Микология и фитопатология, 2020, T. 54, № 1, стр. 23-32

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время отмечается тенденция повышения пищевой и биологической ценности продуктов питания и кормов путем введения в их состав биологически активных добавок (БАД) – натуральных источников макро- и микронутриентов (Tutelyan, 2008; Ryazanova, Pirogova, 2011; Gammel et al., 2017). Перспективным субстратом для получения биологически значимых ингредиентов можно рассматривать микробную биомассу, содержащую белок, аминокислотный скор которого приближается к животному белку, а также ценные полисахариды (Feofilova, 2010; Serba et al., 2017). Для эффективного ее использования применяют биокаталитические технологии, обеспечивающие повышение степени биодоступности внутриклеточных компонентов, особенно белковых веществ, для действия пищеварительных ферментов (Rimareva et al., 2017; Sereda et al., 2018).

Известно, что ферментативный гидролиз пептидных связей является одним из важнейших регуляторных факторов во многих биохимических процессах жизнедеятельности живых организмов. Высокая биологическая значимость протеолиза – причина эволюционного происхождения множественных видов протеолитических ферментов с различной специфичностью и механизмом действия (Lysenko et al., 2011). Протеазы являются важным инструментом как в осуществлении биологических процессов в живых организмах, так и в биотехнологических процессах направленного получения пептидно-аминокислотных добавок для коррекции продуктов питания и кормов (Rawlings et al., 2010; Lysenko et al., 2011; Rimareva et al., 2017). В процессе глубокой биокаталитической деструкции белковой молекулы образуются свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды, которые, высвобождаясь из полимерной структуры, приобретают биологическую активность и становятся самостоятельными регуляторными факторами с определенными функциональными свойствами (Orlova et al., 2012).

В настоящее время исследовано много биологически активных пептидов, которые были выделены из белков, содержащихся в пищевом сырье. Спектр их биологических функций весьма широк и разнообразен: одни воздействуют на иммунные процессы организма, некоторые связаны с деятельностью центральной нервной системы, обладают антигипертонической активностью, другие оказывают регуляторное влияние на функции пищеварительной системы, проявляют пребиотическое действие и т.д. (Jeong et al., 2003; Razumnikova et al., 2011; Skat, 2017). Известно, что регуляторные пептиды в основном являются низкомолекулярными и содержат от 2 до 20 аминокислотных остатков. Биоактивные пептиды с молекулярной массой менее 5 кДа обнаружены в ферментолизатах из животного, растительного и микробного сырья (Jeong et al., 2003; Prosekov, 2010; Kulikova, 2015; Serba et al., 2017).

Рядом исследователей показано, что в результате ферментативного гидролиза белков, содержащихся в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, образуются биоактивные пептиды, проявляющие антиоксидантные и антиканцерогенные свойства (Orlova, Rimareva, 2007; Orlova et al., 2012). В отличие от сырья животного и растительного происхождения, биокаталитическая деструкция полимеров микробной биомассы существенно затруднена в связи с наличием в ней клеточной оболочки, основной структурной составляющей которой являются β-глюканы (Feofilova et al., 2006; New et al., 2008; Klishanets et al., 2016). Поэтому для повышения доступности внутриклеточных структур в состав ферментного комплекса должны входить ферменты, катализирующие гидролиз полисахаридов клеточных стенок микроорганизмов (Sereda et al., 2018).

В последнее время все больше внимания уделяется работам по изучению возможности использования остаточной биомассы грибов рода Aspergillus – продуцентов ферментов и органических кислот не как отхода производства, а как перспективного источника белка, аминополисахаридов и биологически активных веществ (Brar et al., 2014; Novinyuk et al., 2016; Abdel-Gawad et al., 2017). Ранее было показано, что при глубинном культивировании гриба Aspergillus oryzae количество синтезируемой биомассы составляет 30–40% от общего объема культуральной жидкости (Rimareva et al., 2018а, 2018b). При этом было установлено, что на долю адсорбируемых на биомассе и клеточно-связанных гидролаз к концу ферментации приходится до 30% от общего показателя синтезируемых ферментов, секретирующих продуцентом в культуральную жидкость. В то же время биомасса мицелиальных грибов по сравнению с дрожжевой содержит в 1.5 раза больше полисахаридов и сложный хитино-глюкановый комплекс, который необходимо разрушить и получить доступ к белковой составляющей клетки.

Цель настоящей работы состояла в разработке условий ферментативной деструкции полисахаридов клеточных стенок и белковых веществ мицелиальной биомассы гриба Aspergillus oryzae – вторичного ресурса ферментного производства, для получения пептидно-аминокислотных ингредиентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнялась на базе ВНИИПБТ – филиала ФГБУН “ФИЦ питания и биотехнологии” в отделе биотехнологии ферментных препаратов, дрожжей, органических кислот и БАД.

Объектом исследований служила биомасса мицелиального гриба A. oryzae RCAM 11034 – продуцента протеолитических ферментов. В работе использовали ферментный препарат (ФП) Глюканофоетидин – источник экзо- и эндо- β-глюканазы, хитиназы, маннаназы и протеазы (Kurbatova et al., 2017). Уровень активности гидролитических ферментов в биомассе гриба и в ФП Глюканофоетидин анализировали по стандартным методикам (Serba et al., 2013).

Биомасса получена в результате глубинного культивирования A. oryzae на питательной среде, в состав которой входила ячменная мука – 4.0%, отруби пшеничные – 1.0% и КН₂РО₄ – 1.5%. Культивирование проводили в лабораторном ферментере RALF Plus (Bioengineering, Швейцария) при коэффициенте заполнения, равном 0.6; скорости вращения мешалки 200–220 об./мин. Условия культивирования гриба: температура – 30°С, расход воздуха – 0.5–1.0 м³/м³/мин; длительность – 48 ч. По окончании ферментации биомассу отделяли на центрифуге ОС-6М при 5000 об./мин в течение 10 мин.

Процесс биокаталитической конверсии внутриклеточных полимеров A. oryzae осуществляли в стационарных условиях в конической колбе объемом 0.5 дм³, в которую помещали 100.0 г полученной мицелиальной биомассы (содержание сухих веществ 10%, рН 5.5) и вводили дополнительный источник β-глюканазы – ФП Глюканофоетидин, при периодическом перемешивании. Ферментолиз проводили в термостате ТС 180 СПУ при температуре 50°С, при необходимости температуру снижали до 30°С. Процесс гидролиза белковых веществ и полисахаридов тестировали по степени накопления аминного азота и редуцирующих веществ в ферментолизатах биомассы (GPA; Polyakov et al., 2007).

Спектральный анализ состава низкомолекулярных пептидов определяли методом ВЭЖХ на квадрупольной масс-спектрометрической системе Agilent 6120 (Artemenko et al., 2006). Содержание аминокислот в микробной биомассе и ферментолизатах определяли на хроматографе Knauer Eurochrom 2000 с последующим детектированием компонентов спектрофотометрическим детектором Smartline UV Detector 2500 (Германия) при λ = 570 нм. Просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца (Roslyakov et al., 1984).

Молекулярно-массовое распределение пептидов в ферментолизатах оценивали методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления (Zorin, Bayarzhargal, 2009) на колонке Супероза 12, 1.0 × 30 см (производства Serva, Германия), предварительно откалиброванной по стандартным глобулярным водорастворимым белкам. В качестве элюента использовали 0.2 М хлористый натрий при скорости элюирования 0.4 см³/мин и длине световой волны 280 нм. Аналитический сигнал регистрировали проточным УФ-детектором УФ132, соединенным с рабочей станцией специализированным интерфейсом. Для обработки результатов измерений использовали программу “Мультихром 3.1”. Хроматограммы интегрировались весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Статистическую обработку данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, осуществляли с помощью программы Microsoft Excel с использованием коэффициента Стьюдента (доверительный интервал 0.95).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования биомассы A. oryzae показали, что в ней содержались внутриклеточные ферменты различного спектра действия. В пересчете на сухие вещества (СВ) грибной биомассы уровень активности ферментов протеолитического действия составил 37.0 ед. протеазной способности (ПС)/г, β-глюканолитического – 12.0 ед. β-глюканазной способности (β-ГкС)/г, хитинолитического – 0.2 ед. хитиназной способности (ХС)/г, маннанолитического – 1.0 ед. маннаназной способности (МС)/г (табл. 1). Остаточная протеолитическая активность в грибной биомассе была достаточно высокая и составляла около 25% от общего уровня активности протеаз в культуральной жидкости. Однако для эффективной конверсии полисахаридов клеточных стенок уровня β-глюканазной активности недостаточно, поэтому требовалось внесение дополнительного количества экзогенных гидролаз.

На первом этапе для гидролиза полисахаридов клеточных стенок гриба в биомассу добавляли ФП Глюканофоетидин – как дополнительный источник β-глюканазы из расчета от 20 до 100 ед. β-ГкС/ 1 г биомассы (табл. 1). Совместно с β-глюканазой дозировались ферменты, присутствующие в глюканофоетидине: протеазы (1.2–6.1 ед. ПС/г СВ биомассы), хитиназа (0.4–2.2 ед. ХС/г) и маннаназа (0.9–4.4 ед. МС/г). Процесс деструкции полимеров грибной биомассы продолжали в течение 18 ч при температуре 50°С.

Как видно из приведенных на рис. 1 и 2 данных, дозировка β-глюканазы, равная 50 ед. β-ГкС/г СВ биомассы, обеспечивала основную деструкцию полимеров клеточных стенок гриба за 5 ч с образованием в ферментолизате 0.77% редуцирующих веществ (РВ) и 103 мг% аминного азота (${\text{NH}}_{2}^{ + }$). При этом концентрация РВ увеличилась в 2.6 раза, а ${\text{NH}}_{2}^{ + }$ – в 5.7 раза по сравнению с исходным уровнем. Дальнейшее увеличение дозировки β-глюканазы не приводило к значительному повышению глубины гидролиза белково-полисахаридных полимеров (рис. 1, 2).

Рис. 1.

Влияние дозировки β-глюканазы (а – автолиз, 20 единиц, 50 единиц, 100 единиц) на образование редуцирующих веществ (%) в зависимости от длительности ферментолиза (ч) грибной биомассы.

Рис. 2.

Влияние дозировки β-глюканазы (а – автолиз, 20 единиц, 50 единиц, 100 единиц) на содержание аминного азота (%) в зависимости от длительности ферментолиза (ч) грибной биомассы.

Таким образом, для разрушения полимеров клеточной оболочки гриба и обеспечения доступа протеаз к белковым веществам выбрана дозировка 50 ед. β-ГкС/г биомассы, которую использовали в дальнейшем.

Результаты исследований уровня остаточной активности ферментов в процессе ферментолиза грибной биомассы показали, что за первые 2 ч гидролиза при 50°С существенных изменений не наблюдалось. Через 5 ч уровень протеолитической активности снизился более, чем в 2 раза, а уровень β-глюканазной активности остался практически без изменений (рис. 3). Поэтому в дальнейшем температуру гидролиза понижали.

Рис. 3.

Уровень остаточной активности протеаз (ед. ПС/г) и β-глюканаз (ед. β-ГкС/г) в ферментолизатах биомассы гриба Aspergillus oryzae в зависимости от длительности гидролиза (ч).

С использованием установленной дозировки экзогенной β-глюканазы (50 ед. β-ГкС/г) и внутриклеточных протеаз (37 ед. ПС/г) осуществлена биокаталитическая конверсия полимеров грибной биомассы (табл. 1). Процесс гидролиза проводили в два этапа: первые 2 ч при температуре 50°С происходило автолитическое расщепление полимеров (автолиз), затем температуру снижали до 30°С и добавляли ФП Глюканофоетидин. Наиболее интенсивное образование продуктов гидролиза белков и полисахаридов отмечено через 6 ч: концентрация растворимых РВ увеличилась в 2.6 раза, ${\text{NH}}_{2}^{ + }$ – в 7.3 раза (рис. 4).

Рис. 4.

Содержание редуцирующих веществ (РВ, %) и аминного азота (NH, %) в ферментолизатах биомассы гриба Aspergillus oryzae в зависимости от длительности гидролиза в ч.

Практически к 12 ч процесс деструкции полимеров заканчивался. При этом концентрация РВ к 12 ч увеличилась незначительно (в 2.7 раза). Более существенно повысилась степень гидролиза белковых веществ: содержание ${\text{NH}}_{2}^{ + }$ увеличивалось в 10.5 раза (с 0.22 до 2.3%). К 18 ч показатели ферментолизата биомассы гриба изменились несущественно (рис. 4).

В результате действия собственной ферментной системы гриба A. oryzae и экзогенных ферментов получены ферментолизаты грибной биомассы с различной степенью деструкции внутриклеточных полимеров: ферментолизат-1 (автолиз – 2 ч, 50°С), ферментолизат-2 (2 ч, 50°С и 4 ч, 30°С) и ферментолизат-3 (2 ч, 50°С и 10 ч, 30°С).

Исследовали изменение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в ферментолизатах после 2 ч гидролиза при температуре 50°С (а); 6 ч (б) и 12 ч (в) при 30°С (рис. 5). Молекулярная масса (ММ) пептидов, содержащихся в ферментолизатах, представлена в широком диапазоне от 272 кДа до 1.6 кДа и ниже. Результаты исследований подтвердили эффективность деструктивных процессов, приводящих к образованию пептидов с более низкой молекулярной массой. В ферментолизате-3 после 12 ч гидролиза отмечено наиболее высокое содержание пептидов с ММ менее 1.6 кДа (рис. 5).

Рис. 5.

Молекулярно-массовое распределение (кД) продуктов конверсии белковых полимеров биомассы гриба Aspergillus oryzae в ферментолизатах после 2 ч при 50°С (а); 6 ч (б) и 12 ч (в) при 30°С.

Результаты расчета показали, что в ферментолизате-1, полученном после 2 ч гидролиза, содержание высокомолекулярных белков с ММ от 272.0 до 14.6 кДа составило 6.3% от общего количества белковых веществ; на долю пептидов с ММ от 14.6 до 4.1 кДа приходилось 32.5%; пептидов с ММ от 4.1 до 1.6 кДа – 28.0%. 33.2% составили пептиды с ММ менее 1.6 кДа (рис. 6).

Рис. 6.

Изменение молекулярной массы пептидов в процессе ферментативной деструкции (время гидролиза 2, 6, 12 ч) белков грибной биомассы (%).

В процессе гидролиза белковых полимеров содержание высокомолекулярных пептидов существенно снижалось. Так, за 6 ч гидролиза доля пептидов с ММ свыше 29.0 кДа снизилась в 2.8 раза, а за 12 ч – в 4.7 раза. При этом содержание низкомолекулярных пептидов с ММ менее 1.6 кДа в процессе деструкции белковых полимеров грибной клетки возрастало и к концу ферментолиза увеличилось в 1.4 раза, что составило 47.9% от общего количества (рис. 6). Таким образом, в составе пептидных фракций ферментолизата-3 после 12 ч гидролиза на долю низкомолекулярных пептидов (НМП) с ММ менее 4.1 кДа приходилось 73.4%, а в ферментолизате-2 – 71.0%.

Как показали результаты анализа молекулярно-массового распределения продуктов конверсии белковых полимеров, ферментолизаты, полученные под действием внутриклеточных и экзогенных ферментов в течение 6 и 12 ч гидролиза, несущественно различались по составу пептидов, особенно с ММ от 29.0 до 1.6 кДа. Однако, проведенные сравнительные исследования спектрального состава НМП и содержания аминокислот (АК) в свободной форме позволили выявить существенные различия этих ферментолизатов.

Анализ спектров пептидов с ММ менее 1000 Да в ферментолизатах грибной биомассы после 6 ч (а) и 12 ч (б) гидролиза и результаты расчета показали, что с увеличением длительности воздействия ферментов повышалась глубина гидролиза белковых веществ (рис. 7). В 12-часовом ферментолизате количество пептидов с ММ менее 500 Да составило 89% от общего количества НМП, а количество пептидов с ММ от 500 до 1000 Да было в 3.9 раза ниже, чем в 6-часовом ферментолизате (рис. 7, табл. 2).

Рис. 7.

Спектральный анализ низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой менее 1000 Да в ферментолизатах грибной биомассы после 5 (а) и 12 (б) ч гидролиза.

Полученные экспериментальные данные по составу и количеству аминокислот в свободной форме, образовавшихся в процессе ферментативного гидролиза, подтвердили результаты спектрального анализа НМП (табл. 2, 3).

Содержание свободных АК в ферментолизате после 12 ч гидролиза в 1.7 раза превысило показатели после 6-ти ч гидролиза и составило 39.4% от общего количества идентифицированных АК в биомассе, из них порядка 53% составили незаменимые аминокислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили разработать условия регулируемого процесса ферментативной деструкции полимеров остаточной биомассы гриба A. oryzae – вторичного сырья ферментного производства. Установлено, что использование ферментативной системы, включающей внутриклеточные протеиназы и пептидазы, катализирующие глубокое разрушение белковых веществ, и комплекс экзогенных ферментов для гидролиза полисахаридов, а также регуляция длительности их воздействия обеспечивают получение ферментолизатов с заданным структурно-фракционным составом.

В результате направленной биокаталитической конверсии белковых веществ микромицета получены пептидно-аминокислотные ингредиенты с превалирующим содержанием низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот. Установлено, что в составе пептидных фракций ферментолизата после 12 ч инкубации 73.4% приходилось на долю НМП с ММ менее 4.1 кДа, из них около 40% составляли свободные аминокислоты. Сравнительный анализ спектров пептидов с ММ менее 1000 Да в ферментолизатах грибной биомассы после 6 и 12 ч гидролиза показал существенные различия в их составе. С увеличением длительности гидролиза содержание пептидов с ММ менее 500 Да и аминокислот в свободной форме повысилось в 1.6 раза, а количество пептидов от 500 до 1000 Да сократилось в 3.9 раза.

Результаты теоретических и экспериментальных исследований подтверждают перспективность создания функциональных ингредиентов и биологически активных добавок, обогащенных пептидно-аминокислотной составляющей с преобладающим содержанием свободных аминокислот и коротких биоактивных пептидов на основе ферментолизатов микробной биомассы.

Исследования проведены за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук (тема № 0529-2019-0066).