Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 3, стр. 185-193

ВВЕДЕНИЕ

Благодаря пластичности метаболических процессов микроскопические грибы способны использовать в качестве источников питания не только природные, но и различные синтетические материалы и изделия из них. Для таких грибов часто используется термин “технофилы” (Alyokhova et al., 2005). Вне всякого сомнения, обмен веществ у технофильных грибов отличается от обмена почвенных микроорганизмов, питающихся классическими субстратами. Технофильные грибы способны быстро адаптироваться к постоянно появляющимся современным материалам и средствам их защиты. Особенно быстро процессы адаптации происходят в регионах с теплым и влажным климатом.

В связи с этим возникает потребность в изучении особенностей метаболизма микроскопических грибов, участвующих в процессах биоповреждений промышленных материалов и изделий из них.

Известно, что основными экзометаболитами грибов, принимающих участие в процессе биодеградации полимерных материалов, являются экстрацеллюлярные ферменты, главным образом, оксидоредуктазы и гидролазы (Sukharevich et al., 2009; Covino et al., 2016). Оксидоредуктазы (каталазы, пероксидазы, фенолоксидазы) участвуют в биодеградации промышленных материалов на основе лигноцеллюлоз и ряда пластиков (Couto, Toca-Herrera, 2006; Zamocky et al., 2009; Cázares-García et al., 2013; Makarov et al., 2019). Среди гидролаз в последнее время значительное внимание уделяется протеолитическим ферментам грибов. Это связано с тем, что кроме природных промышленных материалов (кожа, шелк, шерсть и др.) данные энзимы способны участвовать в биодеградации ряда синтетических полимеров, содержащих амидные связи: полиамиды, полимочевины и др. (Shah, 2008; Parvinzadeh et al., 2009; Parvinzadeh et al., 2013; Covino et al., 2016; Shamraychuk et al., 2020). Кроме того, известно, что микробные протеазы обладают эстеролитической и амидазной активностью, что расширяет круг промышленных материалов, в деградации которых они могут участвовать (Rao et al., 1998; Pavlyukova et al., 1998; Sanket et al., 2017).

Выявление экзоферментов у грибов-деструкторов, а также количественная оценка их активности позволит прогнозировать возможные механизмы биодеградации материалов и изделий при их эксплуатации, а также целенаправленно и эффективно осуществлять подбор средств защиты (биоцидных препаратов) изделий от биоповреждений, вызываемых микроскопическими грибами (Tsymbal et al., 2013; Zalepkina et al., 2018). Как в России, так и за рубежом арсенал биоцидных средств постоянно претерпевает изменения. Это происходит по ряду причин: экономических (высокая цена, нерентабельность производства, закрытие производства), биологических (появление штаммов микроорганизмов, устойчивых к биоцидным препаратам) и санитарно-гигиенических (негативное влияние на окружающую среду, трансформация биоцидов до высокотоксичных в отношении человека соединений в процессе эксплуатации защищаемых изделий под влиянием климатических факторов).

Необходимо знать механизм ингибирующего действия фунгицидов, что позволит более эффективно осуществлять их подбор и целенаправленное применение, т.к. необходимо в поражаемый грибами материал вводить тот биоцид, который в наибольшей степени подавляет метаболиты грибов, участвующих в биодеструкционных процессах (Tsymbal et al., 2013; Eswayah et al., 2016; Makarov et al., 2019). В наибольшей степени процесс биоповреждений материалов и изделий происходит в условиях тропиков и субтропиков, где наиболее благоприятные условия для роста и развития грибов (Smirnov et al., 2020).

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы было изучение активности некоторых экзоферментов грибов, участвующих в биоповреждении технических изделий в условиях тропического климата (Вьетнам), а также исследование действия ряда биоцидов на активность данных энзимов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Активность ферментов определяли у 20 штаммов мицелиальных грибов, выделенных из участков биоповреждений технических изделий, эксплуатируемых в условиях тропического климата (Вьетнам). В основном грибы выделяли с поврежденных синтетических материалов, используемых для защиты технических изделий – это лакокрасочные покрытия, пластиковые оплетки проводов и пр. Выделение микроскопических грибов проводили общепринятыми методами с рассевом на агаризованные питательные среды. Полученные чистые культуры грибов проверяли на способность к росту на различных материалах (лакокрасочные покрытия, резины, герметики). Для этого на поверхность испытуемых материалов наносили водную суспензию спор грибов (концентрация спор 10⁶/мл) и экспонировали при температуре 29°С и влажности 95% в течение 28 суток. По окончании экспозиции оценивали степень зарастания, наличие спороношения. Было проверено 92 штамма грибов, 20 наиболее активных штаммов были отобраны для данного исследования.

Идентификация чистых культур грибов до вида осуществлялась на основе культурально-морфологических и физиологических признаков микромицетов с использованием соответствующих определителей, а также с помощью генно-молекулярных методов по анализу участков ITS1, ITS2 ДНК. Для некоторых культур дополнительно секвенировали участки регионов ДНК, кодирующих гены кальмодулина (CaM) и бета-тубулина (BenA), и рекомендуемых в качестве вспомогательных видовых маркеров при идентификации и филогении. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 31301 Genetic Analyzer в Научно-производственной компании ЗАО “Синтол” (Москва). Современное таксономическое положение видов проверяли по базам данных www.indexfungorum.org и http://www.mycobank.org. Данные грибы были депонированы во всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) (табл. 1).

Культивирование микроскопических грибов проводили на полной питательной среде Чапека– Докса следующего состава (г/л): K₂HPO₄ – 0.3; KH₂PO₄ – 0.7; NaNO₃ – 2.0; KCl – 0.5; MgSO₄ – 0.5; FeSO₄ – 0.01; сахароза – 20.0. В колбы Эрленмейера емкостью 500 мл вносили по 250 мл среды указанного состава и осуществляли посев микромицетов. Колбы помещали на качалки АПУ-4м (120 об./мин). Грибы культивировали в темноте при температуре 27 ± 2°C в течение 7 суток.

В качестве биоцидных средств использовали ряд препаратов, применяемых для биозащиты технических изделий: Биор-1 (производное полигексаметиленгуанидина), Bioneutral A 10 (производное изотиазола), Bioneutral A 101 (производное изотиазола и бронапола).

Фунгицидную активность химических соединений определяли экспериментально и рассчитывали по формуле Эббота (Andreeva, 1984). Концентрации биоцидов подбирались экспериментально и составляли: 0.01% для Биор-1; 0.005% и 0.0025% для Bioneutral A 101 и Bioneutral А 10, соответственно. Биоциды вводили в среду культивирования на четвертые сутки.

Активность оксидоредуктаз определяли в культуральной жидкости (КЖ) гриба спектрофотометрически (UV mini-1240 – Shimadzu, Япония): каталазную – по убыли пероксида водорода (Н₂О₂) при λ = 240 нм (Li et al., 2007), фенолоксидазную активность по окислению n-фенилендиамина (λ = 535 нм) в присутствии Н₂О₂ (Flukey et al., 2016). Активность данных ферментов выражали в условных единицах. За единицу активности (ед.) каждого из перечисленных ферментов принимали изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин в пересчете на 1 мг белка.

Определение протеолитической активности грибов проводили по методу Ансона (Bilay, 1982). Метод основан на способности белков и продуктов их ферментативного расщепления поглощать свет в УФ-области спектра (при λ = 275–280 нм). Удельную активность выражали в мкМ тирозина/(мг белка × ч).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экзооксидоредуктазы мицелиальных грибов (каталаза и фенолоксидаза) способны принимать участие в биодеструкции полимерных материалов и изделий из них (Kasatova et al., 2017; Smirnov et al., 2020). В табл. 2 представлены результаты исследования активности каталазы и фенолоксидазы грибов, выделенных с поврежденных технических изделий.

Известно, что основным механизмом действия каталазы является разрушение пероксида водорода до воды и кислорода. Многие полимерные композиции в качестве ингредиентов содержат неорганические и органические перекиси, кроме того, пероксид водорода является одним из вторичных метаболитов грибов, который выделяется ими во внешнюю среду. Образующийся в результате действия каталазы кислород чрезвычайно реакционноактивен и способен окислять как органические соединения, так и металлы. Все это приводит к существенным изменениям структуры и состава материалов, т.е. к процессу их биодеградации (Shah, 2008; Anikina et al., 2016). Активность каталазы была обнаружена у 19 штаммов грибов из 20. Каталазная активность отсутствовала у гриба Aspergillus pseudonomiae ВКМ F-4818D. Максимальная каталазная активность была отмечена для грибов Fusarium oxysporum ВКМ F-4834D, Aspergillus terreus ВКМ F-4827D, Aureobasidium melanogenum ВКМ F-4828D и Cladosporium subuliforme ВКМ F-4831D.

Фенолоксидаза грибов играет важную роль в разрушении материалов на основе фенольных, фенолформальдегидных смол, фенопластов, материалов на основе древесины и др. Активность фенолоксидазы была обнаружена у 18 штаммов грибов из 20. У грибов Fusarium oxysporum ВКМ F-4834D и Aureobasidium melanogenum ВКМ F-4828D фенолоксидазная активность отсутствовала. Максимальная фенолоксидазная активность была отмечена для грибов Cladosporium tenuissimum ВКМ F-4832D и Zasmidium citri-griseum ВКМ F-4830D.

Как уже отмечалось выше, важная роль в биоповреждении многих полимерных материалов микромицетами принадлежит микробным экзопротеазам. Обладая широкой субстратной специфичностью, данные энзимы способны участвовать не только в деструкции материалов, содержащих амидную (пептидную) связь, но и в деструкции полиакриламидов и полиэфиров (Parvinzadeh et al., 2009; Parvinzadeh et al., 2013; Sanket et al., 2017). В работах подробно рассматривается механизм биодеструкции ряда полиамидов микробными протеазами. Авторами отмечается, что протеазы предпочтительно атакуют полиамидные связи в середине полимерных цепей и последовательно продуцируют концевые группы аминов и карбоновых кислот. Действие протеаз не ограничивается только поверхностью полимеров, они способны проникать внутрь волокна, вызывая потерю веса.

В табл. 3 представлены результаты исследований протеазной активности выделенных нами штаммов грибов-деструкторов.

Активность протеаз обнаружена у 8 штаммов из 20 исследованных грибов, из которых у 3 штаммов: Aspergillus tubingensis ВКМ F-4822D, Aureobasidium melanogenum ВКМ F-4828D, Cladosporium subuliforme ВКМ F-4831D обнаружены только кислые протеазы, у 5 штаммов – щелочные протеазы: Alternaria alternata ВКМ F-4817D, Zasmidium citri-griseum ВКМ F-4830D, Cladosporium tenuissimum ВКМ F-4832D, Curvularia lunata ВКМ F-4833D и Fusarium oxysporum ВКМ F-4834D.

Максимальная активность щелочных протеаз была отмечена у грибов Zasmidium citri-griseum штамм ВКМ F-4830D и Cladosporium tenuissimum ВКМ F-4832D, максимальная активность кислой протеазы у гриба Aureobasidium melanogenum ВКМ F-4828D.

Таким образом, наличие протеазной активности у исследуемых штаммов грибов позволяет считать их потенциально опасными для материалов и изделий из них, содержащих амидную связь.

Следует также отметить, что у всех грибов, у которых была обнаружена протеазная активность, также в определенной степени проявлялась и активность оксидоредуктаз, что позволяет предположить участие данных грибов в биодеструкции более широкого круга материалов, используемых в технических изделиях. В наших экспериментах, исходя из поставленной цели исследования, мы изучали общую активность вышеуказанных ферментов. Это весьма важно с точки зрения прикладной биохимии и микробиологии в плане оценки деструктивной активности микромицетов, рост которых обнаружен на технических изделиях в условиях Вьетнама.

Анализ биохимических экспериментов по оценке активности ферментов показывает, что каждый из штаммов грибов, выделенных с технических изделий, обладает своим, отличным от других, метаболизмом. Исходя из этого, можно предположить, что процессы биодеструкции конкретных материалов и изделий из них в определенной степени зависят и от состава микромицетов-деструкторов. Следовательно, и подбор средств защиты конкретных материалов должен осуществляться на основе учета особенностей метаболизма грибов – активных биодеструкторов.

Влияние ряда биоцидов на активность исследованных нами экзоферментов грибов (каталазы, фенолоксидазы, протеазы) было изучено в серии экспериментальных исследований. Использовали биоциды Биор-1, Bioneutral A10 и Bioneutral A101, широко применяющиеся как для внешней защиты изделий, так и входящие в состав различных материалов и технических изделий.

Результаты воздействия исследуемых биоцидов на активность каталазы и фенолоксидазы тест-культур грибов представлены в табл. 4 и 5. Контролем служил вариант экспериментов на среде без биоцидов (табл. 2). Процент активности фермента по отношению к контролю при введении в среду культивирования грибов того или иного биоцида указан в таблицах в скобках.

Результаты биохимических исследований показали, что все биоциды являются ингибиторами активности внеклеточной каталазы большинства штаммов грибов, выделенных с технических изделий. Для двух штаммов (Aspergillus tubingensis ВКМ F-4823D и A. terreus ВКМ F-4826D) отмечено повышение активности каталазы при воздействии биоцидов Bioneutral A10 и Bioneutral A101. Отдельно стоит отметить гриб A. pseudonomiae ВКМ F-4818D. У данного штамма не была обнаружена каталазная активность в условиях контрольного эксперимента, однако, при введении биоцида Bioneutral A 10, этот фермент был обнаружен в культуральной среде и его активность составила 13.02 у.е.

Различия ответной реакции на воздействие биоцидов проявлялось на штаммовом уровне, показатели значительно различались даже внутри одного вида. Это еще раз подтверждает тот факт, что каждый из имеющихся грибов отличается своей спецификой метаболизма. В плане подавления каталазной активности грибов наиболее эффективным показал себя биоцид Биор-1. Данный препарат вызывал ингибирование каталазной активности ≥90% у 9 грибов из 20 исследованных.

Исследованные нами биоциды в меньшей степени подавляли фенолоксидазную активность исследованных тест-культур по сравнению с каталазной активностью (табл. 5).

Отмечено, что препарат Bioneutral A 101 увеличивал активность фенолоксидазы Aspergillus tubingensis ВКМ F-4822D, Bioneutral A 10 – Penicillium sclerotiorum ВКМ F-482237. Кроме того, показано, что Aureobasidium melanogenum ВКМ F-4828D, не обладающий фенолоксидазной активностью в контрольных условиях, проявил ее под воздействием Bioneutral A 101.

В табл. 6 представлены результаты исследования действия биоцидов Биор-1, Bioneutral A 101, Bioneutral A 10 на активность кислой и щелочной протеаз грибов. Контролем служил вариант экспериментов на среде без биоцидов (табл. 3).

Анализ экспериментальных данных показал, что все биоцидные препараты ингибировали кислые и щелочные протеазы. Исключение составляет действие препарата Биор-1 на ферментативную активность гриба Aspergillus tubingensis ВКМ F-4822D, которое привело к повышению активности кислой протеазы на 36.7%.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что снижение ферментативной активности может происходить как в результате изменения структуры фермента, так и вследствие нарушения его синтеза (Bezborodov et al., 2008). На активность экстрацеллюлярных ферментов также могут повлиять изменения скорости их транспорта к местам секреции (Kasatova et al., 2017). В данной статье мы не рассматривали конкретные механизмы изменения ферментативной активности грибов. В задачи наших исследований входило обнаружение у грибов-деструкторов, выделенных в условиях Вьетнама, наличия оксидоредуктаз и гидролаз, способных участвовать в деструкции материалов и изделий с последующим подбором ингибиторов активности данных энзимов для предотвращения процессов биоповреждений.

Механизм ингибирующего действия большинства соединений, исследуемых в качестве средств защиты материалов и изделий от микробиологических повреждений, недостаточно исследованы. Относительно данных биоцидов известно, что препарат Биор-1 – четвертичное аммониевое соединение и основной механизм его действия связан с нарушением проницаемости цитоплазматической мембраны в результате ее дезинтеграции, а именно с расслоением белково-липидного слоя. Тогда как производные тиазола, к которым относятся препараты Bioneutral A 10 и Bioneutral A 101, обладают электрофильной активностью и вступают в реакцию с белками микроорганизмов, содержащих тиольные группы, прерывая, таким образом, ряд метаболических процессов. Антимикробная активность бронопола, входящего в состав Bioneutral A 101, в основном обусловлена наличием в молекулах электронодефицитных атомов брома, которые проявляют окислительные свойства. Механизм антимикробного действия бронопола состоит из сшивания сульфогидрильных групп ферментов дегидрогеназ, в частности дегидрогеназ ЦТК.

Таким образом, полученные нами результаты расширили имеющиеся на сегодня представления о механизмах ингибирующего действия препаратов Биор-1, Bioneutral A 101, Bioneutral A 10 в плане возможности этих соединений подавлять экстрацеллюлярную каталазу, фенолоксидазу и протеазы микромицетов – активных деструкторов материалов и изделий, что, несомненно, имеет практическую значимость при разработке средств для целенаправленной и планомерной защиты материалов и изделий от биоповреждений.

Следует обратить внимание на отмеченный нами факт, что под действием ряда биоцидных соединений имело место не снижение, а увеличение активности экзоферментов (см. табл. 4, 5 и 6). Это также необходимо учитывать при защите материалов и изделий с помощью биоцидов. При недостаточной концентрации биоцида, не приводящей к полной гибели грибов-деструкторов, могут остаться наиболее устойчивые штаммы и стимулироваться активность экзоферментов. В результате такого неправильного подбора увеличение синтеза и активности агрессивных метаболитов грибов, участвующих в деструктивном процессе, может усугубить процесс биоповреждения материала этими микромицетами.