воздействие кватернизированного хитозана на “гидрофильные” грамотрицательные бактерии указывают на то, что его антибактериальные эффекты могут развиваться с образованием гидрофобных связей с поверхностными структурами бактерий.

Рис. 1.

Корреляционная зависимость МИК хитозана (а) и кватернизированного хитозана (б) от уровня гидрофобности бактерий.

Известно, что сродство бактерий к красителям во многом зависит от заряда поверхности клеток, а разные типы красителей связываются с отрицательно или положительно заряженными локусами бактериальной клетки. В этой связи были проведены исследования по выявлению закономерности действия хитозана от заряда клеточной поверхности, который определяли путeм оценки уровня сорбции различных красителей на бактериях.

Основные красители связываются с отрицательно заряженными структурами микробной клетки – тейхоевыми кислотами стафилококков и энтерококков, карбоксильными группами пептидогликана, липидом II (Юсупова и соавт., 2013; Schneewind, 2014). Сорбция основных красителей особенно эффективно происходила на клетках бактерий B. subtilis, M. smegmatis и S. epidermidis. Эти бактерии связали более 50% красителя. Около 40% основных красителей связывали клетки грамотрицательных бактерий (рис. 2а).

Рис. 2.

Связывание основных (1 ‒ кристаллический фиолетовый; 2 ‒ основной фуксин) (а) и кислых (3 ‒ кислый фуксин; 4 ‒ конго красный) (б) красителей с клетками бактерий. По оси абсцисс: 1 – B. subtilis ATCC 6633; 2 – E. coli M‑17; 3 – Ent. faecalis NCIMB 13280; 4 – M. smegmatis mc² 155; 5 – P. fluorescens ATCC 948; 6 – S. epidermidis ATCC 29887.

Связывание кислых красителей с бактериальными клетками происходит также путем электростатических взаимодействий, но только с положительно заряженными структурами на поверхности клеток. Таких структур на поверхности бактерий немного, в основном, это лишь некоторые оксифильные белки и бактериальные амилоиды, роль которых особенно важна в адгезии и биопленкообразовании (Ewans et al., 2018). В наших экспериментах активной сорбции кислых красителей на планктонных бактериях не наблюдалось (рис. 2б).

Таким образом, существенные различия сорбции красителей на разных бактериях были выявлены при связывании с клетками кристаллического фиолетового и основного фуксина, сродство которых может зависеть от суммарного отрицательного заряда клеток.

Анализ корреляции между МИК исследуемых соединений и степенью связывания бактериями основных красителей вновь показал разные результаты. Для ингибирующего действия хитозана не было выявлено зависимости от суммарного отрицательного заряда тестируемых бактерий (r = 0.2). Однако действие кватернизированного хитозана вновь коррелировало с уровнем отрицательного заряда бактериальных поверхностей (r = ‒0.88) (рис. 3).

Рис. 3.

Корреляционная зависимость МИК кватернизированного хитозана от суммарного отрицательного заряда клетки (по связыванию кристаллического фиолетового).

Проведенные исследования показали, что хитозан с высокой СД и его кватернизированная модификация различаются по характеру и активности антибактериального действия. Хитозан ингибировал рост тестируемых бактерий при концентрациях, варьирующих в пределах от 31 до 250 мкг/мл. При анализе закономерностей антибактериального действия хитозана не было выявлено зависимостей ни от степени гидрофобности бактериальной поверхности, ни от уровня ее отрицательного заряда. Вероятно, связывание хитозана с атакуемыми бактериями происходит не только по механизмам электростатических и/или гидрофобных взаимодействий, но и посредством специфических сайтов связывания.

Антимикробное действие кватернизированной формы хитозана отличалось и по характеру, и по активности. Ингибирующий рост бактерий эффект модифицированного хитозана был выше, однако он проявлялся лишь в отношении грамположительных бактерий, клеточные поверхности которых обладали выраженной гидрофобностью. Рост же грамотрицательных бактерий, обладающих гидрофильными оболочками, ингибировался лишь в присутствии высокой концентрации хитозана (500 мкг/мл), а его МБК для этих бактерий не была выявлена.

Указанные наблюдения и выявленная высокая корреляционная зависимость между антибактериальной активностью и степенью гидрофобности поверхности тестируемых бактерий указывают на то, что гидрофобные неполярные взаимодействия играют важную роль в связывании молекул модифицированного хитозана с клеткой-мишенью. Однако полярные электростатические взаимодействия, судя по всему, также вносят свой вклад в биологическую активность этого соединения. Показанная корреляция между степенью антибактериального эффекта и уровнем отрицательного заряда бактериальной поверхности хорошо согласуется с тем фактом, что квартернизация значительно повышает уровень положительного заряда макромолекулы хитозана (Shagdarova et al., 2019).