Микология и фитопатология, 2020, T. 54, № 2, стр. 107-115
Комплексы микромицетов выщелоченного чернозема при загрязнении нефтью и внесении микроорганизмов-нефтедеструкторов
Г. Ф. Рафикова 1, *, Е. В. Кузина 1, **, Е. А. Столярова 1, ***, С. Р. Мухаматдьярова 1, ****, О. Н. Логинов 1, *****
1 Уфимский федеральный исследовательский центр РАН
450054 Уфа, Россия
* E-mail: rgf07@mail.ru
** E-mail: misshalen@mail.ru
*** E-mail: sto15@yandex.ru
**** E-mail: svetrm@gmail.com
***** E-mail: biolab316@yandex.ru
Поступила в редакцию 20.05.2019
После доработки 02.12.2019
Принята к публикации 20.12.2019
Аннотация
Изучено влияние углеводородокисляющих бактерий на комплексы микроскопических грибов нефтезагрязненного выщелоченного чернозема. Показано, что внесение микроорганизмов-нефтедеструкторов способствовало увеличению видового разнообразия микромицетов нефтезагрязненной почвы при сохранении типичных видов, характерных для фоновой (незагрязненной) почвы. Совместное воздействие нефти и засоления значительно изменяло видовой состав микромицетов и приводило к формированию более специфичного комплекса – элиминировались виды, доминировавшие ранее в фоновой почве, и увеличивалась частота встречаемости видов, вероятно более толерантных к засолению. При этом внесение галотолерантных штаммов углеводородокисляющих бактерий не смогло привести к восстановлению исходного состава почвенной микобиоты. Для рекультивации нефтезагрязненного выщелоченного чернозема наиболее эффективными показали себя композиции углеводородокисляющих бактерий: композиция 1, состоящая из Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1, Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2, Pseudomonas sp. ИБ-1.1, Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 и композиция 3, состоящая из Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1, Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2, Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7. Микробные композиции обладали комплексом полезных для рекультивации нефтезагрязненной почвы свойств: высокой углеводородокисляющей активностью, способностью к поддержанию плотности своей популяции длительный период, снижению фитотоксичности почвы и восстановлению исходного видового состава грибов, присущего для незагрязненной почвы.
ВВЕДЕНИЕ
Загрязнение почвенного покрова нефтью и нефтепродуктами в результате аварийных разливов, несомненно, остается одной из актуальных проблем в регионах с высокой долей нефтедобычи и нефтепереработки. Нефть, попадая в почву, приводит не только к ухудшению ее водного режима и физико-химических свойств, но и к изменению почвенного микробоценоза, тем самым оказывая влияние на процессы трансформации веществ в почве.
Для очистки почвы от нефти используют различные приемы, среди которых одним из наиболее эффективных и экологически безопасных способов считается использование микроорганизмов-нефтедеструкторов. Поскольку одновременно с нефтезагрязнением зачастую происходит засоление грунта в результате утечек высокоминерализованных промысловых вод, немаловажным является использование в таких условиях галотолерантных углеводородокисляющих микроорганизмов (Borzenkov et al., 2006; Kumar et al., 2008; Plotnikova et al., 2011; Varjania et al., 2015).
О глубине происходящих в нефтезагрязненной и рекультивируемой почве микробных перестроек можно судить по таким количественным и качественным показателям как численность и видовой состав почвенных микроорганизмов, величина микробной биомассы, структура микробного сообщества, ферментативная активность почвы и др.
Одним из основных компонентов почвенного микробоценоза являются микроскопические грибы. Они быстро и чутко реагируют на изменения в почве, происходящие под воздействием абиотических и биотических факторов и могут служить для оценки стабильности почвенной экосистемы (Mitsevich et al., 2000; Marfenina 2005; Djukic, 2006; Terekhova et al., 2017) и скорости протекания восстановительных процессов.
Ранее в наших исследованиях (Kireeva et al., 2008, 2009) было показано, что внесение в нефтезагрязненную почву микробных препаратов “Ленойл” и “Азолен”, наряду с усилением деструкции нефти приводило к увеличению видового разнообразия грибов и снижению доли фитотоксичных видов микромицетов.
Однако характер изменений структуры почвенной микобиоты при загрязнении нефтью и биорекультивации может различаться в зависимости от природы применяемого биопрепарата.
Целью данной работы была оценка влияния микроорганизмов-нефтедеструкторов (в том числе галотолерантных) на динамику численности и видовой состав микроскопических грибов нефтезагрязненного выщелоченного чернозема.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили в условиях модельного эксперимента с выщелоченным черноземом (Nобщ. – 0.61%, гумус – 10.46%). Для этого воздушно-сухую почву массой 3 кг помещали в вегетационные сосуды и увлажняли до 60% от полной влагоемкости. Для оптимизации водно-воздушного режима почвы использовали дренаж, в течение опыта поддерживали влажность почвы и проводили ее регулярное рыхление. В опытные варианты вносили нефть (плотность 852 кг/м3, вязкость 28 мПа × с) в концентрации 5% от веса почвы и 50 мл жидкой культуры углеводородокисляющих бактерий (УОБ) с титром 2–4 × 108 КОЕ/мл. Количество вносимой культуры УОБ было подобрано таким образом, чтобы оно превышало титр аборигенной углеводородокисляющей микробиоты для обеспечения конкурентоспособности бактерий-интродуцентов.
Для обработки почвы использовали штаммы УОБ из коллекции микроорганизмов Уфимского Института биологии УФИЦ РАН и ООО “Биохим-Реагент”. В опыте использовали отдельные культуры галотолерантных УОБ [Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 (ВКМ B-3229D), Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 (ВКПМ Y-4382), Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3 (ВКМ B-3230D)], а также композиции УОБ: композиция 1 [Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 (VKM B-2753D), Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 (VKM В-2754D), Pseudomonas sp. ИБ-1.1 (ВКМ В-28361D), Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2], композиция 2 [Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 (VKM B-2753D)], Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 (VKM В-2754D), Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2], композиция 3 [Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 (VKM B-2753D), Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 (VKM В-2754D), Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 (ВКМ B-3229D)], композиция 4 [Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 (VKM B-2753D), Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 (VKM В-2754D), Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3], композиция 5 [Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 (VKM B-2753D), Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 (VKM В-2754D)].
Микроорганизмы, входящие в состав композиций, не обладали антагонизмом по отношению друг к другу. Для обработки почвы использовали жидкую культуру УОБ. Бактерии культивировали в колбах Эрленмейера (250 мл) со 100 мл среды на качалке при 180 об./мин и температуре 28оС в течение 72 ч на следующих средах: Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7, Pseudomonas sp. ИБ-1.1 – на среде Кинг Б (Netrusov, 2005), Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1, Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 – на среде Раймонда с дизельным топливом в качестве источника углерода (Raymond, 1961), Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 и Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3 – на МПА (Netrusov, 2005). Для создания микробных композиций штаммы УОБ смешивали в одинаковых соотношениях.
В часть опытных образцов, помимо нефти и жидкой культуры УОБ, вводили водный раствор NaCl до конечной концентрации 5%. Контролем служила загрязненная нефтью (5%) почва, куда вносили 50 мл стерильной воды. Образцы анализировали через 30 и 60 суток. Повторность опыта 3-кратная.
Выделение и количественный учет микроорганизмов проводили по общепринятой методике посева почвенной суспензии на питательные агаризованные среды: УОБ – на среду Раймонда с дизельным топливом, микромицетов – на подкисленную среду Чапека (pH = 4.5) (Zvyagintsev, 1991).
Идентификацию видов микромицетов проводили по культурально-морфологическим признакам с использованием определителей (Raper, Fennel, 1965; Raper, Thom, 1968; Litvinov, 1967; Pidoplichko, 1972; Milko, 1974; Ramirez, 1982; Egorova, 1986; Bilay, 1988; Bilay, Kurbatskaya, 1990; Watanabe, 2000). Видовые названия грибов уточняли по номенклатурной базе Index Fungorum (2019). Для установления доминантных видов использовали показатель обилия вида. Обилие рассчитывали как число диаспор данного вида, выраженное в процентах от общего количества диаспор.
Содержание остаточных углеводородов в почве до и после биоремедиации определяли горячей экстракцией метиленхлоридом (McGill, 1980). Фитотоксичность почвы оценивали методом почвенных пластинок по степени ингибирования прорастания семян редиса (Raphanus sativum) сорта Розово-красный с белым кончиком (Zvyagintsev, 1991).
Статистическую обработку данных проводили по стандартным программам MS Excel и Statistica. На рисунках и в таблицах данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Одним из показателей, позволяющим судить о потенциальной эффективности привнесенной популяции УОБ, является приживаемость интродуцированных микроорганизмов, т.е. способность бактерий к размножению и сохранению высокой численности в течение длительного времени в конкретных условиях. Изучение динамики численности УОБ в почве показало, что все внесенные штаммы микроорганизмов смогли адаптироваться к условиям нефтяного загрязнения и их численность оставалась на относительно высоком уровне в течение всего эксперимента (табл. 1). Наибольшая плотность популяции УОБ наблюдалась в первые 30 суток после постановки эксперимента. Уровень разложения углеводородов в почве коррелировал с численностью УОБ (коэффициент корреляции составляет 0.85, p > 99%). Так, максимальных значений степень деструкции углеводородного субстрата достигала в вариантах с внесением композиций 1, 3, 4, 5 и составляла 32–44% к концу опыта (через 60 суток) против 11.7% в контроле. При использовании для ремедиации почвы отдельных штаммов УОБ величина биодеструкции углеводородов была ниже, чем при применении композиций. Следует отметить, что в вариантах опыта с засолением, где для разложения нефти использовали галотолерантные штаммы Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2, Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3, численность УОБ была на 1–2 порядка ниже, чем в вариантах без засоления. Наибольшую нефтедеструкционную активность в условиях засоления показал штамм P. hunanensis BCHR-IB-C7 – степень утилизации углеводородов составила 18%.
Таблица 1.
Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов, степень биодеградации углеводородов и изменение pH в выщелоченном черноземе в процессе ремедиации
| Варианты | Численность УОБ, ×105 КОЕ/г | Биодеградация углеводородов, % | pHводн. | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 3-е суток | 30 суток | 60 суток | 30 суток | 60 суток | 3-е суток | 30 суток | 60 суток | |
| Контроль (незагрязненная почва) | 10.0 ± 0.5 | 35.0 ± 1.65 | 7.0 ± 0.31 | 6.37 | 6.37 | 6.38 | ||
| НФ (нефтезагрязненная почва) | 20.0 ± 0.9 | 230.0 ± 11.0 | 50.0 ± 2.3 | 9.2 | 11.8 | 6.72 | 7.14 | 6.2 |
| НФ + NaCl + Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 | 1.6 ± 0.08 | 0.6 ± 0.02 | 0.1 ± 0.005 | 9.8 | 12.0 | 6.33 | 7.03 | 5.8 |
| НФ + Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 | 260.0 ± 12.0 | 900.0 ± 42.0 | 120.0 ± 5.8 | 18.0 | 24.0 | 6.27 | 7.4 | 6.17 |
| НФ + NaCl + Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 | 1.0 ± 0.04 | 2.0 ± 0.08 | 1.0 ± 0.04 | 14.0 | 18.0 | 6.25 | 7.2 | 6.0 |
| НФ + Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 | 500.0 ± 25.5 | 3000.0 ± 135.0 | 20.0 ± 0.9 | 18.0 | 22.0 | 6.61 | 7.15 | 6.23 |
| НФ + NaCl + Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3 | 10.0 ± 0.5* | 180.0 ± 8.3 | 1.0 ± 0.04 | 8.0 | 12.2 | 6.60 | 7.8 | 6.05 |
| НФ + Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3 | 26.0 ± 1.4 | 400.0 ± 18.5 | 50.0 ± 2.4 | 17.2 | 23.8 | 6.99 | 7.46 | 6.29 |
| НФ + композиция 1 | 1000.0 ± 45.0 | 510.0 ± 24.0 | 300.0 ± 15.2 | 38.0 | 44.0 | 6.67 | 7.1 | 6.14 |
| НФ + композиция 2 | 40.0 ± 1.8 | 500.0 ± 23.0 | 150.0 ± 7.0 | 16.0 | 24.0 | 6.48 | 7.2 | 6.21 |
| НФ + композиция 3 | 1000.0 ± 0.5 | 480.0 ± 24.0 | 170.0 ± 8.2 | 31.6 | 42.0 | 6.83 | 7.3 | 6.26 |
| НФ + композиция 4 | 320.0 ± 14.5 | 550.0 ± 27.0 | 140.0 ± 6.7 | 28.0 | 40.0 | 6.70 | 7.48 | 6.37 |
| НФ + композиция 5 | 200.0 ± 12.0 | 540.0 ± 24.6 | 100.0 ± 5.5 | 24.0 | 32.0 | 7.32 | 7.55 | 6.48 |
Под воздействием нефтяного загрязнения во всех почвенных образцах отмечалось изменение кислотно-основных свойств почвы. В целом, загрязнение почвы товарной нефтью (обезвоженной и обессоленной) не вызывало резкого изменения кислотности почвы (табл. 1). На первом этапе эксперимента (первые 30 суток) наблюдалось увеличение pH почвы, что согласуется с данными о том, что при нефтяном загрязнении слабокислых почв происходит ее подщелачивание (Voevodina et al., 2015). Наиболее заметные изменения кислотности почвы прослеживались в опытных вариантах с внесением NaCl, что связано с перестройкой почвенно-поглощающего комплекса, в частности, вытеснением ионами натрия обменных катионов кальция и магния. На втором этапе эксперимента отмечалось подкисление почвы в результате разложения углеводородного субстрата с образованием промежуточных продуктов разложения.
Загрязнение выщелоченного чернозема нефтью стимулировало развитие грибов (табл. 2), что, вероятно, связано с тем, что углеводороды нефти в умеренной концентрации (5%) не оказывают столь выраженного токсического эффекта и используются данной группой микроорганизмов в качестве субстрата. Использование УОБ для биоремедиации способствовало незначительному уменьшению этого показателя по сравнению с контролем, очевидно, за счет ускоренного разложения углеводородов нефти в почве и быстрого исчерпания источника углерода и энергии, доступного для микромицетов. Через 60 суток после постановки эксперимента в некоторых опытных вариантах наблюдалось незначительное увеличение доли грибов, возможно за счет использования ими в качестве субстрата погибших клеток УОБ. В целом, в течение эксперимента в вариантах с внесением УОБ не было отмечено резкого колебания численности микроскопических грибов.
Таблица 2.
Динамика численности микромицетов в выщелоченном черноземе при загрязнении нефтью и внесении микроорганизмов-нефтедеструкторов, 105 КОЕ/г
| Варианты | Сроки отбора образцов | |
|---|---|---|
| 30 суток | 60 суток | |
| Контроль | 1.5 ± 0.06 | 1.2 ± 0.06 |
| НФ (нефтезагрязненная почва) | 5.0 ± 0.21 | 2.5 ± 0.10 |
| НФ + NaCl + Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 | 0.7 ± 0.03 | 0.3 ± 0.01 |
| НФ + Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 | 2.1 ± 0.10 | 2.0 ± 0.1 |
| НФ + NaCl + Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 | 2.2 ± 0.11 | 0.6 ± 0.04 |
| НФ + Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 | 2.0 ± 0.11 | 2.5 ± 0.12 |
| НФ + NaCl + Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3 | 0.3 ± 0.01 | 0.4 ± 0.02 |
| НФ + Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3 | 0.6 ± 0.02 | 1.6 ± 0.07 |
| НФ + композиция 1 | 2.0 ± 0.10 | 2.5 ± 0.12 |
| НФ + композиция 2 | 2.5 ± 0.11 | 1.5 ± 0.07 |
| НФ + композиция 3 | 3.0 ± 0.13 | 2.8 ± 0.12 |
| НФ + композиция 4 | 4.2 ± 0.18 | 3.2 ± 0.15 |
| НФ + композиция 5 | 4.0 ± 0.18 | 1.0 ± 0.05 |
Из исследованных образцов выщелоченного чернозема было выделено 16 видов микромицетов, относящихся к родам Aspergillus, Microdochium, Mucor, Penicillium, Talaromyces, Trichoderma (табл. 3). Вероятно, основной причиной получения такого списка грибов явилось то, что методы посева позволяли выявить только культивируемую часть микобиоты. В выщелоченном черноземе преобладали грибы из родов Aspergillus и Penicillium. В незагрязненной почве и опытных вариантах доминировал, главным образом, вид Penicillium glabrum.
Таблица 3.
Видовой состав и структура комплексов микромицетов нефтезагрязненного выщелоченного чернозема после двухмесячной биоремедиации после двухмесячной экспозиции
| Виды микромицетов | Варианты | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Конт-роль | НФ | НФ + + NaCl + + Y. lipo-lytica | НФ + Y. lipolytica | НФ + NaCl + + P. hunanensis | НФ + + P. hu-nanensis | НФ + + NaCl + + Man-grovi-bacter sp. | НФ + + Man-grovi-bacter sp. | НФ + + ком-пози-ция 1 | НФ + + ком-пози-ция 2 | НФ + + ко-пози-ция 3 | НФ + + ком-пози-ция 4 | НФ + + ком-пози-ция 5 | |
| Aspergillus fumigatus Fresen. | – | С | – | – | – | – | – | – | ТР | – | – | – | – |
| A. nidulans (Eidam) G. Winter | – | – | – | С | – | – | – | – | – | – | ТР | – | – |
| A. ochraceus G. Wilh. | – | – | – | – | – | – | – | – | ТР | – | – | – | – |
| A. wentii Wehmer | – | – | – | – | – | – | – | – | – | ТР | – | – | – |
| Microdochium nivale (Fr.) Samuels et I.C. Hallett | – | – | – | С | – | – | – | – | – | ТР | – | – | – |
| Mucor hiemalis Wehmer | С | – | – | – | ТР | – | – | ТР | – | – | – | – | С |
| Penicillium expansum Link | – | – | – | – | ТД | – | – | – | – | – | – | – | – |
| P. glabrum (Wehmer) Westling | ТД | ТД | – | ТД | – | ТД | – | – | ТД | ТД | ТЧ | ТД | ТД |
| P. lignorum Stolk | ТР | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| P. lanosum Westling | – | С | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| P. decumbens Thom | – | – | ТР | – | – | – | ТД | – | – | – | – | – | – |
| P. simplicissimum (Oudem.) Thom | ТР | С | – | ТР | ТР | ТР | – | ТР | ТР | – | ТР | – | – |
| P. velutinum J.F.H. Beyma | ТР | – | ТД | ТР | – | – | – | ТД | ТР | – | ТР | ТР | – |
| Talaromyces variabilis (Sopp) Samson, N. Yilmaz, Frisvad et Seifert | – | С | ТР | – | – | – | ТР | ТР | – | – | – | – | С |
| T. verruculosus (Peyronel) Samson, N. Yilmaz, Frisvad et Seifert | ТР | – | – | – | – | ТР | – | – | – | ТР | – | – | – |
| Trichoderma viride Pers. | ТР | С | ТР | С | ТР | – | ТР | ТР | – | ТР | – | ТР | С |
| Н | 2.19 | 0.92 | 1.68 | 1.69 | 1.08 | 0.82 | 1.25 | 2.08 | 1.77 | 1.16 | 1.91 | 1.08 | 0.77 |
Внесение нефти в выщелоченный чернозем приводило к появлению таких видов как Aspergillus fumigatus, Penicillium lanosum и Talaromyces variabilis, не присутствовавших ранее в незагрязненной фоновой почве. Загрязнение почвы нефтью обусловило изменение структуры комплекса микромицетов за счет перехода большинства типичных видов в ранг случайных. Аналогичные тенденции были отмечены и другими исследователями при изучении воздействия загрязнения выбросами предприятий цветной металлургии на комплексы почвенных микромицетов (Evdokimova et al., 2007; Evdokimova et al., 2013). При обработке почвы жидкой культурой микроорганизмов-нефтедеструкторов в целом наблюдалось увеличение видового разнообразия грибов при сохранении типичных видов, характерных для фоновой почвы.
Совместное воздействие нефти и засоления значительно изменяло видовой состав микромицетов и приводило к формированию более специфичного комплекса. В загрязненных почвенных образцах, обработанных культурами галотолерантных УОБ, и с дополнительным внесением NaCl элиминировался вид Penicillium glabrum, очевидно, в силу его чувствительности к повышенной концентрации соли. При этом доминирующее положение занимали другие виды, вероятно, более толерантные к засолению – P. expansum, P. decumbens, P. velutinum, что согласуется с данными других исследователей, выделявших некоторые из этих видов из мест природного засоления (Gunde-Cimerman et al., 2004, 2005; Smolyanuk, Bilanenko, 2011). В целом, в данных вариантах эксперимента отмечалась тенденция снижения числа видов и изменения видового разнообразия почвенных микромицетов.
В результате кластерного анализа, проведенного по показателю видового сходства, было получено распределение микромицетов по двум группам в нефтезагрязненной почве при внесении УОБ в качестве рекультивирующего агента (рис. 1). Первую группу составили, главным образом, все варианты эксперимента с внесением NaCl. Это позволяет говорить о том, что наибольшее влияние на почвенную микобиоту оказывало засоление на фоне нефтяного загрязнения. При этом внесение галотолерантных штаммов УОБ не смогло привести к восстановлению исходного состава почвенной микобиоты.
Рис. 1.
Сходство видового состава комплексов микромицетов различных вариантов эксперимента с контролем (Евклидово расстояние, метод Варда). По оси абсцисс – варианты эксперимента; НФ – нефтезагрязненная почва.
Во вторую группу вошли опытные варианты, более сходные с контролем по видовому составу микромицетов. Внесение в нефтезагрязненную почву тех же штаммов бактерий-нефтедеструкторов, что и в засоленные почвенные образцы, приводило к формированию микобиоты более сходной с таковой контрольного варианта.
Максимальное сходство с микобиотой контроля обнаруживалось в вариантах с применением композиции 3 и композиции 1 – они составляли отдельный кластер с незагрязненной почвой.
Одним из важных показателей, характеризующих качество почвы, является ее токсичность по отношению к высшим растениям. Поскольку редис является среднеустойчивым к обменному натрию в среде, то повышенные концентрации NaСl в почве были губительными для данного тест-растения – всхожесть в вариантах с засолением отсутствовала. Загрязнение выщелоченного чернозема нефтью приводило к возрастанию ее фитотоксичности (табл. 4). Токсическое воздействие нефтяного загрязнения на семена редиса снижалось на протяжении эксперимента, однако, не достигало значений контроля.
Таблица 4.
Влияние микроорганизмов-нефтедеструкторов на фитотоксичность выщелоченного чернозема, загрязненного нефтью
| Варианты | Энергия прорастания, % | Всхожесть, % | ||
|---|---|---|---|---|
| 30 суток | 60 суток | 30 суток | 60 суток | |
| Контроль | 77.5 ± 3.6 | 80.0 ± 3.8 | 85.0 ± 4.1 | 85.0 ± 4.0 |
| НФ (нефтезагрязненная почва) | 60.0 ± 2.5 | 65.0 ± 3.1 | 67.5 ± 3.2 | 75.0 ± 3.6 |
| НФ + Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2 | 65.0 ± 3.1 | 70.0 ± 3.0 | 75.0 ± 3.7 | 80.0 ± 3.7* |
| НФ + Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 | 60.0 ± 2.7 | 67.5 ± 3.2 | 75.0 ± 3.8 | 80.0 ± 3.9* |
| НФ + Mangrovibacter sp. BCHR-IB-L3 | 70.0 ± 3.2 | 77.5 ± 3.5* | 75.0 ± 3.7 | 85.0 ± 4.2* |
| НФ + композиция 1 | 70.0 ± 3.1 | 70.0 ± 3.2 | 80.0 ± 3.8* | 85.0 ± 4.2* |
| НФ + композиция 2 | 75.0 ± 3.5* | 80.0 ± 3.6* | 85.0 ± 4.1* | 90.0 ± 4.1* |
| НФ + композиция 3 | 80.0 ± 3.6* | 80.0 ± 3.4* | 85.0 ± 4.0* | 90.0 ± 4.3* |
| НФ + композиция 4 | 80.0 ± 3.2* | 80.0 ± 3.5* | 87.5 ± 4.3* | 90.0 ± 4.0* |
| НФ + композиция 5 | 75.0 ± 3.4* | 75.0 ± 3.2* | 80.0 ± 3.7* | 85.0 ± 4.1* |
Использование для биоремедиации штаммов микроорганизмов заметно снижало фитотоксичность почвы. Через 60 суток практически во всех опытных вариантах с внесением жидкой культуры углеводородокисляющих бактерий значения энергии прорастания и всхожести семян тест-растения были сопоставимы и даже превышали значения контроля. Это может быть связано как со снижением токсического эффекта нефти на растения, вследствие ее ускоренного разложения, так и с возможной продукцией микроорганизмами-нефтедеструкторами биологически активных веществ, стимулирующих рост и развитие растений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нефтяное загрязнение совместно с засолением оказывало большее влияние на видовой состав грибов выщелоченного чернозема, чем внесение в почву только нефти. В обработанных УОБ вариантах с засолением на фоне загрязнения формировался более специфичный комплекс микромицетов, основу которого составляли галотолерантные виды, устойчивые одновременно и к умеренным концентрациям нефти в среде. Применение углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов для рекультивации почвы, подверженной воздействию нефти, изменяло структуру почвенной микобиоты при незначительном влиянии на численность грибов. Внесение УОБ в нефтезагрязненную почву приводило к увеличению видового разнообразия комплексов микромицетов при сохранении типичных видов, характерных для фоновой почвы, ускоренному разложению углеводородов нефти и снижению фитотоксичности. Применение композиции 1 и композиции 3 для рекультивации нефтезагрязненного выщелоченного чернозема, наряду с перечисленными положительными эффектами, способствовало формированию комплексов микромицетов сходных с фоновыми. Композиция 1, состоящая из микроорганизмов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1, Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2, Pseudomonas sp. ИБ-1.1, Yarrowia lipolytica BCHR-IB-U2, и композиция 3, в состав которой входят штаммы бактерий Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1, Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2, P. hunanensis BCHR-IB-C7, могут быть успешно использованы в качестве основы биопрепарата-нефтедеструктора.
Работа выполнена в рамках ГЗ УФИЦ РАН (№ 075-00326-19-00) по теме № AAAA-A18-118022190100-9 на базе Уфимского Института биологии УФИЦ РАН.
Список литературы
Bilay V.I., Koval E.Z. Aspergilli. Kiev, Naukova dumka, 1988. (in Russ.).
Bilay V.I., Kurbatskaya Z.A. Key-book to toxin-prodicung micromycetes. Kiev, Naukova dumka, 1990 (in Russ.).
Borzenkov I.A., Milekhina E.I., Gotoeva M.T., Rozanova E.P., Belyaev S.S. The properties of hydrocarbon-oxidizing bacteria isolated from the oilfields of Tatarstan, western Siberia, and Vietnam. Microbiology. 2006. V. 75 (1). P. 66–72. https://doi.org/10.1134/S0026261706010127
Djukic D., Mandic L. Microorganisms as indicators of soil pollution with heavy metals. Acta Agriculturae Serbica. 2006. V. 11 (22). P. 45–55.
Egorova L.N. Soil fungi of the Far East: Hyphomycetes. Leningrad, Nauka, 1986 (in Russ.).
Evdokimova G.A., Korneykova M.V., Lebedeva E.V. Micromycetes communities in soils of the area affected by aluminium plant. Mikologiya i fitopatologiya. 2007. V. 41 (1). P. 20–28 (in Russ.).
Evdokimova G.A., Korneykova M.V., Lebedeva E.V. Complexes of potentially pathogenic microscopic fungi in anthropogenic polluted soils. J. Environm. Sci. Health. Pt A. 2013. V. 48 (7). P. 746–752. https://doi.org/10.1080/10934529.2013.744615
Evdokimova G.A., Korneykova M.V., Mozgova N.P. Changes in the properties of soils and soil biota in the impact zone of the aerotechnogenic emissions from the Kandalaksha aluminum smelter. Eurasian soil science. 2013. V. 46 (10). P. 1042–1048. https://doi.org/10.7868/S0032180X13100031
Gunde-Cimerman N., Frisvad J.C., Zalar P., Plemenitas A. Halotolerant and halophilic fungi. Biodiversity of fungi: their role in human life. New Delhi, Oxford et IBH Publishing Co. Pvt. Ltd, 2005. P. 69–127.
Gunde-Cimerman N., Zalar P., Plemenitas A., de Hoog G.S. Fungi in the salterns. Halophilic microorganisms. Heidelberg, Springer-Verlag, 2004. P. 103–113.
Index Fungorum, CABI Bioscience Databases. http://www.indexfungorum.org. Accessed 22.11.2019.
Kireeva N.A., Rafikova G.F., Grigoriadi A.S., Galimzyanova N.F., Loginov O.N. Influence of the biological product Azolen on the micromycetes complex of oil-polluted gray forest soil. Mikologiya i fitopatologiya. 2009. V. 43 (2). P. 142–150 (in Russ.).
Kireeva N.A., Rafikova G.F., Galimzyanova N.F., Loginov O.N., Kabirov T.R. The complex of micromycetes of oil-polluted leached chernozem during the recultivation of the biological product “Lenoil”. Mikologiya i fitopatologiya. 2008. V. 42 (1). P. 57–63 (in Russ.).
Kumar M., Leon V., De Sisto Materano A., Ilzins O.A., Luis L. Biosurfactant production and hydrocarbon-degradation by halotolerant and thermotolerant Pseudomonas sp. World J. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 24 (7). P. 1047–1057. https://doi.org/10.1007/s11274-007-9574-5
Litvinov M.A. A guide to microscopic fungi. Leningrad, Nauka, 1967 (in Russ.).
Marfenina O.E. Anthropogenic ecology of soil fungi. Moscow, 2005 (in Russ.).
McGill W.B. Determination of oil content of oil contaminated soil. Sci. Tot. Environ. 1980. V. 14 (3). P. 245–253.
Milko A.A. Key to mucoralen fungi. Kiev, Naukova dumka, 1974 (in Russ.).
Mitsevich E.V., Mitsevich I.P., Perelygin V.V., Lan’Do Ngok, Hoai Nguen Thu. Microorganisms as possible indicators of general soil pollution by dioxin-containing defoliants. Appl. Biochem. Microbiol. 2000. V. 36 (6). P. 582–588.
Netrusov A.I. Workshop on microbiology. Moscow, Academia, 2005 (in Russ.).
Plotnikova E.G., Yastrebova O.V., Ananyina L.N., Dorofeeva L.V., Lysanskaya V.Ya., Demakov V.A. Halotolerant bacteria of the genus Arthrobacter degrading polycyclic aromatic hydrocarbons. Ecologiya. 2011. N 6. P. 502–509 (in Russ.).
Pidoplichko N.M. Penicillia (Keys to species identification). Kiev, Naukova dumka, 1972 (in Russ.).
Ramirez C. Manual and atlas of the Penicillia. Amsterdam–N.Y.–Oxford, Elsevier Biomedical Press, 1982.
Raper B., Fennell D.I. The genus Aspergillus. Baltimore, The Williams and Wilkins Co, 1965.
Raper B., Thom C. A manual of Penicillia. N.Y.–London, Hafner Publishing Company, 1968.
Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons. Develop. Industr. Microbiol. 1961. V. 2 (1). P. 23–32.
Smolyanuk E.V., Bilanenko E.N. Halotolerant micromycetes communities from natural salinization sites. Mikologiya i fitopatologiya. 2011. V. 45 (5). P. 418–426 (in Russ.).
Terekhova V.A., Shitikov V.K., Ivanova A.E., Kydralieva K.A. Assessment of the environmental risk of industrial pollution of the soil based on the statistical distribution of the occurrence of micromycetes. Ecologiya. 2017. № 5. P. 339–346. (in Russ.).https://doi.org/10.7868/S0367059717050031
Varjania S.J., Rana D.P., Jain A.K., Bateja S., Upsani V.N. Synergistic ex-situ biodegradation of crude oil by halotolerant bacterial consortium of indigenous strains isolated from on shore sites of Gujarat, India. Int. Biodeter. Biodegrad. 2015. V. 103. P. 116–124. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2015.03.030
Voevodina T.S., Rusanov A.M., Vasilchenko A.V. The effect of oil on the chemical properties of chernozem ordinary Southern Cis-Urals. Vestnik OGU. 2015. V. 10 (185). P. 157–161 (in Russ.).
Watanabe T. Pictorial atlas of soil and seed fungi: Morphologies of cultured fungi and key to spesies. Boca Raton, CRC Press, 2000.
Zvyagintsev D.G. (ed.) Methods of soil microbiology and biochemistry. Moscow, 1991 (in Russ.).
Билай В.И., Коваль Э.З. (Bilay, Koval) Аспергиллы. Киев: Наук. думка, 1988. 204 с.
Билай В.И., Курбацкая З.А. (Bilay, Kurbatskaya) Определитель токсинобразующих микромицетов. Киев: Наук. думка, 1990. 234 с.
Борзенков И.А., Милехина Е.И., Готоева М.Т., Розанова Е.П., Беляев С.С. (Borzenkov et al.) Свойства углеводородокисляющих бактерий, изолированных из нефтяных месторождений Татарстана, Западной Сибири и Вьетнама // Микробиология. 2006. Т. 75. № 1. С. 82–89.
Воеводина Т.С., Русанов А.М., Васильченко А.В. (Voevodina et al.) Влияние нефти на химические свойства чернозема обыкновенного Южного Предуралья // Вестник ОГУ. 2015. № 10 (185). С. 157–161.
Егорова Л.Н. (Egorova) Почвенные грибы Дальнего Востока: Гифомицеты. Л.: Наука, 1986. 191 с.
Евдокимова Г.А., Корнейкова М.В., Лебедева Е.В. (Evdokimova et al.) Сообщества микромицетов в почвах в зоне воздействия алюминиевого завода // Микология и фитопатология. 2007. Т. 41. № 1. С. 20–28.
Евдокимова Г.А., Корнейкова М.В., Мозгова Н.П. (Evdokimova et al.) Изменения свойств почв и почвенной биоты в зоне воздействия аэротехногенных выбросов Кандалакшского алюминиевого завода // Почвоведение. 2013. № 10. С. 1274–1280.
Звягинцев Д.Г. (ред.) (Zvyagintsev) Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: МГУ, 1991. 304 с.
Киреева Н.А., Рафикова Г.Ф., Григориади А.С., Галимзянова Н.Ф., Логинов О.Н. (Kireeva et al.) Влияние биопрепарата Азолен на комплекс микромицетов нефтезагрязненной серой лесной почвы // Микология и фитопатология. 2009. Т. 43. № 2. С. 142–150.
Киреева Н.А., Рафикова Г.Ф., Галимзянова Н.Ф., Логинов О.Н., Кабиров Т.Р. (Kireeva et al.) Комплекс микромицетов нефтезагрязненного чернозема выщелоченного при рекультивации биопрепаратом “Ленойл” // Микология и фитопатология. 2008. Т. 42. № 1. С. 142–150.
Марфенина О.Е. (Marfenina) Антропогенная экология почвенных грибов. М.: Медицина для всех, 2005. 196 с.
Литвинов М.А. (Litvinov) Определитель микроскопических грибов. Л., 1967. 303 с.
Милько А.А. (Milko) Определитель мукоральных грибов. Киев: Наук. думка, 1974. 302 с.
Нетрусов А.И. (Netrusov) Практикум по микробиологии. М., 2005. 608 с.
Пидопличко Н.М. (Pidoplichko) Пенициллы (Ключи для определения видов). Киев: Наук. думка, 1972. 220 с.
Плотникова Е.Г., Ястребова О.В., Ананьина Л.Н., Дорофеева Л.В., Лысанская В.Я., Демаков В.А. (Plotnikova et al.) Галотолерантные бактерии рода Arthrobacter – деструкторы полициклических ароматических углеводородов // Экология. 2011. № 6. С. 459–466.
Смолянюк Е.В., Биланенко Е.Н. (Smolyanuk, Bilanenko) Сообщества галотолерантных микромицетов из мест природного засоления // Микология и фитопатология. 2011. Т. 45. № 5. С. 418–426.
Терехова В.А., Шитиков В.К., Иванова А.Е., Кыдралиева К.А. (Terekhova et al.) Оценка экологического риска техногенного загрязнения почвы на основе статистического распределения встречаемости видов микромицетов // Экология. 2017. № 5. С. 339–346. https://doi.org/10.7868/S0367059717050031
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Микология и фитопатология
Пн.-пт.: 10.00-19.00