Микология и фитопатология, 2020, T. 54, № 3, стр. 206-213

ВВЕДЕНИЕ

Фибринолиз как процесс растворения тромбов предотвращает закупорку кровеносных сосудов сгустками фибрина и является важной защитной реакцией организма. Тромболитические препараты-протеиназы, высокочувствительные к компонентам тромба и расщепляющие его структуру, по-прежнему остаются востребованными патогенетическими средствами лечения сердечно-сосудистых заболеваний и их тромботических осложнений. Среди имеющихся средств все большее внимание привлекают микробные фибринолитические ферменты как наиболее перспективные (Kotb, 2013; Ali et al., 2014; Krishnamurthy et al., 2018).

Продуцентами фибринолитических ферментов являются бактерии рода Bacillus, актиномицеты, микроводоросли и грибы (Peng et al., 2005; Sharkova et al., 2015). В последние годы была показана способность протеолитических ферментов микромицетов к ограниченному протеолизу факторов свертывания крови и фибринолиза, что позволило рассматривать их как более перспективные компоненты средств тромболитической терапии и диагностики тромбоэмболических осложнений (Osmolovskiy et al.., 2012; Osmolovskiy et al., 2014; Zvonareva et al., 2015; Sharkova et al., 2016а; Sharkova et al., 2016b).

Одним из хорошо изученных продуцентов протеиназ, обладающих выраженным фибринолитическим действием, является хищный гриб-нематофаг Arthrobotrys longa Mecht., хранящийся в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова (Sharkova, Maksimov, 1999; Sharkova et al., 2016а). Внеклеточные протеолитические ферменты этого штамма известны как комплекс лонголитин, который обладает фибринолитической и активаторной к плазминогену активностями (Sharkova et al., 2013; Podorolskaya et al., 2014).

При работе с Arthrobotrys longa Mecht. в лабораторных условиях была обнаружена морфологическая вариабельность колоний, выросших после моноспорового рассева на агаризованной среде Чапека–Докса. В результате, при дальнейших пересевах, был выделен неизвестный гриб-ассоциант, по всей видимости, с микофильными свойствами, также обладающий фибринолитической активностью.

Цель работы – идентификация микромицета-ассоцианта штамма A. longa и определение его биотехнологического потенциала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования и его поддержание. Объектом исследования служил штамм микромицета, выделенного при моноспоровом рассеве из культуры A. longa. Поддержание штамма осуществляли в пробирках на скошенном овсяном агаре и на модифицированной среде Чапека–Докса следующего состава (г/л): NaNO₃ – 3.0, КН₂РО₄ – 1.0, КCl – 0.5, MgSO₄ – 0.5, сахароза – 25.0, агар – 30.0. Пробирки со штаммом хранили при 4°С.

Изучение морфологических и культуральных свойств. Идентификацию проводили с использованием микро-, макроморфологических и культуральных признаков с использованием определителей (Gams, 1971; Hoog et al., 2000; Domsch et al., 2007 и др.).

Микроморфологию микромицета изучали с помощью световой (микроскоп Leica DM 500) и сканирующей электронной микроскопии.

Для световой микроскопии препараты мицелия микромицета с овсяного агара или из глубинной культуры прижизненно окрашивали красителем нейтраль-рот (1:2000) (Беккер и соавт., 1957) и микроскопировали при увеличении ×1000.

Для приготовления препарата для электронной микроскопии вырезали участок колонии, выращенной на среде Чапека–Докса, и фиксировали в 2.5%-м глутаровом альдегиде в течение 4 ч. Затем последовательно отмывали образец в фосфатном буфере (рН 7.4) и дистиллированной воде. Для дегидратации осуществляли проводку образца через растворы с постепенно увеличивающейся концентрацией этанола (30, 50, 70 и 96%). Затем постепенно заменяли этанол на ацетон (в соотношении этанол/ацетон 3 : 1, 1 : 1 и 1 : 3). Полученный препарат высушивали при критической точке, наклеивали на столик и напыляли тонким слоем инертного металла. Микроскопию проводили на микроскопе JSM-6380LA (JEOL Ltd., Япония) в Лаборатории электронной микроскопии ЦКП МГУ имени М.В. Ломоносова.

Молекулярно-генетическая идентификация. Для работы брали небольшой фрагмент мицелия микромицета, выращенного на среде Чапека–Докса, и растирали с жидким азотом в стерильной керамической ступке. Выделение ДНК проводили с использованием CTAB буфера [0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 2% (w/v) CTAB] по стандартному протоколу экстракции (Griffith, Shaw, 1998). Для амплификации рДНК, включающей фрагмент гена 18S, внутренний транскрибируемый спейсер ITS1, ген 5.8S, внутренний транскрибируемый спейсер ITS2 и фрагмент гена 28S, были использованы универсальные праймеры ITS1 и ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC) с применением стандартных ПЦР-протоколов (White et al., 1990).

ПЦР проводили на готовых наборах “PCR core” компании Изоген. Режим амплификации: 96°C – 3 мин, 30 циклов: 1) 94°C – 30 с, 2) 55°C – 30 с, 3) 72°C – 30 с; 72°C – 3 мин. Xранение материала осуществлялось при 4°C. Разделение фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации, проводили стандартным электрофорезом в 1.5%-м агарозном геле с добавлением EtBr. В качестве буферной системы использовали Tris-борат-ЭДТА-буфер (TBE). После электрофореза гели анализировали в УФ-свете. Ампликон экстрагировали из геля с помощью набора CleanUp компании “Евроген”. Секвенирование последовательностей ДНК проведено компанией “Евроген”. Секвенировали с использованием набора реактивов BigDye^®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, США) на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 × l (Applied Biosystems, CA, США). Полученные последовательности нуклеотидов использовали для поиска соответствия в GenBank для видового определения с использованием программы BLASTn.

Выявление способности к продукции внеклеточных ферментов. Проводили поверхностное культивирование микромицета в чашках Петри на средах, содержащих белковые субстраты или углеводные компоненты, следующего состава (г/л): 1) KH₂PO₄ – 0.5, MgSO₄ – 0.25, пептон – 5.0, казеинат натрия/ желатин/крахмал/эластин – 10.0, агар – 15.0; 2) пептон – 5.0, KH₂PO₄ – 5.0, растворимый крахмал – 2.0, агар – 15.0; 3) KH₂PO₄ – 0.5, MgSO₄ – 0.25, порошковая целлюлоза – 2.0, агар – 15.0.

Посев производили уколом в центр чашки, посевы выращивали 7 сут при 37°С. По истечении срока выращивания в чашки Петри со средами с белковыми субстратами добавляли 5 мл 0.08% раствора Кумасси бриллиантового голубого G-250 в 3.5%-й хлорной кислоте, в чашки Петри с крахмалсодержащей средой – свежеприготовленный 0.5%-й раствор Люголя, а с целлюлозой – 1% раствор Конго красного. Затем измеряли диаметр колоний (D, мм) и зон гидролиза (d, мм) для определения энзиматического индекса (EI), который рассчитывали по следующей формуле: EI = (D + + d)/D (Gupta et al., 2012; Behera et al., 2014).

Изучение протеолитической активности внеклеточных ферментов. Для определения внеклеточной протеолитической активности микромицет выращивали в условиях глубинного культивирования в качалочных колбах объемом 750 мл в шейкере-инкубаторе ЕS-20/60 (Biosan, Латвия) при 28°С и 220 об./мин в две стадии. На первой стадии выращивали посевной мицелий (48–72 ч), на второй (ферментационной) происходила собственно секреция фибринолитических ферментов (96–120 ч). Ферментационная среда содержала (в г/л): К₂НРО₄ – 4.4, NaNO₃ – 19.0, KNO₃ – 2.5, сахароза – 40, рН 6.5. Среда для посевного мицелия была аналогичного состава, концентрация всех компонентов которой была меньше в 2 раза. Активность определяли в культуральной жидкости, предварительно отделяя ее от мицелия центрифугированием при 4°С и 3000 g.

Общую протеолитическую, фибринолитическую и фибриногенолитическую активности определяли модифицированным методом Ансона–Хагихары (Hagihara et al., 1958; Osmolovskiy et al., 2016) по гидролизу 1%-го раствора казеина по Хаммерштейну, бычьего фибрина и бычьего фибриногена, соответственно, приготовленных на 0.1 М Трис-HCl буфере, рН 8.0–8.2. Реакции проводили с 200 мкл пробы и 400 мкл растворов белковых субстратов. Смеси инкубировали 30 мин при 37°С на термошейкере TS-100 (Biosan, Латвия), после чего останавливали реакцию 600 мкл 10%-м ТХУ. Полученные пробы центрифугировали при 12400 g в течение 5 мин и измеряли оптическую плотность при 275 нм на спектрофотометре Eppendorf BioSpectrometer^® kinetic (Eppendorf, Германия). Активность выражали в мкмолях тирозина, образовавшегося в течение 1 мин в 1 мл культуральной жидкости (Е_Тир).

Плазминоподобную и активаторную по отношению к плазминогену активность на фибриновых пластинах определяли по методу Аструпа–Мюллерца–Лассена (Sharkova et al., 2015). Для приготовления фибриновых пластин в чашках Петри смешивали 900 мкл 3%-го раствора бычьего фибриногена в физиологическом растворе и добавляли 200 мкл 0.1%-го раствора тромбина. После стабилизации фибринового геля часть чашек прогревали в течение 30 мин при температуре 86°С.

Для измерения плазминоподобной и активаторной к плазминогену активностей на пластины наносили по 30 мкл пробы и помещали чашки в термостат на 4 часа. По истечении указанного времени на пластинах измеряли площадь зоны лизиса в мм². Разность в размерах зон на непрогретых и прогретых чашках служила показателем способности фермента не только к плазминоподобной (прямой фибринолитической) активности, но и его способности активировать плазминоген. Полученные результаты выражали в усл. ед./см³.

Эксперименты проводили в трех повторностях, ошибка приведенных результатов не превышала 5–7%. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ MS Excel 2013 и Statitstica 7.0. Для сравнения данных использовали U-критерий Манна–Уитни, различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение макро- и микроморфологии микромицета-микофила, ассоцианта штамма Arthrobotrys longa указывает на принадлежность данного гриба к роду Sarocladium (рис. 1–3). Молекулярно-генетическая идентификация по участку нуклеотидной последовательности ITS1-5.8S–ITS2 рДНК позволила определить микромицет как Sarocladium strictum (рис. 4). Последовательность была депонирована в GenBank под номером MF192758.

Рис. 1.

Колонии Sarocladium strictum (14 суток) на среде Чапека–Докса (слева) и на овсяном агаре (справа).

Рис. 2.

Sarocladium strictum: фиалиды, отходящие от тяжей мицелия, палочковидные конидии (14 суток, культура на овсяном агаре, световой микроскоп).

Рис. 3.

Sarocladium strictum: фиалиды, отходящие от тяжей мицелия, округлые головки конидий (5 суток, культура на среде Чапека–Докса, СЭМ).

Рис. 4.

Нуклеотидная последовательность участка гена ITS1–5.8S–ITS2 рДНК Sarocladium strictum.

Известно, что род Sarocladium включает виды, занимающие разные экологические ниши. В большинстве это патогены растений, которые были выделены из мест поражений, с поверхности живых или мертвых частей растений или из почвы. Вид S. mycophilum известен как единственный микопаразит в этом роде.

Род Sarocladium (Hypocreales) был выделен из большого полифилетичного рода Acremonium на основании мультилокусного филогенетического анализа ДНК (Summerbell et al., 2011). В дальнейшем на основании фенотипических данных и филогенетических построений концепция рода Sarocladium была пересмотрена, был описан ряд новых видов (Giraldo et al., 2015). В настоящее время признается 19 видов этого рода с типовым видом S. oryzae.

Морфологически роды Acremonium и Sarocladium очень близки, но филогенетически удалены друг от друга, Acremonium родственен Bionectriaceae, таксономическое положение Sarocladium до сих пор остается неясным (Summerbell et al., 2011).

Sarocladium может быть морфологически дифференцирован от Acremonium как имеющий более длинные фиалиды, отходящие одиночно от вегетативных гиф или конидиеносцев, которые иногда могут обильно ветвиться, образованием аделофиалид, не отделенных базальной септой от гифы, с хорошо заметными воротничками, образованием более удлиненных конидий. Acremonium имеет в основном неразветвленные или слабо разветвленные конидиеносцы, конидии изменчивы по форме (полушаровидные, обратнояйцевидные, эллипсоидальные), аделофиалиды обычно отсутствуют (Summerbell et al., 2011).

Филогенетические исследования показывают близкое родство S. strictum с S. pseudostrictum и S. bactrocephalum, виды образуют хорошо поддерживаемую кладу (Giraldo et al., 2015). Морфологические параметры этих трех видов также очень близки. S. strictum по морфолого-культуральным признакам бывает трудно отличить и от S. kiliense (Gams, 1971).

Экологическая амплитуда S. strictum очень широка (Domsch et al., 2007). Изоляты вида были выделены из почвы, с обработанной древесины, из ризосферы различных растений, со стен и других влажных поверхностей теплиц, с мертвых и живых растений, из пораженной волосистой части головы человека, гриб обнаружен у пациентов с хроническими легочными заболеваниями (Gams, 1971; Hoog et al., 2000). По патогенным свойствам гриб относят к первому базовому уровню биобезопасности (BSL-1) и, по-видимому, он является участником инвазивной инфекции иммунодепрессивных пациентов (Hoog et al., 2000). Известны многочисленные случаи выделения S. strictum с грибов разных таксономических групп, как аско-, так и базидиомицетов – Inonotus (чага), Hypoxylon, Fomitopsis, Microsphaera, со склероциев Botryotinia (Domsch et al., 2007). Характер взаимоотношений Sarocladium strictum с другими грибами точно не установлен и может быть различен – от сапротрофии до микопаразитизма. Мы предполагаем, что имеющийся у нас изолят паразитировал на грибе Arthrobotrys longa.

Выявление способности выделенного микромицета к продукции внеклеточных ферментов на основе определения энзиматических индексов при росте на агаризованных средах с белками или углеводами в своем составе показало, что Sarocladium strictum проявляет высокую протеолитическую активность и обладает незначительной амилолитической активностью (рис. 5, табл. 1). Среди использованных в составе сред белковых субстратов микромицет лучше всего использовал желатин и казеин. Соответствующие значения энзиматических индексов оказались на 52% больше значений EI при росте на среде с эластином и на 35% больше, чем на среде с крахмалом. Целлюлазная активность у микромицета обнаружена не была.

Рис. 5.

Рост Sarocladium strictum на средах: a – с казеином, б – с желатином, в – с крахмалом, г – с эластином.

В связи с высокими значениями энзиматичес-ких индексов при росте на средах с белковыми субстратами протеолитическая активность S. strictum была изучена в условиях глубинного культивирования.

В глубинной культуре на синтетической среде, с использованием источников азота в окисленной форме, при низком соотношении углерода и азота и значениях рН, близким к нейтральным, S. strictum рос в виде мелкодисперсной массы, состоящей из тяжей слабо ветвящегося мицелия, с многочисленными фиалидами и овально-палочковидными одноклеточными конидиями, длиной 3–5 мкм (рис. 6).

Рис. 6.

Глубинная культура Sarocladium strictum: а – световая микроскопия, б – сканирующая электронная микроскопия.

Глубинное культивирование показало, что он активно образует протеолитические экзоферменты (табл. 2), которые способны расщеплять нативные белки, как глобулярные, так и фибриллярные. У данного штамма S. strictum была обнаружена казеинолитическая, фибринолитическая, фибриногенолитическая и активаторная к плазминогену активность. Интересно отметить, что внеклеточные протеиназы, содержащиеся в культуральной жидкости микромицета, как и протеиназы Arthrobotrys longa, проявили активаторную к плазминогену активность, что может характеризовать его как новый и весьма перспективный продуцент фибринолитических ферментов непрямого действия. Активаторная к плазминогену активность доходила до 32% от фибринолитической активности, что сопоставимо и несколько превышает данное соотношение по активности у протеиназ A. longa (Sharkova et al., 2016а).

Таким образом, из культуры гриба-нематофага A. longa был выделен микофильный гриб-ассоциант, фенотипически и генотипически идентифицированный как Sarocladium strictum. При изучении его ферментативной активности было выявлено, что штамм S. strictum секретирует протеолитические ферменты с выраженной фибринолитической активностью, которая заключается в способности как гидролизовать фибриновые пластины в условиях in vitro, так и проявлять активаторное действие по отношению к ключевому белку фибринолитической системы человека – плазминогену. Определение фибринолитической активности в культуральной жидкости показало, что ее значение сопоставимо и даже превышает таковую у других микромицетов (Sharkova et al., 2015). Например, фибринолитическая активность S. strictum в 2 раза выше, чем у Absidia glauca M-1, в 2.5 раза, чем у Aspergillus niger 29, и в 1.7 раз выше, чем у Acremonium basilisporum 12. В культуральной жидкости гриба обнаруживается также и неспецифическая протеолитическая (казеинолитическая) активность, что может указывать как на комплекс протеолитических ферментов, образуемых Sarocladium strictum, так и на их специфичность по отношению к компонентам фибринолитической системы человека. Следует отметить, что проявление активаторной к плазминогену активности встречается среди протеиназ микромицетов нечасто, и такие ферменты считаются наиболее предпочтительными для разработки фибринолитических средств непрямого действия, чрезвычайно востребованных в современной медицине. Указанные свойства делают S. strictum перспективным продуцентом фибринолитических ферментов направленного действия, которые могут найти свое применение в составе терапевтических средств лечения тромбоэмболических осложнений. Способность к секреции таких ферментов при росте на простой и достаточно дешевой питательной среде может оказаться экономически выгодным для разработки биотехнологического процесса получения протеиназ у S. strictum.

Исследование проводилось в рамках Государственного задания, часть 2, раздел 01 10 (проекты № АААА-А16-116021660088-9, АААА-А16-116021660084-1), с использованием приборной базы Центра коллективного пользования научным оборудованием “Лаборатория электронной микроскопии биологического факультета МГУ (Electron microscopy laboratory of Moscow State University Biology Faculty)”. Поддержано грантом РФФИ, проект № 18-29-25073.