Микология и фитопатология, 2021, T. 55, № 4, стр. 297-308

ВВЕДЕНИЕ

Парша является основным экономически значимым заболеванием промышленных насаждений яблони в мире. Вызывающий ее гриб Venturia inaequalis (Cooke) Winter, анаморфа – Fusicladium dendriticum (Wallr.) Fuckel, поражает только эту культуру и ее диких сородичей и характеризуется высокой внутрипопуляционной изменчивостью и адаптивностью, обусловленной ежегодным половым процессом, приводящим к рекомбинации признаков. После заражения растения-хозяина патоген развивается в субкутикулярном пространстве листа или некоторых других наземных органов яблони (Nasonov, Suprun, 2015). Краснодарский край характеризуется благоприятными погодно-климатическими условиями для эпифитотийного развития парши яблони. С 2004 г. отмечено возрастание агрессивности популяции V. inaequalis и усиление ее паразитической активности в регионе (Yakuba, 2013). Потери от заболевания весьма значительны. Так, в Краснодарском крае увеличение поражения плодов на сорте Ренет Симиренко на каждые 10% приводило к снижению урожая на 8.00–8.82 кг на каждое дерево (Yakuba, 2013). Современная защита яблони от парши представляет собой комплекс мероприятий, включающих как использование устойчивых к заболеванию сортов, так и применение химических и биологических пестицидов. Эффективность химического метода контроля возбудителя по-прежнему остается самой высокой, но требует строгого соблюдения регламентов использования фунгицидов, включающих норму расхода препарата, сроки и кратность опрыскивания, количество инфекционной нагрузки возбудителя, особенности погодных условий и другие. Количество обработок фунгицидами, необходимых для контроля парши яблони, может составлять от 10 до 20 за вегетационный период в зависимости от уровня относительной устойчивости сорта-хозяина, возраста сада, количества первичного инокулюма, температуры воздуха и продолжительности периода увлажнения листьев и плодов (MacHardy et al., 2001). Однако в некоторых случаях все же отмечается снижение эффективности программы защиты, причиной чего является возникновение у патогена практической резистентности к фунгициду.

Первые случаи резистентности к системным фунгицидам, обладавшим лечебными свойствами, зафиксированы в конце 1960-х гг., спустя примерно десять лет после начала их использования. Додин стал первым фунгицидом, у которого было отмечено снижение эффективности в борьбе с паршой яблони (Cox, 2015). Однако к следующему классу фунгицидов – метилбензимидазолакарбаматам – резистентность развилась быстрее, уже спустя пять лет после регистрации препарата (Cox, 2015). При этом фунгициды многосайтового токсического действия на грибы, то есть связанного с нарушением многих биосинтетических процессов у патогенов (Tyuterev, 2010), не снижали своей эффективности в течение длительного времени. Стало понятно, что возникновение резистентности к моносайтовым, имеющим одну мишень действия (один фермент), фунгицидам является их “ахиллесовой пятой”, обусловленной высокоспецифическим механизмом действия.

Фунгициды – ингибиторы деметилирования (DMI), в частности, триазолы, к которым относится дифеноконазол, широко используются для борьбы с V. inaequalis из-за их лечебного действия. Согласно классификации FRAC, по механизму действия они относятся к группе G: вещества, нарушающие биосинтез стерола в мембранах клеток гриба (sterol biosynthesis in membranes), и в системе кодов этой организации они обозначаются цифрой 3 (FRAC Code List, 2018). Поскольку фунгициды DMI представляют собой специфические ингибиторы, препятствующие C-14-деметилированию 24-этилендигидроланостерола в биосинтезе эргостерина, существует риск развития к ним устойчивости (Köller, Scheinpflug, 1987). FRAC определяет такой риск для этих фунгицидов как средний (FRAC Code List, 2018).

В Краснодарском крае применять дифеноконазол в промышленных садах яблони начали с 1991 г., на основной площади насаждений – с 1993 г. Вплоть до 1998 г. препарат с этим действующим веществом – Скор, КЭ (250 г/л) – обеспечивал биологическую эффективность защиты от парши на уровне 91–99%. После 5–6-летнего применения дифеноконазола, в большинстве садов произошло резкое снижение его эффективности: до 70–80% (Smolyakova, 2000). В полевых опытах были получены аналогичные результаты. При применении дифеноконазола в фенофазы яблони “окончание цветения”, “величина плода лещина”, “величина плода грецкий орех” в течение первых трех лет биологическая эффективность защиты от парши была на уровне 99–100% при продолжительности защитного действия до 15 суток. На четвертый год биологическая эффективность снижалась до 89%, на пятый – до 82%, на шестой – до 77%, на седьмой – до 70%. С каждым годом отмечалось уменьшение продолжительности периода защитного действия – на пятый–шестой год до 8–10 суток, что приводило к необходимости сокращения интервалов между обработками (Yakuba, 2013). В настоящее время дифеноконазол по-прежнему широко применяется в насаждениях яблони региона в программах защиты от парши, но высокая эффективность его обеспечивается (при условии соблюдения регламентов применения) за счет сокращения интервалов между опрыскиваниями до 5–6 суток.

Развитие резистентности к фунгицидам из класса триазолов описано: для миклобутанила и флутриафола в США (Cox, 2015), для флутриафола (препарат Импакт) в России (Yakuba, 2013) и др. Для дифеноконазола известны данные М.М. Левитина и Т.Ю. Гакаевой о ее развитии в Краснодарском крае (2000). В другом исследовании, проведенном в 2000 г. на изолятах патогена из четырех точек краснодарской популяции, показано отсутствие сдвига чувствительности к этому действующему веществу у возбудителя парши яблони (Smolyakova, 2000). В целом изоляты V. inaequalis с пониженной чувствительностью к фунгицидам DMI были зарегистрированы в различных частях обширного ареала патогена: в США (Chapman et al., 2011; Pfeufer, Ngugi, 2012; Villani et al., 2015), Чехии (Stevic et al., 2010), Италии (Fiaccadori, 2017), Уругвае (Mondino et al., 2015), Марокко (Lahlali et al., 2019), России (Lobodina et al., 2019) и др.

Феномен устойчивости связан с изменением чувствительности мишени, проницаемости мембран клеток патогена для фунгицида или активацией его детоксицирующих механизмов. Устойчивость формируется под воздействием фунгицида в процессе выживания и размножения изначально редких форм гриба со сниженной чувствительностью к нему. В результате такого селективного преимущества устойчивые клоны в популяции патогена начинают преобладать над чувствительными. Некоторое количество устойчивых к фунгициду биотипов гриба может присутствовать и случайно распределяться в нативной, не контактирующей с фунгицидом, популяции, вследствие мутационного процесса (Dyakov, 1998). Сравнение уровня чувствительности исходной популяции с той, которая контактирует с химическим препаратом, позволяет проследить развитие резистентности в последней (Cox, 2015). Как показано в ряде исследований, исходная чувствительность в региональных популяциях V. inaequalis мира может различаться (Henríquez et al., 2011; Mondino et al., 2015; Fiaccadori, 2017).

Цель работы – оценка чувствительности к дифеноконазолу краснодарских популяций V. inaequalis из промышленных садов или древостоев яблони, различающихся историей контактирования с фунгицидом, а также определение дискриминационной концентрации дифеноконазола для упрощенного метода мониторинга чувствительности к нему патогена.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика мест отбора проб фитопатогена. Для исследования чувствительности к дифеноконазолу в 2019–2020 гг. в Краснодарском крае было отобрано 3 популяции возбудителя парши яблони, представлявшие собой моноспоровые изоляты патогена (получение из листьев яблони описано ниже). Всего было получено 120 изолятов, наибольшей выборкой была представлена популяция Pop3 – 53 моноспоровые культуры, объем двух других популяций был представлен чуть более 30 изолятами в каждой (табл. 1). Популяции различались местом отбора, видом растения-хозяина, типом древостоя и историей применения фунгицидов (табл. 1). Pop1 была выделена из естественных произрастаний яблони восточной (Malus orientalis), широко распространенной в лесах Западного Предкавказья, в двух километрах от станицы Калужская, Северский район Краснодарского края. Pop2 и Pop3 получены из промышленных насаждений яблони домашней (Malus domestica) сорта Renet Simirenko, расположенных в Динском и Красноармейском р-нах края.

Различия популяций по истории использования фунгицидов, имевших принципиальное значение для исследования, были следующими. Популяция Pop1 являлась исходной или базовой, так как никогда не имела контакта с фунгицидами. При этом исследованные участки леса находились на расстоянии свыше 5 км от промышленных насаждений яблони и на 1.5–2 км от приусадебных участков с плодовыми культурами, в которых могли быть использованы эти вещества. Ранее было показано, что различные пропагулы патогена не распространяются на расстояние свыше 50 м (MacHardy et al., 2001; Holb et al., 2004). Сады, в которых отобрали популяции V. inaequalis Pop2 и Pop3, многократно обрабатывали против патогена фунгицидами, в том числе и препаратами дифеноконазола. Количество обработок за сезон препаратами, содержащими дифеноконазол, составляло 4.

На вероятность развития резистентности к фунгициду у возбудителя парши могут оказывать влияние высота, возраст и плотность посадки деревьев (Yakuba, 2013). Возраст насаждения опосредованно определяет, насколько долго популяция патогена могла контактировать с фунгицидом. Чем больше возраст, тем более длительным был отбор устойчивых форм патогена. Высота деревьев зависит не только от возраста, но и от схемы посадки: чем она плотнее, тем ниже растение, что определяет большую технологичность при обработке деревьев меньшего размера.

В годы проведения исследований – 2019 и 2020 – на динамику парши яблони в течение вегетации оказали влияние экстремальные погодные условия, прежде всего, – повышенный температурный режим и выпадение за короткие промежутки времени (1–4 суток) аномального количества осадков.

В 2019 г. средняя температура воздуха выше нормы была зафиксирована: в апреле – на 1.5°C, в мае – на 2.0–2.8°C, в июне – на 3.8–5.3°C, в июле – на 1.2°C, в августе – на 3.1°C, в сентябре – на 2.5°C. Осадки, существенно превышающие норму, прошли во второй декаде апреля (186% от нормы), во второй (361%) и третьей (395%) декадах июля, в первой (105%) и во второй (136%) декадах августа, в первой декаде сентября (108%). Периоды резкого возрастания распространения и интенсивности развития болезни на листьях были отмечены после аномального повышения температуры воздуха: с 5 по 11 мая (показатели возросли соответственно в 6 и 4.8 раза), с 28 мая по 4 июня (в 8.7 и 9.8 раза), с 11 по 19 июня (соответственно в 1.7 и 1.3 раза). Количество пораженных завязей и интенсивность их поражения возросли с 25 по 27 мая соответственно в 1.5 и 2 раза, с 28 мая по 4 июня – соответственно в 4.0 и 3.5 раза, с 5 по 11 июня соответственно в 1.4 и 1.6 раза. Осадки июля вызвали эпифитотийное развитие заболевания: в первой декаде августа было поражено более половины листового аппарата и около половины плодов. К началу сентября было поражено 74% листьев с интенсивностью 54.4% и 53.0% плодов с интенсивностью 31.8%.

В 2020 г. превышение значений температуры воздуха над среднемноголетними показателями отмечалось в июне (на 1.2–2.8°C), июле (на 4.2°C), августе (на 1.4–1.5°C), сентябре (на 3.0–4.3°C). Значительным недобором осадков или их отсутствием характеризовались апрель (0–18% от нормы), а также вторая декада мая (0%), третья декада июня (3%), август (0–30%). Аномально сухие периоды чередовались с периодами выпадения осадков ливневого характера, значительно превышающих среднемесячную норму: в мае (149–212% от нормы), июне (118–175%), июле (163–359%). Осадки мая вызвали резкое нарастание парши: на контрольных деревьях с 5 по 16 мая количество пораженных листьев и интенсивность их поражения возросли более чем в 10 раз, с 26 мая по 3 июня – соответственно в 1.7 и 1.5 раза. После резкого повышения температуры воздуха в июне и выпадения осадков, существенно выше нормы, количество пораженных листьев и интенсивность их поражения возросли с 3 по 11 июня соответственно в 1.3 и 1.7 раза, с 11 по 22 июня соответственно еще в 1.5 и 1.8 раза. Во второй декаде июня в контроле было поражено 63% листьев с интенсивностью 53.2%. Далее в третьей декаде месяца в условиях аномальной жары и очень незначительного количества осадков парша развивалась слабо: количество пораженных листьев, интенсивность развития болезни возросли незначительно. После ливней в первой, а затем в третьей декадах июля с 30 июля по 11 августа интенсивность развития парши возросла в 1.4 раза. Поражение плодов в контрольном варианте нарастало после аномального количества осадков: с 21 по 26 мая распространение болезни на плодах увеличилось в 6 раз, а интенсивность их поражения – в 11 раз, с 30 июня по 9 июля, соответственно, в 2.7 и 2.5 раза, с 16 по 30 июля, соответственно в 1.5 и 1.9 раза. В первой декаде сентября было поражено 80% листьев при интенсивности развития болезни 71.9% и 70% плодов при интенсивности развития болезни 43.6%.

Испытания в полевых опытах в 2019 и 2020 гг. фунгицидов с действующим веществом дифеноконазол – Скор, КЭ (250 г/л) и Фарди, КЭ (250 г/л) – показали, что в условиях повышенного температурного режима (при средней температуре воздуха на 1.5–2.8°С выше нормы) и выпадении осадков биологическая эффективность этих препаратов против парши обеспечивалась на уровне 97.2–99.3%, период их защитного действия составлял 6–7 суток. В условиях сухой погоды, неблагоприятной для развития парши, при повышенной температуре (на 1.5–2.9°С выше нормы) эффективность на уровне 98.8–99.0% сохранялась в течение 8–10 суток. При температуре воздуха на уровне среднемноголетних значений, или незначительно их превышающей (на 0.9°С выше нормы), эффективность дифеноконазола составляла 90.0–92.9%, продолжительность защитного действия не превышала 5–6 суток. Таким образом, в настоящее время в Краснодарском крае существенно сократилась продолжительность защитного действия дифеноконазола.

Получение моноспоровых изолятов. Моноспоровые изоляты патогена выделяли из листьев яблони по следующей схеме. В каждой точке отбирали случайным образом 50 листовых образцов с симптомами заболевания: либо прошлогодний опад с плодовыми телами гриба, либо свежие листья с хорошо спорулирующими конидиальными поражениями. Отбор опада проводили в период начала интенсивного лёта аскоспор и до его окончания, с середины апреля до середины мая. Из листового опада моноспоровые изоляты выделяли согласно оригинальной методике Насонова (Nasonov, 2019). Суть метода заключается в эмиссии аскоспор из плодовых тел на поверхность агаризованной среды. Прошлогодний листовой опад яблони последовательно стерилизовали в 70%-м р-ре этилового спирта и 3%-м р-ре перекиси водорода, и отмывали стерильной водой. Дезинфицированные листья закладывали в перевернутые вверх дном чашки Петри с 2%-м водным агаром и инкубировали ночь при 20°С. Далее под контролем стереомикроскопа при 40× увеличении с поверхности среды с помощью заостренной энтомологической иглы осуществляли перенос единичных проросших аскоспор на свежую питательную среду КГА (картофельно-глюкозный агар), содержащую 25 мг/л тетрациклина. Среду КГА готовили следующим образом: картофельный отвар (200 г очищенных клубней варили 1 ч на медленном огне), 20 г глюкозы, 20 г агар-агара на 1 литр воды. Спиртовой раствор тетрациклина (Sigma Aldrich) добавляли после стерилизации среды, когда она остывала до 50°C.

Моноспоровые изоляты из конидиальных поражений получали, как описано в работе Кёллера (Köller et al., 2004). С каждого дерева отбирали один лист с поражениями, с каждого листа вырезали одно спорулирующее пятно и помещали в пробирку Эппендорф объемом 1.5 мл. В пробирку добавляли стерильную воду и осуществляли смыв конидий, полученную суспензию наносили на поверхность 2%-й водной агаровой среды в чашке Петри и инкубировали ночь при 20°С. Далее осуществляли перенос единичных проросших конидий на свежую питательную среду КГА с тетрациклином, как описано выше. Моноспоровый посев инкубировали в течение 30 сут при 20°С в темноте и оценивали на штаммовую чистоту по морфолого-культуральным признакам. Изоляты, имевшие неоднородности в культуре, выражавшейся в наличии секторов, отличавшихся как макроскопическими, так и микроскопическими признаками от основной части колонии, исключали из исследования. С каждого листового образца получали 3 изолята. Различающиеся морфолого-культуральными характеристиками изоляты отдельных образцов получали индивидуальную маркировку.

Оценка чувствительности изолятов к дифеноконазолу. Чувствительность изолятов V. inaequalis определяли в лабораторных условиях в чашках Петри на КГА, содержащей различные концентрации дифеноконазола: 0.005; 0.01; 0.025; 0.05; 0.5 и 1 мг д.в./л. В качестве источника действующего вещества использовали коммерческий препарат Скор КЭ, 250 мг/л, производства ООО “Сингента”, Швейцария. Во все варианты опыта, включая контроль, добавляли тетрациклин – 25 мг/л. Препарат фунгицида и раствор антибиотика вносили после стерилизации в остывшую до 50°С питательную среду в стерильных условиях. Контрольный вариант питательной среды не содержал фунгицида. Полученные среды инокулировали чистыми культурами патогена следующим образом: из каждого моноспорового изолята вырезали стерильным пробковым сверлом блок мицелия с агаром диаметром 5 мм и переносили на среду с фунгицидом или без него. Повторность двукратная. Посевы инкубировали при 20°С в темноте. Через 30 суток измеряли диаметр роста мицелия культуры в двух взаимно перпендикулярных направлениях и выражали его в процентах от среднего диаметра контрольного образца (Köller et al., 2004). В расчетах не учитывали размер посевного блока.

С помощью пробит-регрессионного анализа (Finney, 1971) определяли 50% эффективную концентрацию – ЭК₅₀, представляющую собой концентрацию дифеноконазола в мг/л, которая ингибировала радиальный рост чистой культуры патогена в два раза. Фактор резистентности (RF) популяции рассчитывали путем деления средних значений ЭК₅₀ агроценотических популяций на среднее значение ЭК₅₀ исходной популяции. Рассчитываемый показатель определяет уровень развития устойчивости (резистентности) к фунгициду в регулярно обрабатываемой им популяции относительно исходной (чувствительной к нему) популяции.

Поиск и апробация единичной оценочной концентрации. Проводилась отработка упрощенного теста на чувствительность к фунгицидам, основанного на относительном росте (RG) чистых культур при единичной оценочной концентрации фунгицида (SAC; Mondino et al., 2015). Для получения значения этой концентрации вычисляли линейные регрессии между ЭК₅₀ и RG исходной популяции (Pop1) при каждой оцениваемой концентрации. Единичная концентрация выбиралась путем визуальной оценки линейного соответствия регрессий и сравнения их коэффициентов детерминации (R²). Концентрация, показавшая самое высокое значение корреляции (R²) между ЭД₅₀ и относительным ростом, считалась наиболее подходящей в качестве SAC. Три популяции V. ina-equalis были дополнительно проанализированы на чувствительность к дифеноконазолу с использованием значений RG в выбранном SAC. Для этого агаровый блок чистой культуры патогена диаметром 5 мм переносили на среду КГА с внесенной в нее SAC дифеноконазола. Посев инкубировали при 20°С в темноте. Через 30 суток измеряли диаметр роста мицелия культуры в двух взаимно перпендикулярных направлениях и выражали его в процентах от среднего диаметра контрольного образца (Köller et al., 2004). В дальнейшем вместо SAC мы стали использовать более употребляемый термин “дискриминационная концентрация”.

Статистическая обработка результатов. Все лабораторные анализы проводили не менее чем в двухкратной повторности. Поскольку размеры выборки отдельных популяций были меньше 50 и не соблюдалось условие нормальности распределения и однородности (гомоскедастичности) дисперсий во всех сравниваемых группах, для сравнения средних значений ЭК₅₀ и RG применяли непараметрическую статистику: тест Краскела–Уоллиса (Kruskal–Wallis rank sum test) для трех отдельных популяций и U-критерий Манна–Уитни (Mann–Whitney U-test) для попарного сравнения популяций в программе Stat. Soft. inc., Statistica Base. Различия считали достоверными при уровне значимости p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка чувствительности изолятов к дифеноконазолу. Общепринято, что изменение чувствительности фитопатогенов к фунгицидам определяют путем установления доли изолятов в популяции, которые проявляют нечувствительность к ним, превышающую показатели, характерные для чувствительных изолятов.

В проведенном исследовании частотное распределение значений ЭК₅₀ (EC₅₀) было логонормальным для всех изученных популяций (рис. 1). На основе теста Краскела–Уоллиса различия между средними значениями ЭК₅₀ для трех исследованных популяций оказались существенными на высоком уровне значимости (P < 0.001). Попарная оценка значимости различий между популяциями с помощью U-критерия Манна–Уитни показала, что среднее значение ЭК₅₀ для первой исходной популяции патогена, никогда не контактировавшей с фунгицидами (Pop1), значительно ниже (P < 0.001), чем средние значения этого показателя для обрабатываемых фунгицидом популяций. При этом различия между популяциями Pop2 и Pop3 оказались значимы на более низком уровне (P < 0.05), что указывает на их большее сходство между собой в чувствительности к исследованному препарату.

Рис. 1.

Распределение значений ЭК₅₀ для дифеноконазола среди изолятов Venturia inaequalis различных популяций.

Ожидаемо наименьшее значение среднего ЭК₅₀ было характерно для более чувствительной исходной популяции Pop1, никогда не контактировавшей с фунгицидами (табл. 2). На гистограмме видно, что вся выборка изолятов дикой популяции компактно представлена в левой части рис. 1. Две другие популяции патогена, испытывавшие влияние дифеноконазола, имели более высокие значения показателя. При этом уровень этих значений различался. Так, фактор резистентности для популяции Pop2 был в 2 раза выше, чем в популяции Pop3.

Размах варьирования показателя ЭК₅₀ позволяет оценить структуру популяции патогена по восприимчивости к фунгициду. Чувствительность исходной популяции (Pop1) к дифеноконазолу варьировала в широком диапазоне значений ЭК₅₀ с фактором разделения 14 (соотношение между наименее и наиболее чувствительным изолятом популяции). Для популяций из агроценозов (Pop2 и Pop3) наблюдалось увеличение амплитуды коэффициента разделения, но в разной степени (табл. 2). Так, для Pop3 происходило почти десятикратное увеличение фактора, что отражает накопление новых менее чувствительных изолятов, отсутствующих в исходной популяции патогена, в то время как для популяции Рор2 – только в два раза. При этом нижняя и верхняя границы диапазона этой популяции были выше, чем у популяции Pop3. В Pop2 отмечено не только возрастание количества относительно устойчивых изолятов, которое было характерно и для предыдущей популяции, но и значительное уменьшение доли чувствительных, чем и обусловлен более низкий уровень фактора разделения, по сравнению с Pop3. Это особенно четко проявляется в сравнениях крайних численных значений диапазона ЭК₅₀. Так, сравнивая крайние значения диапазона ЭК₅₀ Рор3 с исходной популяцией, можно увидеть, что разница между нижними значениями была всего в 3 раза, в то время как в верхних значениях – уже 14. Сравнение популяций Рор3 и Рор2 показывает несколько другую картину изменения структуры их чувствительности. Если разница между самыми высокими значениями диапазона ЭК₅₀ в двух промышленных популяциях была в 2.7 раза, то между наименьшими – 111 раз. На гистограмме это проявляется в увеличении доли изолятов популяции Pop2 в правой ее части (рис. 1).

Определение и апробация дискриминационной концентрации. В рамках проведенного исследования также определена дискриминационная концентрация дифеноконазола для оценки чувствительности V. inaequalis.

Все шесть проверенных концентраций дифеноконазола обеспечивали линейное соответствие между ЭК₅₀ и относительным ростом изолятов (RG) первой исходной популяции (рис. 2). Однако концентрация 0.01 мг д.в./л показала самое высокое значение R² (0.62), поэтому эта концентрация была выбрана в качестве единичной оценочной концентрации. R² – это показатель качества регрессионной модели и чем он выше, тем лучше прогностические свойства модели. R² не может быть больше 1, однако при его значениях меньше 0.5 адекватность такой модели следует ставить под вопрос.

Рис. 2.

Линейные регрессионные зависимости между ЭК₅₀ и относительным ростом мицелия (RG) изолятов базовой популяции Venturia inaequalis, оцененные для шести концентраций дифеноконазола.

Полученные на основе подобранной в нашем исследовании диагностической концентрации значения RG статистически значимо различались (P < 0.001) среди трех изученных популяций (табл. 3). Изоляты с RG ≥ 70% присутствовали только в популяциях патогена Рор2 и Рор3, выделенных из садов с использованием дифеноконазола. Причем уровень устойчивых изолятов по этому показателю был выше в популяции Рор2, по сравнению с Рор3, в 1.8 раза. По средним значениям RG исходная популяция отличалась от популяций Рор2 и Рор3 в 2.8 и 2.4 раза, а между собой они различались только в 1.2 раза. В целом, ранжирование популяций по чувствительности к дифеноконазолу, оцененное с помощью диагностической концентрации и ЭК₅₀, совпало. Исходная популяция была наиболее чувствительной к дифеноконазолу, популяция Рор2 – наименее, в то время как Рор3 заняла промежуточное положение. Таким образом, концентрация дифеноконазола в 0.01 мг/л может быть использована для мониторинга развития к нему устойчивости возбудителя парши яблони в садах Краснодарского края.

ОБСУЖДЕНИЕ

Практика использования фунгицидов DMI, показала, что полевая устойчивость к ним может развиваться и возрастать после нескольких лет их интенсивного использования (Kuck, 2002). По данным Г.В. Якубы, использование препарата Скор, КЭ в течение семи лет для обработки яблони в фенофазы “окончание цветения”, “величина плода лещина” и “величина плода грецкий орех” приводило к постепенному снижению биологической эффективности защиты от парши до 70%, а препарата Импакт, КЭ (д.в. флутриафол) – до 30% (Yakuba, 2013).

В основе резистентности к пестицидам лежит общебиологический принцип приспособления живых организмов. Развитие устойчивости происходит под воздействием фунгицида в результате отбора им резистентных фенотипов и элиминации чувствительных; чем сильнее воздействие токсиканта на патоген, тем интенсивнее протекает отбор. Постепенно происходит снижение его действия на объект борьбы. Как только частота встречаемости таких фенотипов в популяции достигнет достаточно высокой величины, наблюдается потеря эффективности препарата или снижение длительности его токсического действия (Dyakov, 1998). Проследить развитие резистентности к фунгициду в контактирующей с ним популяции можно, оценив ее чувствительность относительно исходной популяции патогена (Cox, 2015).

В нашем исследовании в качестве исходной использовалась популяция V. inaequalis, паразитирующая на дикой яблоне восточной в естественных ее произрастаниях в предгорьях Западного Кавказа. Полученное в текущей работе среднее значение ЭК₅₀ для не испытывавшей воздействие дифеноконазола популяции составило 0.0078 мг/л. Это значение было выше полученного для такого типа популяции из Восточного побережья США – 0.002 мг/л (Villani et al., 2015), но ниже значений для чилийской, уругвайской и немецкой популяций – 0.017, 0.0286, 0.090 мг/л (Kunz, 1998; Henríquez et al., 2011; Mondino et al., 2015). Наиболее близким к полученному результату было среднее ЭК₅₀ для итальянской исходной популяции патогена – 0.0075 мг/л (Fiaccadori, 2017). Как отмечали Виллани и соавторы (Villani et al., 2015), частота изолятов с пониженной чувствительностью к фунгициду в исходной популяции может иметь значение для скорости развития устойчивости к дифеноконазолу в регионе. Изоляты со значением ЭК₅₀ выше среднего для популяции должны иметь более высокую вероятность выживания при применении фунгицида, по сравнению с чувствительными к нему изолятами.

Фактор разделения, показывающий размах вариации значений ЭК₅₀ для оцененной нами исходной популяции, составил 14 и был ниже этого показателя в популяциях из США и Чили (Henríquez et al., 2011; Villani et al., 2015). При этом нами было отмечено увеличение разброса значений ЭК₅₀ в популяциях, контактировавших с дифеноконазолом. Анализ результатов показал, что увеличение размаха этих значений в популяции Рор3 происходило, в основном, за счет возрастания доли устойчивых изолятов, тогда как в популяции Рор2 – за счет снижения количества чувствительных. Такие же особенности были отмечены для двух уругвайских популяций патогена (Mondino et al., 2015). В другой работе фактор разделения в исходной популяции, наоборот, был выше, чем в обрабатываемых популяциях (Henríquez et al., 2011).

В целом, нами было выявлено повышение средних значений ЭК₅₀ в обрабатываемых популяциях, по сравнению с исходной, показывающее снижение чувствительности к фунгициду. Так, для популяции Рор2 оно составило 0.2500 мг/л, а для Рор3 – 0.1242 мг/л. Степень снижения или сдвиг чувствительности популяции, испытывающих фунгицидный прессинг, относительно исходной, выражают в виде показателя резистентности (RF). Ожидаемо он для второй популяции оказался выше, чем для третьей, составив 32 и 16 соответственно. Сдвиг чувствительности в популяциях, контактировавших с фунгицидом, был показан во многих исследованиях. Показанные нами RF оказались на уровне или выше продемонстрированных в ряде работ: 4.7 (Henríquez et al., 2011); 6.6 и 11.74 (Mondino et al., 2015); 9.2 и 24.0 (Fiaccordi, 2017).

Какие-то конкретные величины RF не являются условием того, что популяция будет устойчива. Для выявления такой величины в каждом случае для определенного фунгицида необходимо сопоставление реальной его эффективности в саду с показателем RF. В исследованных нами садах ранее проведенная оценка эффективности дифеноконазола в течение семи лет использования показала снижение его токсического действия с 15 суток до пяти–шести суток (Yakuba, 2013), что проявилось в полученных нами значениях коэффициента резистентности, показывающего значительное увеличение доли устойчивых фенотипов в краснодарской популяции V. inaequalis. Между тем, сокращение интервалов между опрыскиваниями фунгицидом позволяет поддерживать его эффективность на достаточном уровне для контроля заболевания: около 90%. В опытном саду Нью-Йоркской сельскохозяйственной экспериментальной станции, который характеризовался стабильной практической устойчивостью к миклобутанилу, дифеноконазол обеспечивал высокий уровень контроля парши (> 90%) после четырех ежегодных применений фунгицида в течение семи лет (Cox et al., 2008). Смит и соавторы (Smith et al., 1991) сообщали, что потеря активности фунгицидов группы деметилирования стеринов в популяциях возбудителя парши яблони происходила при RF более 3, однако это не касалось дифеноконазола. Предполагается, что устойчивость некоторых DMI-фунгицидов является количественной или дозозависимой, например, дифеноконазол и фенбуконазол обладают более высокой внутренней активностью в отношении V. inaequalis, чем флутриафол или миклобутанил (Cox, 2015).

Отличия в значениях RF полученные нами для двух “фунгицидных” популяций, могут быть обусловлены различиями в агротехнических характеристиках садов, в которых они отбирались. Так популяция Pop2, которая имела наибольший сдвиг чувствительности, была отобрана из более старого сада с менее плотной схемой посадки. Такие характеристики сада могут иметь более высокие риски развития резистентности патогена к фунгициду в силу более длительного контакта его популяции с ним и меньшей технологичности при обработке препаратом деревьев большего размера. В исследованиях американских ученых была показана зависимость между возрастом сада и уровнем сдвига чувствительности возбудителя парши яблони к фунгицидам DMI (Pfeufer, Ngugi, 2012).

Мониторинг устойчивости к фунгицидам на основе значений ЭК₅₀ очень трудоемок и предполагает проверку чувствительности большого количества изолятов к нескольким концентрациям пестицида, что затрудняет использование данного подхода для широкого скрининга признака в промышленных садах. В связи с этим в ряде исследований был использован упрощенный тест на чувствительность, основанный на относительном росте мицелия (RG) на дискриминантной дозе фунгицида (Köller et al., 1991; Smith et al., 1991; Seyran et al., 2010). Величина RG позволяет оценивать чувствительность к фунгицидам у штаммов V. inaequalis с использованием всего одной концентрации антимикотика. На данный момент не существует определенного стандартизированного метода выбора подходящей единичной концентрации (дискриминантной дозы) для выявления устойчивых штаммов в популяции. В первых исследованиях с использованием дискриминантной концентрации таковой считали концентрацию, близкую, но немного превышающую, среднее значение ЭК₅₀ базовой популяции (Köller et al., 1991; Smith et al., 1991). В работе Мондино и соавторов (Mondino et al., 2015) единичная оценочная концентрация (SAC) определялась путем подбора линейной регрессии между ЭК₅₀ и RG изолятов при каждой концентрации и оценки соответствия линий регрессии. С использованием второго подхода нами была определена концентрация 0.01 мг д.в./л, имевшая самый высокий показатель качества регрессионной модели – R². Полученная концентрация была близка к среднему значению ЭК₅₀ изученной нами исходной популяции, немного его превышая. Таким образом, она соответствовала величине при эмпирическом подборе в первом подходе.

В научной литературе сообщается о более высоких значениях дискриминационной концентрации, чем были получены нами. Так, Хенрикес и соавтоы (Henrıquez et al., 2011) предложили концентрацию 0.04 мг д.в./л, а Мондино и соавторы (Mondino et al., 2015) – 0.05 мг д.в./л. Разные авторы называют описанную выше дозировку для оценки чувствительности к фунгицидам: дискриминационной дозой (DD), единичной оценочной (SAC) или мониторинговой концентрациями (Köller et al., 1991; Smith et al., 1991; Seyran et al., 2010; Henrıquez et al., 2011). Как резонно отмечают Мондино и соавторы (Mondino et al., 2015), этот подход не позволяет определить критические значения чувствительности, обусловленные нарушением контроля патогена, и используемые концентрации не являются по сути дискриминационными. Однако сопоставление результатов чувствительности in vitro с данными полевой устойчивости дает необходимую информацию для выбора дискриминационного порога. В качестве такого порога нами было выбрано значение RG в 70%. Это значение позволило разделить изученные популяции по чувствительности к фунгициду. В исходной популяции изоляты с RG > 70% не встречались, тогда как доля таких изолятов в “фунгицидных” популяциях составила 97% для популяции Pop2 и 54.7% для популяции Pop3 (табл. 3). Сходные результаты при этом пороге получили уругвайские исследователи: доля изолятов с RG > 70% в двух коммерческих садах составляла 39.4 и 63.6% (Mondino et al., 2015). То же пороговое значение ранее использовали Пфейфер и Нгуги (Pfeufer, Ngugi, 2012). Кёллер и соавторы (Köller et al., 1997), используя более высокий функциональный порог (RG = 80%), наблюдали увеличение доли устойчивых изолятов в садах с практической резистентностью к DMI фунгицидам в сравнении с эффективно контролируемой популяцией.

Проведенное нами исследование показало снижение чувствительности популяций возбудителя парши из промышленных насаждений яблони в двух точках Краснодарского края, в сравнении с базовой чувствительностью дикой популяции патогена, собранной в предгорьях Западного Кавказа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые для Краснодарского края в экспериментах in vitro путем оценки показателя ЭК₅₀ была оценена чувствительность исходной популяции возбудителя парши яблони. В 2019–2020 гг. установлено развитие резистентности к дифеноконазолу в популяциях V. inaequalis из промышленных садов относительно исходной популяции, благодаря увеличению в них доли резистентных фенотипов. Предложена дискриминационная концентрация этого фунгицида, основанная на анализе относительного роста (RG) мицелия гриба, которая позволяет упростить мониторинг чувствительности V. inaequalis к дифеноконазолу в садах: 0.01 мг д.в./л. Получены сопоставимые результаты использования значений ЭК₅₀ и RG при этой дискриминационной дозе. Повышение доли изолятов V. inaequalis со сниженной чувствительностью к дифеноконазолу согласуется с данными мониторинга его эффективности в саду, которая снизилась с 99 до 90% за семилетний период использования фунгицида. Также имеются данные об уменьшении периода его токсического действия до пяти–шести суток. Проведенное исследование показывает необходимость дальнейшего мониторинга чувствительности к дифеноконазолу более значительного объёма популяции возбудителя заболевания в садах Краснодарского края.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 19-416-230070 р_а, в рамках государственного задания № АААА-А19-119051490016-9.