Микология и фитопатология, 2021, T. 55, № 4, стр. 285-290

ВВЕДЕНИЕ

Грибы рода Penicillium относятся к организмам-космополитам, практически не имеют ограничений по ареалам и объектам обитания и обладают разветвленной системой биосинтеза низкомолекулярных соединений. Уже сейчас перечень препаратов с полезными свойствами, выпускаемых с использованием этих организмов, чрезвычайно широк, продолжает пополняться, и, более того, отдельные виды традиционно применяются при производстве пищевых продуктов. Тем не менее, представители рода Penicillium известны причастностью к алиментарным отравлениям и способностью продуцировать токсичные вещества (Hymery et al., 2014). Именно этим объясняются настойчивые усилия исследователей по разработке лабораторных приемов их тестирования. Для промышленных штаммов успешно испытаны процедуры глубинного культивирования, моделирующие технологические схемы и позволяющие изучать влияние мутаций, делеций и структурных вариаций в геноме продуцентов на биосинтез физиологически активных веществ (Fernandez-Bodega et al., 2009; Wang et al., 2014). Предпринимались попытки предложить субстраты-аналоги для гигиенического контроля пищевых продуктов (Kokkonen et al., 2005), однако найти оптимальные подходы к оценке природных популяций Penicillium оказалось сложной задачей. Из-за неоднозначности биохимического ответа грибов на условия культивирования (способ подготовки инокулюма, питательную среду, температуру, влажность, аэрацию, продолжительность роста) проблема, по общему мнению, так и остается нерешенной.

В начале 80-х годов прошлого столетия датские исследователи предложили методику скрининга токсинов и других вторичных метаболитов Penicillium при краткосрочном культивировании штаммов на коммерческих агаровых средах с последующим визуальным или инструментальным выявлением компонентов экстрактов (Filtenborg, Frisvad, 1980) и использовали ее в полифазной таксономии тервертициллярных видов (Frisvad, Filtenborg, 1983; 1989). Другие авторы для тех же целей применяли глубинное культивирование в жидких минеральных средах (Kozlovsky et al., 2009). Такое профилирование метаболитов оказалось вполне информативным для систематики, но носило лишь условный и формальный характер при оценке экологической опасности этих грибов (Kačergius et al., 2005; Bragulat et al., 2008; Koteswara Rao et al., 2011). Прогнозирование угроз, связанных с пораженностью объектов окружающей среды, предполагало поиск принципиально другого подхода, ориентированного на наиболее полную реализацию токсигенного потенциала грибов. За последние годы для нескольких видов Penicillium проведена расшифровка участков геномов, ответственных за синтез ряда специфических метаболитов и показана важная роль внекластерных регуляторов (Van den Berg et al., 2008). К факторам, оказывающим опосредованное влияние на совокупность биосинтетических процессов, отнесены температура, активность воды по Скотту, рН и биохимические характеристики питательной среды (Geisen et al., 2018). Опыт тестирования грибов Penicillium, выделенных из разных биообъектов, показал, что in vitro на увлажненном стерилизованном зерне риса происходит более интенсивное накопление токсинов в сравнении с агаровыми средами (Burkin et al., 2019). Причины этого эффекта остаются неясными, однако известно, что структурированные природные субстраты значительно различаются не только составом и качеством основных ингредиентов (аминокислот, липидов и углеводов, главным образом, крахмала), но и химической природой низкомолекулярных экстрактивных веществ. Систематических исследований характера их влияния на функционирование регуляторных механизмов биосинтеза микотоксинов грибами не проводилось, а доступные сведения весьма ограничены, недостаточны и фрагментарны.

Целью данной работы было изучение интенсивности метаболического ответа штаммов токсигенных видов Penicillium, выделенных из растительных объектов с частой контаминацией PR-токсином (PR) и микофеноловой кислотой (МФК), при культивировании на нескольких твердых зерновых субстратах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штаммы Penicillium roqueforti Thom, P. brevicompactum Dierckx, P. chrysogenum Thom из исследовательской коллекции лаборатории микотоксикологии и санитарии кормов ВНИИВСГЭ – филиал ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, выделенные из семян подсолнечника после поверхностной дезинфекции, из побочного продукта их промышленной переработки (шрота), а также из подвяленных и высушенных луговых травянистых растений. Для получения моноконидиальных культур грибов готовили суспензию в 0.1%-м водном стерильном растворе Твин-80, содержащую не более 1–2 конидий в капле бактериологической петли диаметром 0.4 см. В стерильные чашки Петри на дно с помощью той же бактериологической петли вносили на удалении друг от друга 3–4 капли полученной взвеси и заливали тонким слоем осветленного агара Чапека–Докса (ЧДА), расплавленного и затем охлажденного до 35°С. После культивирования (одни сутки, 23–25°С) под микроскопом отмечали удаленные участки агара с проросшими конидиями, вырезали их микологическим крючком и переносили в пробирки со скошенным ЧДА. После 10 сут культивирования штаммы регистрировали в коллекции и помещали на хранение. Видовую идентификацию выполняли по культурально-морфологическим признакам согласно таксономической системе (Raper et al., 1949) с использованием видового эпитета P. brevicompactum (“P. brevi-compactum”) в соответствии с номенклатурной базой данных MycoBank (http://www.mycobank.org/). По результатам предварительного тестирования на сусловом агаре (7 сут, 25°С) были выбраны 12 токсигенных штаммов (табл. 1).

Инокулюм готовили путем выращивания штаммов на скошенном ЧДА в течение 7–10 суток при температуре 23–25°С. Далее фрагмент мицелия переносили в стеклянные флаконы вместимостью 10 мл и диам. дна 18 мм, содержащие по 1 г зернового субстрата, увлажненного 1 мл воды перед автоклавированием. В качестве субстратов использовали рис (шлифованный круглозерный), овес (овсяные хлопья) и просо, кукурузу, ячмень, пшеницу в виде круп.

После посева флаконы, закрытые ватно-марлевыми пробками и слоем пленки Parafilm “M”^® (PM-996, “Pechiney Plastic Packing”, США), выдерживали в темноте при 25°С в течение 7 суток. Каждый вариант опыта выполняли в трех повторностях. По окончании культивирования во флаконы добавляли по 3 мл смеси ацетонитрила и воды в объемном соотношении 84 : 16 и интенсивно встряхивали в начале и конце 14-часовой стационарной экстракции. Определение микофеноловой кислоты (МФК) и PR-токсина (PR) проводили после 100-кратного разведения экстрактов буферным раствором методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа с помощью аттестованных тест-систем по процедуре (Burkin et al., 2019). Результаты выражали как средние арифметические полученных значений (M) с ошибкой выборочной средней (±SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Все штаммы P. roqueforti значительно различались по интенсивности накопления PR на зерне риса – от десятков до более тысячи мкг/г (табл. 2). На это неоднократно указывалось и другими авторами, в том числе и для агаризованных сред – для 5 штаммов (Fernandez-Bodega et al., 2009), а также для 55 штаммов, различающихся по генетическому статусу и происхождению (Hidalgo et al., 2017).

Три из пяти тестированных штаммов P. roqueforti на всех зерновых субстратах образовывали PR совместно с МФК (табл. 2). На рисе и кукурузе количества первого токсина были на один–два порядка выше, чем второго. Однако категоричное утверждение о том, что преобладание PR над МФК свойственно виду P. roqueforti (Frisvad, Samson, 2004) нашло подтверждение только для одного из них – № 650. Остальные штаммы проявляли индивидуальные реакции, соотношение количеств метаболитов практически достигало равновесия или изменялось на обратное в сторону большего накопления МФК у № 3/5 на четырех субстратах (овес, просо, ячмень, пшеница) и у № 648/5 – на овсе и пшенице.

В целом ответная реакция штаммов на тип среды была по PR вполне умеренной с индивидуальными колебаниями его количеств в пределах одного порядка, но по МФК оказалась заметно более выраженной с широтой варьирования в два порядка.

Долгое время считалось, что пути образования этих двух метаболитов независимы, но теперь на молекулярном уровне между ними уже доказана связь – перекрестное взаимовлияние генов (Hidalgo et al., 2014). Подобные генные отношения были показаны и на примере синтеза PR и пенициллина при сравнении типового штамма P. chrysogenum и его модификаций (Wang et al., 2014). Выявленная в нашем эксперименте разная направленность и изменчивость ответных метаболических реакций P. roqueforti с участием двух токсинов, по-видимому, отражает сложный характер влияния субстрата на функционирование всего биосинтетического комплекса. В последние годы для этого вида завершено подробное изучение механизма биосинтеза МФК (Del-Cid et al., 2016; Gillot et al., 2016) и начаты исследования генов, участвующих в образовании PR (Hidalgo et al., 2017).

У двух штаммов P. roqueforti (№ 88/2 и № 184) МФК не была найдена, но способность к биосинтезу PR сохранялась. Колебания интенсивности накопления токсина по субстратам не превышали одного порядка с наибольшими значениями на вариантах с просом (табл. 2). Штаммы P. chrysogenum также продуцировали PR, но с меньшей интенсивностью и в сопоставимых количествах на зерне риса (табл. 3). Недавно установлено, что у этого вида биосинтез PR на рисовом субстрате происходит при участии кластера, включающего гены P. roqueforti (prx1–prx4) и мембранный антипортер 14-TMS drug/H⁺ (Hidalgo et al., 2014). В нашем эксперименте оба штамма P. chrysogenum, как и штаммы P. roqueforti (№ 88/2 и 184), демонстрировали его преимущественное накопление на просе, и логично предположить, что подобная реакция может быть связана с экспрессией этого участка генома компонентами данной питательной среды.

У пяти штаммов P. brevicompactum различия в количествах МФК на рисе и остальных субстратах не превышали одного порядка (табл. 4). В целом ослабленное продуцирование этого метаболита отмечалось на рисе и кукурузе – субстратах с высоким содержанием крахмала, для двух штаммов – на рисе, у остальных – на кукурузе.

Ранее для штамма P. brevicompactum ATCC 9056 также было отмечено пониженное накопление МФК на рисе и кукурузе, а наибольшее – на овсе и пшенице (Bartman et al., 1981). Важно заметить, что у штаммов P. roqueforti, синтезирующих МФК наряду с PR, наименьшие количества этого токсина также найдены в вариантах с рисовым и кукурузным субстратами (табл. 2). Очевидно, что при лабораторной оценке активности потенциальных продуцентов МФК среди Penicillium предпочтение следует отдавать субстратам на основе зерна пшеницы, овса и ячменя.

Таким образом, ингредиенты твердых зерновых субстратов способны к опосредованному участию в регуляции основных путей биосинтеза микотоксинов, возможно, оказывая влияние как на промежуточные, так и на конечные стадии, а также на перекрестные контакты между ними. Связано ли это с одной или несколькими группами низкомолекулярных веществ, комплексами компонентов разной химической природы или их совокупностью, предстоит выяснить в будущем. Накопление таких сведений важно не только для перспективных молекулярных исследований механизмов биосинтеза микотоксинов, но и в практическом аспекте. Поиск условий, при которых токсигенные грибы наиболее полно проявляют потенциальные возможности образования особо опасных метаболитов, открывает путь к формированию эффективных приемов оценки реальных рисков, связанных с контаминацией агропродукции.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 гг. (тема 0579-2014-0009, регистрационный номер НИОКР в ФГБНУ “ЦИТИС” 114121150149 от 11.12.2014 г.)