Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 2, стр. 86-95

ВВЕДЕНИЕ

Нетронутые природные экосистемы – это островки дикой природы, все компоненты которых взаимодействуют друг с другом. Черневая тайга – уникальная высокопродуктивная бореальная экосистема Западной Сибири (Lapidus, 2021), которую можно охарактеризовать как высокопродуктивное бореальное образование, ограниченное в своем распространении гипергумидными секторами нагорий, формирующихся в уникальных комбинациях биоклиматогенных и геогенных условий (Аbakumov et al., 2020).

Черневая тайга включена в проект “Global 200”, цель которого выявить совокупность наземных, пресноводных, морских экотопов и регионов с исключительным биоразнообразием (Olsson et al., 2005). Аккумуляция биофильных элементов является важнейшим свойством почв черневой тайги, с которым связан феномен гигантизма и крайне высокой продуктивности. Высокая интенсивность биологических процессов объясняется локальными гидротермальными и климатическими условиями, а также функциональной структурой сообществ живых организмов (Аbakumov et al., 2020). Особенности черневой тайги связаны не только с климатическими условиями и почвенными характеристиками данной территории, но и с уникальными микробными сообществами, обнаруженными в почве и ризосфере растений (Rayko et al., 2021).

Рост и развитие растений тесно связано с почвенной микробиотой, которая поддерживает гомеостаз почвы, выполняя ключевые функции и активно участвуя в углеродном цикле. Органическое вещество почвы формируется преимущественно за счет активности микробного компонента (Simpson et al., 2007; Kleber, Johnson, 2010), а комплексы микромицетов играют заметную роль в этих процессах (Kevin et al., 2007).

Данное исследование – первая попытка анализа комплексов культивируемых почвенных микромицетов уникальных биоценозов черневой тайги.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Отбор образцов. Сбор материала для микологического исследования проводили в июле–августе 2019 г. в Новосибирской и Томской областях. Почвенные пробы были представлены: 1) N1 – темно-серой почвой черневой тайги (Новосибирская обл.); 2) N2 – стратоземом темногумусовым (Новосибирская обл.); 3) N3 – серогумусовой почвой на эоловых супесях (референтная почва олиготрофных сосняков, Новосибирская обл.); 4) T1 – темно-серой почвой черневой тайги (Томская обл.); 5) Т2 – дерново-подзолистой почвой черневой тайги (Томская обл.); 6) T3 – дерново-элювоземом (референтная почва олиготрофных сосняков, Томская обл.). Пробы отбирали из верхних горизонтов почвы в биоценозах, которые не подвергались антропогенному воздействию. Детальная характеристика почвенных проб представлена в публикации Е.В. Абакумова с соавторами (Abakumov et al., 2020).

Выделение чистых культур грибов. Для получения чистых культур грибов использовали общепринятый метод серийных разведений с последующим высевом почвенной суспензии на агаризованные среды Чапека и Сабуро в 10-кратной повторности (Raper, Thom, 1949; Bilay, 1982). Культивирование проводили при температурах 20°С и 5°С, в темноте. Для подавления роста бактерий в питательные среды добавляли антибиотик широкого спектра действия левомицетин (100 мг/л).

Идентификация изолированных культур микроскопических грибов. Чистые культуры были идентифицированы на основании культурально-морфологических признаков (Domsch et al., 2007 и др.) и/или результатов молекулярных исследований. Культуры, используемые для молекулярных исследований, выращивали на среде Чапека при 20°С в течение 14 дней. ДНК из чистых культур грибов выделяли с использованием коммерческого набора DiamondDNA Plant kit (ABT, Барнаул, Россия), согласно инструкции изготовителя. В качестве филогенетического маркера была использована последовательность региона ITS (White et al., 1990). Последовательность ITS1–5.8S–ITS2 амплифицировали с использованием праймеров ITS1 (5'-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-TGC-GG-3') и ITS4 (5'-TCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC-3'). По окончании амплификации проводили детекцию образцов электрофоретическим методом в 1.5%-м агарозном геле с GelRed. Секвенирование полученных фрагментов ДНК проводили с использованием оборудования ЦКП “Геномные технологии, протеомика и клеточная биология” ФГБНУ ВНИИСХМ методом Сэнгера. Последовательности были проверены и выровнены с использованием программы Mega7. Анализировали данные с помощью программы поиска Blast в GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Для универсального региона ITS были выбраны критерии идентичности, предложенные Годинье с соавторами (Godinho et al., 2013). Если идентичность последовательности региона ITS составляла ≥98%, то считали, что изолят принадлежит данному виду. Если данный показатель находился между 95 и 97%, то считали, что изолят принадлежит данному роду. Полученные нуклеотидные последовательности генов были депонированы в базе данных GenBank под номерами доступа (табл. 2). Названия и положение таксонов микроскопических грибов унифицировали с использованием базы данных Index Fungorum (2021).

Характеристика комплексов микромицетов. Подсчет колоний проводили через 10–15 дней культивирования при 20°С, и через 30 дней культивирования при температуре 5°С. Данные по численности микромицетов, полученные методом посева, выражали в колониеобразующих единицах на 1 г абсолютно-сухой почвы (КОЕ/г).

Определение биомассы микроорганизмов в почве проводили методом люминесцентной микроскопии. Применяли метод Звягинцева (Zvyagin-tsev, 1991), но в качестве люминесцентного красителя был выбран солофенил. Его использование дает более надежные результаты по сравнению с традиционно применяемым красителем калькофлором (Hoch et al., 2005). Учет грибных пропагул осуществляли при просмотре препаратов в люминесцентном микроскопе Zeiss Axioskop (Германия) при увеличении ×400. При расчете грибной биомассы (мг/г почвы) считали, что плотность спор равна 0.837 г/см³, а плотность мицелия – 0.628 г/см³ (Polyanskaya, Zvyagintsev, 2005). Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакета статистических программ EstimateS9.10, MS Excel 2007 и Statistica 10.0.

Для оценки ожидаемого числа видов в области исследования использовали подход, основанный на алгоритме генерации выборки (Colwell et al., 2012; Shitikov et al., 2011). Для расчета ожидаемого числа видов в генеральной совокупности, из которой была сделана выборка, применяли скорректированный индекс Chao1 (индекс с поправкой на смещение), который рассчитывали на основе регистрации количества видов, представленных одним изолятом. Для этого расчета использовали некоммерческую программу “EstimateS 9.10” (Colwell, 2014).

Разнообразие видов (альфа-разнообразие) оценивали с помощью индекса разнообразия Шеннона: H' = $ - \sum {{{{\text{P}}}_{{\text{i}}}}} $ × lnP_i, где P_i – относительная численность определенного вида (доля от общего числа изолятов этого вида). В процессе микологического анализа рассчитывали встречаемость в образцах и относительное обилие изолятов всех видов (Magurran, 2004).

Определение ферментативной активности. Наличие лигнинолитических ферментов у микромицетов определяли экспресс-методом (по интенсивности появления коричневого окрашивания среды при росте на среде МЕА с танином). Контролем служили культуры, выращенные на данной среде без добавления танина (Bilay, 1982). Наличие амилолитической активности определяли на среде, содержащей 0.5% крахмала (Bruslik et al., 2014). Способность к разложению целлюлозы оценивали визуально по наличию роста чистых культур на среде Гетчинсона (г/л): K₂HPO₄ – 1; CaCl₂ – 0.1; MgSO₄ – 0.3; NaCl – 0.1; FeCl₃ – следы; NaNO₃ – 2.5; агар – 20, обеззоленный целлюлозный фильтр, т.е. по способности грибов использовать целлюлозу в качестве единственного источника органических веществ (Bilay, 1982). При визуальной оценке градации ферментной активности считали культуры высокоактивными (+++), если зона изменения окраски питательной среды превышала радиус колонии более чем на 20 мм; умеренно активными (++), если эта зона составляла 10–20 мм, а слабоактивными (+) – менее 10 мм. Оценку проводили при диаметре колонии 30–35 мм. При оценке роста микромицетов на среде Гетчинсона считали культуры высокоактивными (+++), если рост колонии в течение 2 недель охватывал 70–100% поверхности чашки Петри, умеренно активными (++), если рост колонии охватывал 40–70% поверхности чашки, а слабоактивными (+), если рост колонии охватывал до 40% поверхности чашки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Микологический анализ образцов почв черневой тайги и референтных олиготрофных сосняков методом посева на питательные среды показал колебание численности микромицетов от 2 до 34 тыс. КОЕ/г (табл. 1). При использовании метода прямого микроскопирования данный показатель заметно возрастал и колебался от 3.2 до 26.2 млн КОЕ/г (увеличение численности может быть связано с наличием некультивируемых форм, а также с присутствием не только живых структур микромицетов). Биомасса грибов в изученных почвах черневой тайги колеблется от 0.082 до 0.965 мг/г почвы, тогда как в референтных почвах этот показатель был значительно ниже и составлял от 0.07 до 0.117 мг/г. Это примерно соответствует биомассе грибов в почвах сибирской тайги (Nikitin et al., 2019). В образце Т2, дерново-подзолистая почва черневой тайги (Томская обл.), грибная биомасса была наибольшей, тогда как наименьшее ее содержание отмечено в образцах серогумусовой почвы олиготрофных сосняков (Новосибирская обл.).

Максимальная длина мицелия определена в дерново-подзолистой почве черневой тайги Томской обл., где она составляла около 120 м/г почвы. При этом средний показатель длины мицелия в изученных пробах оказался значительно ниже (колебался от 6 до 46 м/г).

Доля мицелия в грибной биомассе составляла от 8 до 44%. Наибольшая доля мицелия отмечена в образце T2, что свидетельствует об активной жизнедеятельности микроскопических грибов в почве данного типа. Таким образом, численность и биомасса микроскопических грибов в почвах черневой тайги была существенно выше, чем в референтных почвах олиготрофных сосняков, что характерно для обеих исследованных областей.

Видовой состав культивируемых грибов в почвах черневой тайги оказался довольно разнообразным. Из исследованных проб в чистую культуру было выделено более 100 изолятов мицелиальных и дрожжевых грибов, которые были отнесены к 39 видам из 24 родов (табл. 2). Число видов микромицетов в изученных образцах колебалось от 8 до 16. Представителей Mucoromycota и Basidiomycota можно рассматривать как минорный компонент общего видового комплекса культивируемых почвенных грибов. Базидиомицеты были представлены дрожжевым грибом из рода Rhodotorula, а мукоровые – родами Mucor и Umbelopsis.

Наибольшим видовым разнообразием характеризовались роды Penicillium (10 видов) и Cladosporium (3 вида). Остальные роды были представлены одним-двумя видами. Аскомицет Pseudogymnoascus pannorum, который обычно доминирует в арктических почвах (Kirtsideli et al., 2014), представлен отдельными находками, однако близкие к нему виды P. roseus и Geomyces vinaceus были выявлены как в почвах черневой тайги, так и в референтных почвах олиготрофных сосняков.

Виды родов Aspergillus и Cladosporium, которые в северных почвах могут быть характерны для антропогенных местообитаний, отмечены только единично. Следует отметить, что в почвах черневой тайги темноокрашенные (меланизированные) грибы характеризуются только единичными находками. При этом достаточно обильны светлоокрашенные стерильные формы мицелия. Использование различных питательных сред для выделения почвенных грибов не показало существенных различий по составу изолированных микромицетов.

Как видно из графика и расчета максимального среднего значения индекса Chao1 для кривой накопления видов (рис. 1), в изученных образцах нами выявлены практически все ожидаемые виды для данной выборки в темно-серых почвах черневой тайги Новосибирской обл. (N1) (Chao1 = 20.5 ± ± 1.29; 20 видов; Н – 2.65; D – 10.7), а также в стратоземных темногумусовых почвах (N2) и серогумусовых референтных почвах олиготрофных сосняков (N3) Новосибирской обл.

Рис. 1.

Результаты бутстреп-анализа для оценки полноты выявления видов в р-нах исследования в зависимости от числа изолятов. Тонкие линии показывают средние значения индекса Chao1 (ожидаемое число видов) по мере увеличения числа изолятов, сплошные линии – сглаженные кривые разрежения (individual-based rarefaction curve) в зависимости от числа выявленных изолятов.

В меньшей степени оказался выявлен видовой состав грибов в темно-серой почве черневой тайги Томской обл. (Т1) (Chao1 = 15.6 ± 0.54; 15 видов; Н – 2.53; D – 11.02), хотя для комплексов микромицетов в пробах дерново-подзолистых почв черневой тайги (Т2) и дерново-элювоземных почв сосняков (Т3) (Томская обл.) выявлены практически все ожидаемые виды.

Всего в почвах черневой тайги выявлено 29 видов культивируемых микромицетов, а в референтных почвах олиготрофных сосняков – 18 видов. Только в почвах черневой тайги отмечены виды Cephalotrichum microsporum, C. nanum, Cordyceps farinosa, Penicillium dierckxii, P. purpurescens, Trichoderma viride. Отметим, что виды рода Trichoderma способны ограничивать распространение патогенных микроорганизмов (Kandula et al., 2015). Большинство видов рода Cephalotrichum встречается на растительных остатках, древесине и в почве. Выявленный нами C. microsporum, ранее известный как Doratomyces microsporus, предпочитает влажные целлюлозосодержащие субстраты (Domsch et al., 2007; Flannigan et al., 2011; Woudenberg et al., 2017). Вид Cordyceps farinosa (Isaria farinosa, Paecilomyces farinosus) известен как энтомопатогенный гриб, способный к паразитизму на личинках Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera и других насекомых (An, 2003; Yanhua et al., 2008), в том числе вызывает гибель лесных чешуекрылых и пилильщиков в регионах Новосибирской области в Прибайкалье (Kryukov et al., 2011). Виды рода Penicillium (Р. dierckxii, P. purpurescens) космополиты, распространенные от Арктики до тропиков (Domsch et al., 2007).

Результаты исследования ферментативной активности микромицетов из почв черневой тайги и олиготрофных сосняков (табл. 3) показали, что лигнинолитические ферменты продуцируют только 15% полученных штаммов. Среди них оказались представители Aspergillus sp., Cosmospora butyri, Coniochaeta boothii, Gymnostellatospora japonica из почв черневой тайги, а также G. japonica из референтных почв олиготрофных сосняков. Амилазная активность отмечена для 87% полученных штаммов. Способность разлагать целлюлозу зафиксирована у 81% штаммов. Степень лигнинолитической и амилазной активности может незначительно варьировать у различных штаммов одного вида, выделенных из различных типов почв, что было показано для Penicillium spinulosum, Pseudogymnoascus roseus, Umbelopsis vinacea.

Таким образом, изученные микромицеты способны играть заметную роль в разложении целлюлозы и полисахаридов в почвах черневой тайги. Большинство полученных штаммов характеризуется высокой и средней амилазной и целлюлозолитической активностью. При этом лишь сравнительно небольшая доля микромицетов может рассматриваться как деструкторы лигнина. Наиболее широкий спектр ферментативной активности показали штаммы Aspergillus sp., Cosmospora butyri и Gymnostellatospora japonica.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований получены новые данные о микобиоте почв черневой тайги Западной Сибири. Показано изменение численности, биомассы и видового состава почвенных микроскопических грибов в зависимости от трофности почв. Показатели грибной биомассы в изученных почвах черневой тайги колеблются от 0.082 до 0.965 мг/г почвы, тогда как в референтных почвах олиготрофных сосняков эти показатели были ниже и составляли от 0.07 до 0.117 мг/г. Всего выделено и идентифицировано 39 видов микромицетов, причем в почвах черневой тайги выявлено 29 видов, а в почвах олиготрофных сосняков – 18 видов. Видовой состав микромицетов, обнаруженных в почвах черневой тайги, заметно отличается от состава комплексов микромицетов олиготрофных сосняков. Только в почвах черневой тайги отмечены виды Cephalotrichum microsporum, C. nanum, Cordyceps farinosa, Penicillium dierckxii, P. purpurescens, Trichoderma viride. Большая часть полученных штаммов характеризуется способностью к разложению целлюлозы и полисахаридов, тогда как лишь некоторые из них могут рассматриваться как деструкторы лигнина. Очевидно, что разнообразие и биохимическая активность почвенных грибов, как и других микроорганизмов (Tichonova et al., 2019), связаны с функционированием растительных сообществ черневой тайги. Почвенные микромицеты способны играть заметную роль в интенсивности биологического круговорота, оказывая влияние на продуктивность почв в уникальных экосистемах черневой тайги.

В работе использовано оборудование ЦКП “Геномные технологии, протеомика и клеточная биология” ФГБНУ ВНИИСХМ (Санкт-Петербург) и ЦКП “Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов” Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург). Исследование проведено при финансовой поддержке РНФ (проект № 19-16-00049).