Микология и фитопатология, 2021, T. 55, № 3, стр. 225-228

Микромицеты рода Aspergillus широко изучаются в качестве продуцентов протеолитических ферментов, перспективных для гидролиза различных белков и белоксодержащих субстратов (Serba et al., 2020). Некоторые штаммы изученных в последнее время видов аспергиллов секретируют протеиназы, высокоактивные в отношении фибриллярных белков – коллагена, эластина, фибрина (Popova et al., 2020; Chimbekujwo et al., 2020; Popova et al., 2021). Фибринолитические (плазминоподобные) ферменты аспергиллов представляют особый интерес, поскольку могут найти практическое применение в различных областях медицины, демонстрируя высокое сродство к компонентам тромба и способность к его расщеплению (Shilpa et al., 2019; Osmolovskiy et al., 2020). Например, внеклеточные протеиназы Aspergillus ochraceus L-1 по сравнению с аналогами – препаратами трипсина и стрептокиназы – проявляли в 2 раза бóльшую фибринолитическую и фибриногенолитическую активность (Osmolovskiy et al., 2020).

Одним из протеолитически активных микромицетов является A. terreus, секретирующий протеиназы с различной субстратной специфичностью, а их суммарная доля в секретоме достигает 16% (Han et al., 2010; Saritha et al., 2016). Для микромицетов этого вида характерна продукция сериновых протеиназ, как щелочных с оптимумом температуры 37°C (Chakrabarti et al., 2000), так и нейтральных, проявляющих максимальную активность при 50°C (Biaggio et al. 2016; de Lima et al., 2021). Считается, что патогенные штаммы A. terreus, ассоциированные с рядом заболеваний, секретируют протеиназы как факторы вирулентности (Ramirez-Garcia et al., 2018).

Штамм A. terreus 2 – микромицет-сапротроф, известный как продуцент протеолитических ферментов, обладающих способностью проявлять плазминоподобную и активаторную к прекалликреину активность (Zvonareva et al., 2018). Ранее из культуральной жидкости продуцента была выделена протеиназа и изучен спектр ее активности по отношению к различным белкам коагулянтной и антикоагулянтной систем (Osmolovskiy et al., 2014; Zvonareva et al., 2015). Однако выраженность ее действие по отношению к белкам фибринолитической системы человека и способность к тромболизису изучены не были.

Целью работы было изучение тромболитического потенциала внеклеточной протеиназы A. terreus 2.

В работе использовали штамм из коллекции кафедры микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова. Для получения протеолитических ферментов микромицет выращивали в условиях глубинного культивирования в подобранных ранее условиях (Zvonareva et al., 2018). Получение препарата внеклеточных протеиназ включало высаливание белков из культуральной жидкости сульфатом аммония и диализ (Zvonareva et al., 2015). Разделение препарата проводили методом колоночного изоэлектрофокусирования по Вестербергу как описано ранее (Zvonareva et al., 2015). Фракции с рI 4.3–4.8 содержали активную протеиназу. Гомогенность выделенной протеиназы подтверждали электрофоретически по методу Лэммли. Белок определяли по методу Брэдфорд.

Активность протеиназ определяли с помощью 1%-х суспензий фибрина и фибриногена, приготовленных на 0.1 М трис-HCl буфере (pH 8.2) (Sigma-Aldrich, США) по модифицированному методу Ансона–Хагихара (Osmolovskiy et al., 2016). Реакции проводили в течение 10 мин при 37° C при постоянном встряхивании (600 об/мин) в термошейкере TS-100 (BioSan, Латвия). Измерение оптической плотности растворов (275 нм) проводили на спектрофотометре BioSpectrometer® kinetic (Eppendorf, Германия) после их центрифугирования (12 400 об./мин, 10 мин). Активность выражали в мкмолях тирозина, образовавшегося за 1 мин в 1 мл пробы (Е_Тир).

Фибринолитическую и активаторную к плазминогену активность определяли на фибриновых пластинах методом Аструпа–Мюллерца–Лассена (Sharkova et al., 2015). Активность выражали в усл. ед. на 1 мл пробы.

Тромболитическую активность протеиназы измеряли гравиметрически по уменьшению массы тромбов, гидролизованных при 37°C в течение 30–180 мин под действием протеиназы A. terreus 2 (Kotb et al., 2015). По окончании реакции рассчитывали процент негидролизованных тромбов.

В табл. 1 представлено действие выделенной протеиназы микромицета A. terreus 2 на фибрин, фибриноген и плазминоген. Видно, что протеиназа активно расщепляет указанные субстраты.

Впервые обнаружена активаторная к плазминогену активность протеиназ, образуемых A. terreus 2. Из данных литературы известно, что не все представители рода Aspergillus образуют протеиназы, способные активировать плазминоген (Kotb et al., 2015). Наличие такой активности в совокупности с фибринолитической активностью позволяет утверждать, что выделенная протеиназа может осуществлять как прямой фибринолиз (непосредственный лизис фибрина), так и непрямой (через активацию плазминогена – белка, превращающегося в кровотоке в основной фибринолитический фермент организма человека – плазмин). Активаторная к плазминогену активность протеиназы A. terreus 2 составила около 40% от фибринолитической, что значительно превышает таковую для других микромицетов (Sharkova et al., 2015).

Фибриногенолитическая активность выделенной протеиназы оказалась несколько больше фибринолитической, но несущественно, что подтверждает полученные ранее данные о равноценности гидролиза этих субстратов штаммом A. terreus 2 (Zvonareva et al., 2018).

В связи с полученными данными существенный интерес представляет изучение тромболитической активности протеиназы A. terreus 2, позволяющей выявить ее эффективность расщеплять многокомпонентный и объемный субстрат протеолиза. Полученные результаты представлены на рис. 1. Исследованная протеиназа очень быстро растворяла новообразованные тромбы: уже через 30 мин инкубации остаточная масса тромба составила 30%, за 90 мин – 10%. Полностью тромб был гидролизован протеиназой A. terreus 2 менее чем за 120 мин, что говорит о ее высоком тромболитическом потенциале.

Рис. 1.

Тромболизис (остаточная масса, %) протеиназой Aspergillus terreus 2.

Полученные данные дополняют представления о способах применения внеклеточных протеиназ A. terreus и убедительно показывают, что фермент может быть использован не только в легкой промышленности или в составе моющих средств, о чем свидетельствует ряд исследований, но и в биомедицине (Chakrabarti et al., 2000; Biaggio et al. 2016; de Lima et al., 2021).

Таким образом, внеклеточная протеиназа микромицета A. terreus 2 обладает высоким тромболитическим потенциалом, а сам микромицет является перспективным продуцентом протеиназ фибринолитического и тромболитического действия. Способность выделенной протеиназы проявлять активаторную к плазминогену активность позволяет рассматривать ее и в качестве непрямого фибринолитического агента. С непрямыми фибринолитическими агентами в настоящее время связывают развитие одного из ведущих направлений тромболитической терапии (Lal et al., 2017).

Работа выполнена при финансовой поддержке Совета по грантам Президента РФ № СП-3906.2021.4.