Микология и фитопатология, 2019, T. 53, № 4, стр. 246-253

ВВЕДЕНИЕ

Желтая пятнистость листьев пшеницы является экономически значимым заболеванием во всем мире. Ее возбудитель – гомоталличный аскомицет Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler [анаморфа Dreschlera tritici-repentis (Died.) Shoemaker] из порядка Pleosporales. Имеются сообщения о широком распространении болезни в Европе, Юго-Западной Азии, Центральной Азии, Северной и Южной Америке, Африке, Австралии (Maraite et al., 2006; Oliver et al., 2008; Momeni et al., 2014; Kokhmetova et al., 2017).

В России на данный патоген впервые обратили внимание в 1985 г. (Granin et al., 1989). С 2000-х гг. болезнь распространилась по всей России: она обнаружена в Дагестане, Западной Сибири, на Алтае (Mikhailova et al., 2007). В последние 10 лет распространение болезни в Северо-Кавказском регионе на некоторых производственных полях Краснодарского, Ставропольского краев, Ростовской обл. достигало 80–100%, а развитие на восприимчивых сортах – 60–80% (Kremneva et al., 2013, 2014).

В последние годы это заболевание является экономически важным из-за серьезного влияния на производство пшеницы как по количеству, так и по качеству производимого зерна. Средние потери урожая от патогена составляют 5–10%, однако в условиях, благоприятных для развития гриба, наблюдались потери до 50% (Shabeer et al., 1988). Качество зерна снижается из-за образования красных и темных пятен, вызванных инфекцией (Fernandez et al., 1998).

Для возбудителя желтой пятнистости листьев характерно большое генетическое разнообразие (Friesen et al., 2005). Информация о структуре популяции патогена необходима для успешной защиты от болезни с использованием устойчивых сортов, эффективных фунгицидов и средств биологической защиты. Изучение изменчивости популяций фитопатогенных грибов имеет как фундаментальное значение – для развития теории микроэволюции, так и сугубо прикладное, являясь необходимым звеном при создании инфекционных фонов, селекции устойчивых сортов растений, установлении ареалов популяций, территориальном размещении источников и доноров устойчивости (Afanasenko, 1998).

Информация об изменчивости популяций возбудителя желтой пятнистости листьев пшеницы представлена во многих работах. Ряд авторов (Schilder et al., 1990; Ali et al., 2003; Kremneva et al., 2007; Mikhailova et al., 2007) изучали изменчивость вирулентности в популяциях патогена, и в своих работах они отмечали, что в природной популяции P. tritici-repentis существуют группы изолятов с разной вирулентностью к сортам пшеницы.

Основываясь на способности P. tritici-repentis вызывать некрозы и хлорозы на трех дифференцирующих линиях (Glenlea, 6В365 и 6В662) было описано 8 рас (Lamari et al., 2003; 2010). Хозяинспецифичные токсины Ptr ToxA, Ptr ToxB и Ptr ToxC дифференциально продуцируются расами P. tritici-repentis и служат факторами патогенности гриба. Изоляты гриба рас 2, 3 и 5 производят по одному токсину: Ptr ToxA, Ptr ToxC или Ptr ToxB, соответственно. Изоляты рас 1, 6 и 7 производят по два токсина каждый: Ptr ToxA + Ptr ToxC, Ptr ToxB + Ptr ToxC и Ptr ToxA + Ptr ToxB, соответственно. Изоляты расы 8 производят все три токсина, в то время как изоляты расы 4 не производят никаких известных токсинов и считаются непатогенными (Lamari et al., 2003; 2010).

В большинстве регионов мира, включая Америку и Австралию, расы 1 и 2 P. tritici-repentis являются доминирующими, встречаются с частотой от 40 до 90% (Friesen et al., 2005; Ali et al., 2003; Gamba et al., 2012; Aboukhaddour et al., 2013). В регионах, которые охватывают центры разнообразия пшеницы, такие как Азербайджан, Сирия и Северная Африка разнообразие по расовому составу является наибольшим (Lamari et al., 2005). В этих регионах обнаружены шесть рас – 1, 2, 3, 5, 7, 8, встречающихся с различной частотой.

Л.А. Михайлова с соавторами (Mikhailova et al., 2014, 2015) проводила изучение расового состава популяций P. tritici-repentis, распространенных на территории России. С использованием канадских дифференциаторов среди изолятов P. tritici-repentis были определены 6 рас. Расы 1, 2 и 8 доминировали и встречались во всех изученных популяциях. Было показано, что омская популяция отличалась от уфимской, северокавказской и северо-западной популяций по расовому составу, по частоте изолятов, вирулентных к сортам-дифференциаторам, и величине клональной фракции.

Северо-Кавказский регион является основным производителем зерна в России – до 20% от общероссийского объема. Только в Краснодарском крае высевается более 100 генетически разнородных сортов пшеницы (Romanenko et al., 2017). Для создания и использования сортов со стабильной и эффективной устойчивостью к болезни необходимо знание структуры популяции гриба.

Целью настоящих исследований было определение расового состава, изменчивости и разнообразия популяции возбудителя желтой пятнистости листьев в Cеверо-Кавказском регионе России.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования по изучению расового состава проводили с 2010 по 2014 гг. Ежегодно были обследованы производственные и селекционные посевы озимой пшеницы в фазу колошения – молочной спелости в разных агроклиматических зонах Северного Кавказа (Краснодарский и Ставропольский края), отличающихся по влаго- и теплообеспеченности (Batova, 1966). Листья с симптомами желтой пятнистости были собраны с 3–5 полей (каждое поле ≥1 га) из каждого района. В общей сложности было собрано по 60 листьев с каждого поля с интервалом не менее 1 м друг от друга. Изоляты, включенные в это исследование, были собраны с сортов озимой мягкой и твердой пшеницы российской селекции НЦЗ им. П.П. Лукьяненко, Научного центра “Донской”.

Было проанализировано 628 моноконидиальных изолятов P. tritici-repentis, выделенных из трех агроклиматических зон Северного Кавказа. 204 изолята выделены из 6 районов южной предгорной зоны (Лабинский, Курганинский, Андроповский, Предгорный, Советский, Георгиевский), 237 изолятов из 6 районов центральной зоны (Тимашевский, Динской, Усть-Лабинский, Кавказский, Гулькевичский, Новоалександровский) и 187 – из 4 районов западной приазовской зоны (Ейский, Каневский, Кущевский, Щербиновский). Ежегодно изучали от 100 до 130 изолятов.

Выделение моноспоровых изолятов проводили по методике, описанной Л.А. Михайловой с соавторами (Mikhailova et al., 2002). Из пластинки листа вырезали сегменты, на которых располагалось одно инфекционное пятно и прилегающий к нему участок зеленой ткани. Сегменты листьев помещали в марлевые мешочки, которые промывали в проточной воде в течение часа. Стерилизацию отрезков проводили в 0.1%-м р-ре AgNO₃ 30 сек. Простерилизованные сегменты помещали в чашку Петри со средой V-4 (4 части сока свеклы, 3 – сока сельдерея, 2 – сока моркови и 1 – томата, 850 мл воды, 1.5 г СаСО₃). Для получения конидиального спороношения культуру патогена выдерживали в течение 5–6 суток при температуре 22–24°С под бактерицидными эритемными лампами ЛЭ-40 (освещенность 5000 лк). Затем чашки Петри с культурой помещали в холодильник при температуре 4°С на 1–2 суток для формирования конидий. Отдельные конидии иглой переносили на чистую чашку со средой.

Расовый состав популяций гриба определяли на дифференцирующем наборе, предложенном Ламари c соавторами (Lamari et al., 2005): сорта Glenlea, Salamouni и линии 6B662, 6B365. При проведении опытов растения пшеницы выращивали в набитых песком 25-миллилитровых пластиковых вазонах на гидропонике с применением питательного раствора Кнопа. Растения выращивали до фазы двух листьев в условиях теплицы при средней температуре 22°C с 16-часовым фотопериодом. В каждый вазон помещали по 5 растений каждого сорта. Опыт проводили в 3-кратной повторности. Каждую повторность инокулировали водно-конидиальной суспензией моноспорового изолята гриба.

Для приготовления конидиальной суспензии использовали 8-суточную культуру гриба. Фильтрацию осуществляли через 2–3 слоя стерильной марли. Титр спор готовой суспензии составлял 3000 спор/мл. Перед инокуляцией с растений снимали восковой налет и заражали их суспензией спор путем опрыскивания из пульверизатора. Инокулированные растения выдерживали во влажной камере в течение 11–12 ч при температуре 22°С. Учет степени развития заболевания проводили на 7-е сутки по шкале Rees et al. (1987). Согласно этой шкале изоляты с проявлением болезни 1–2 балла относили к авирулентным, с типом реакции 3–5 баллов – к вирулентным.

Анализ частоты расового состава популяций проводили между выборками изолятов гриба из разных агроклиматических зон и по годам. Уровень разнообразия выборок изолятов P. tritici-repentis по расовому составу оценивали с помощью индекса Shannon: ${{Н }_{w}} = - \sum {pi\ln (pi)} $, где pi – частота i-го фенотипа в данной популяции (Kolmer et al., 2001).

Различия между выборками патогена по расовому составу оценивали с помощью расстояния Роджерса: ${{H}_{r}} = 1{\text{/}}2\sum {(pi1 - pi2),} $ где pi1 – частота i-го фенотипа в первой популяции; pi2 – частота i-го фенотипа во второй популяции (Rogers, 1972). Различия в популяциях патогенов считаются существенными при значении индекса Роджерса более 0.3.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты определения расового состава образцов популяций возбудителя желтой пятнистости P. tritici-repentis в трех агроклиматических зонах Северного Кавказа за 2010–2014 гг. представлены в табл. 1.

Очевидно, что на протяжении пяти лет изучения доминирующими расами во всех зонах являлись 1, 2 и 8. В 2010 г. изоляты гриба 1 расы встречались с частотой от 40.5 (центральная зона) до 60.6% (южная предгорная зона). Но с годами наблюдалось постепенное снижение частоты изолятов этой расы до 15.0% (южная предгорная зона).

Процентное содержание изолятов патогена, принадлежащих к расе 2, было более стабильным на протяжении периода изучения, но к 2014 г. наблюдалось постепенное увеличение частот таких изолятов – их доля в центральной зоне составила 28.2%, в южной предгорной и западной приазовской – по 25.0%.

Изоляты P. tritici-repentis расы 8 продуцируют все три токсина, и их содержание в выборках популяций фитопатогена было достаточно высоким (в среднем 25–35%) во всех агроклиматических зонах за годы изучения. Максимальная частота расы 8 – 40.0% – отмечена в южной предгорной зоне в 2012, 2014 гг. и 41.9% – в центральной зоне в 2013 г. Динамика частот доминирующих рас северокавказской популяции P. tritici-repentis с 2010 по 2014 гг. представлена на рис. 1.

Рис. 1.

Динамика частот доминирующих рас северокавказской популяции Pyrenophora tritici-repentis (2010–2014 гг.).

Изоляты расы 4 встречались каждый год, но не во всех агроклиматических зонах, с переменной частотой от 2.7% (центральная зона, 2010 г.) до 18.5% (западная приазовская зона, 2011 г.). Изоляты 3, 5 и 7 рас встречались еще реже и в отдельные годы отсутствовали в популяции патогена. А изоляты расы 6 в популяциях 2010–2012 гг. не выявлены, но в 2013–2014 гг. наблюдалось их появление во всех агроклиматических зонах Северного Кавказа с частотой от 2.6 до 8.3%.

Уровень разнообразия популяции гриба по расовому составу представлен в табл. 2. Несмотря на отсутствие в отдельные годы некоторых рас в северокавказской популяции P. tritici-repentis, в целом уровень разнообразия в каждой агроклиматической зоне остается довольно высоким. Самые низкие показатели индекса разнообразия отмечены в 2010 г., а в 2013–2014 гг. популяция патогена была наиболее разнообразной. В 2014 г. был достигнут максимальный из полученных показатель индекса разнообразия в центральной зоне (Sh = 1.89).

Агроклиматические зоны Северного Кавказа отличаются по влаго- и теплообеспеченности, как известно, это – один из основных факторов, влияющих на развитие желтой пятнистости листьев. Ранее в наших работах было показано различие выборок изолятов из этих зон по признаку вирулентности (Kremneva et al., 2007). Из южной предгорной зоны изоляты P. tritici-repentis характеризовались наибольшей вирулентностью в сравнении с изолятами из центральной и западной приазовской зон.

Западная приазовская зона отдалена центральной зоной от южной предгорной. Расстояние от граничных точек каждой зоны составляло минимум 100 км. Сортимент высеваемых сортов также в этих зонах различен. Поэтому представлялось интересным, отличается ли северокавказская популяция патогена в различных агроклиматических зонах по расовому составу. Для этого было проведено попарное сравнение по индексу Роджерса выборок изолятов P. tritici-repentis из изученных зон между собой в годы исследований (табл. 3).

В целом, по всем зонам значительных различий не обнаружено (значение индекса Роджерса не превышало 0.3) даже между географически отдаленными зонами – южной предгорной и западной приазовской. Это дает основание сделать вывод о единстве северокавказской популяции P. tritici-repentis по расовому составу во всех изученных агроклиматических зонах.

Для того, чтобы более детально проследить динамику расового состава в каждой агроклиматической зоне на протяжении всего периода изучения, нами было проведено сравнение между годами исследований изолятов патогена, собранных в каждой из трех зон Северного Кавказа (табл. 4). Максимальными были различия между изолятами гриба западной приазовской зоны 2010 г. и остальными годами исследований. Изоляты P. tritici-repentis южной предгорной зоны 2010 г. также показывают существенные различия с остальными годами исследований.

В целом, при сравнении выборок патогена одних и тех же агроклиматических зон между годами: значения индекса Роджерса колебались от 0.1 (южная предгорная зона 2013–2014 гг.) до 0.5 (южная предгорная зона 2010–2014 гг.). Наибольшие различия во всех зонах получены при сравнении популяций P. tritici-repentis 2010 и 2014 гг.

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате изучения расового состава в Северо-Кавказском регионе России выявлено доминирование рас 1, 2 и 8. К 2014 г. изоляты расы 1, которые заметно доминировали на протяжении первых трех лет изучения, уступили по частоте изолятам рас 2 и 8. Расы 5 и 6, ответственные за развитие хлорозов и индукцию Ptr ТохС и Ptr ТохВ, с 2010 по 2012 гг. не встречались или встречались с низкой частотой. В 2013 и 2014 гг. эти расы отмечали с частотой до 12.0%. Можно предположить, что изоляты, синтезирующие согласно фитопатологическому тесту Ptr ТохВ, стали занимать больший ареал и вытеснять изоляты расы 1, продуцирующие Ptr ТохА и Ptr ТохС. К 2014 г. северокавказская популяция P. tritici-repentis представлена всеми 8 известными расами.

Аналогичный анализ расового состава желтой пятнистости листьев выполнили J. Šarova с соавторами (Sarova et al., 2005). Они определили в чешской популяции гриба расы 1, 2 и 4 с частотой 50, 3 и 5%, соответственно. Таким образом, раса 2 в Чехии является редкой, тогда как на европейской территории России она доминирует наряду с расой 1 (Mikhailova et al., 2015).

Имеются примеры, когда раса 2 является доминирующей или, напротив, встречается редко. С высокой частотой (36%) она была найдена в популяции Канадских Прерий и, вместе с тем, практически отсутствовала в популяции Великих Равнин. При этом расы 3, 4 и 5 в обеих популяциях встречались редко (Ali et al., 2003; Aboukhaddour et al., 2013). В Иране, расположенном близко к центру разнообразия пшеницы, изоляты гриба были сгруппированы только в две расы. Раса 1 была преобладающей и представляла 90% тестируемых изолятов, в то время как остальные 10% были классифицированы как раса 2 (Momeni et al., 2014). По данным Л.А. Михайловой и соавторов (Mikhailova et al., 2015), расы 5, 6, 7 на европейской территории РФ являются редкими, однако раса 8 встречается с высокой частотой до 40%.

Предыдущие работы показали, что популяции P. tritici-repentis имеют наибольшее разнообразие по вирулентности и расовому составу в регионах, охватывающих центр разнообразия пшеницы (Lamari et al., 2005). В этих регионах обнаружены изоляты, представляющие разнообразие рас и комбинации всех известных токсинов. Это подтверждает тот факт, что центр разнообразия растения также является центром наибольшей изменчивости патогенов этих растений (Vavilov, 1964).

Предпосылкой распространения желтой пятнистости на территории России могло быть широкое возделывание сортов озимой пшеницы Безостая 1 (Mikhailova et al., 2015). Сорт был создан в начале 1960-х гг. в Краснодарском НИИСХ, он был устойчив к бурой ржавчине, которая в то время являлась широко распространенной на территории России. С его участием создано большое число современных сортов пшеницы, широко районированных в южном регионе страны (Romanenko et al., 2017). Период возделывания сорта Безостая 1 и его производных длился 30 лет и был назван “эрой Безостая 1”. Возможно в период доминирования в посевах на Северном Кавказе и прилегающих регионах сорта Безостая 1 и его производных, создались благоприятные условия для накопления инфекционного материала болезни и возрастания численности популяции возбудителя.

В Краснодарском крае в Гулькевичском районе существует Кубанская опытная станция Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова (в настоящее время ФИЦ “Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова”). На станции высевается более 2000 образцов озимой и яровой пшеницы, собранной со всего мира и поступившей из коллекции этого института. Это место, по нашему мнению, может также играть большую роль в генетической разнородности и разнообразии популяции P. tritici-repentis, распространенной на Северном Кавказе. А широкий ассортимент высеваемых на юге России сортов мягкой и твердой пшеницы также оказывает влияние на формирование популяции патогена.

Выявленные нами различия между годами в исследуемых выборках патогена можно объяснить отличительными погодными условиям и сортиментом высеваемых сортов. 2010 г. характеризовался как засушливый. За период активной вегетации пшеницы выпало всего 20% осадков от нормы. Количество высеваемых сортов на территории Краснодарского и Ставропольского краев с 2010 к 2014 г. увеличилось. Но в пределах каждого года различий не выявлено. Это дает основание предположить, что северокавказская популяция патогена является единой на территории изученных агроклиматических зон, географически отдаленных и различных по тепло- и влагообеспеченности. В то же время популяция P. tritici-repentis является гибкой системой, быстро реагирующей на изменения различных факторов окружающей среды, что диктует необходимость ее постоянного мониторинга.

Авторы выражают благодарность научному сотруднику лаборатории иммунитета зерновых культур к грибным болезням ФГБНУ ВНИИБЗР, к.б.н. О.А. Кудиновой за помощь в проведении статистической обработки экспериментальных данных. Исследования выполнены согласно Государственному заданию № 075-00376-19-00 Министерства науки и высшего образования РФ в рамках НИР по теме № 0686-2019-0008.