Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 5, стр. 366-373

ВВЕДЕНИЕ

Туя – род голосеменных хвойных растений семейства кипарисовые (Cupressaceae). Виды этого рода, особенно туя западная (Thuja occidentalis), активно используются в садоводстве в качестве декоративно-лиственного растения. В древесине туи содержатся аромодендрин, токсифоллин, эфирные масла, обладающие противогрибковыми и антибактериальными свойствами. Листья используются в медицине из-за их антибактериального, жаропонижающего, противокашлевого, вяжущего, мочегонного, гемостатического и охлаждающего действия (Raghavendra et al., 2007). При надлежащем уходе и принятии профилактических мер деревья и кустарники туи обладают высокой устойчивостью к болезням. Все это делает ее чрезвычайно популярной и востребованной в городских насаждениях. Однако в связи с наблюдаемыми в последние десятилетия климатическими изменениями, увеличением объемов интродукции декоративных сортов, генетической пластичности патогенных микроорганизмов, усилением антропогенного воздействия на природу и пр., возросла степень ее поражения различными заболеваниями. Сведения о возбудителях этих заболеваний в отечественной литературе пока весьма скудны. Очевидно, интерес к изучению микробиоты интродуцируемых растений будет повышаться в связи с распространением болезней, снижающих их декоративность и долговечность. Тем не менее, фитопатологические исследования Cupressaceae в средней полосе России проводились и ранее.

Так, в 2009 г. в озеленительных посадках Москвы и Московской обл. на туе западной были описаны грибы Неndersonia notha Sacc., Phoma thujana Thm, Phomopsis juniperovora Hahn., Kabatina thujae Schneider ex von Arx. и Pestalotiopsis funerea (Desm.) Steyaert. Правда, в этих исследованиях последний вид особенно часто встречался на можжевельнике (Sokolova, Kolganikhina, 2009). В 2010 г. видовой состав патогенных грибов Thuja occidentalis дополнен Coryneum thujinum Dearn., Steganosporium piriforme (Hoffm.) Corda, Acanthostigma parasitica (Hart.) Sacc. (Zhukov at al., 2010).

Объектом настоящего исследования стали 12-летние деревья туи западной сорта Колумна, высаженные на приусадебном участке в д. Таганьково Одинцовского р-на Московской обл. (55°68′44″ с.ш., 37°06′66″ в.д.). Во время обследования растений были отмечены верхушечные ожоги, повреждение и отмирание ветвей. Процесс начинался на кончиках молодых платикладиев, которые сначала желтели, затем становились коричневыми и в конечном итоге преждевременно опадали. На поверхности этих трофических побегов обнаруживались крошечные черные пятнышки, представляющие собой спороношения грибов. Описанная симптоматика свидетельствовала об инфекционном характере повреждений.

Целью данной работы стала идентификация патогена, несущего ответственность за перечисленные выше симптомы, на основе морфологических признаков его репродуктивных структур и путем генетической характеристики ITS-региона его ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы веток туи с признаками хлороза, увядания и усыхания были отобраны с нескольких деревьев, предназначенных для озеленения приусадебного участка и прилегающих к нему улиц, в июле 2021 г. (рис. 1). При первичном визуальном осмотре на них были обнаружены следы жизнедеятельности минирующей туевой моли-пестрянки (Argyresthia thuiella), гусеницы которой прогрызают ходы в толще листовых пластинок и питаются их столбчатой паренхимой. Они перезимовывают внутри веток туи, весной там же окукливаются. Имаго вылупляются с середины мая до начала июля. Ежегодно развивают одно поколение A. thuiella. Встречается повсеместно (Konečná, Šefrová, 2014). На момент исследования бабочки уже покинули листья туи, практически не нанеся эстетического ущерба растениям.

Рис. 1.

Симптомы песталоциозного увядания хвои туи западной.

На пораженных деревьях также были отмечены хлоротические и красновато-коричневые участки, распределенные случайным образом среди здоровой хвои. Концы пораженных побегов теряли зеленую окраску. На них наблюдалось пожелтение, верхушечный некроз и коричневые некротические пятна неправильной формы, которые со временем распространялись на весь платикладий, окрашивая его сначала в красновато-бурый, затем в бурый цвет. Со временем на поверхности трофических побегов образовывались единичные оливково-черные скопления в виде коростинок, представляющие собой спороношение гриба. Побуревшая хвоя преждевременно осыпалась.

С целью идентификации возбудителей болезни фрагмент платикладия осторожно промывали водой, поверхностно стерилизовали 96%-м этанолом и инкубировали на влажной фильтровальной бумаге в течение 8 сут. Колонии грибов пересевали на картофельно-сахарозный агар (КСA), где через 7–10 сут развивался мицелий. Для получения моноспоровых изолятов инкубацию продолжали до появления спороношения. После чего стерильной иглой снимали одну или несколько конидий с конидиеносца и переносили на агаризованную среду для морфологической идентификации, которую проводили согласно методическим указаниям ВНИИЛМ (Zhukov et al., 2013). Все грибные структуры были исследованы под микроскопом стерео МС-5-ZOOM LED и сфотографированы c использованием цифрового видеоокуляра ToupCam UCMOS14000KPA.

Молекулярно-генетическая характеристика культуры получена путем секвенирования внутреннего транскрибируемого спейсерного региона рибосомальной РНК (ITS-региона). ITS-регионы, находясь между малой (18S рДНК) и большой (28S рДНК) субъединицами рибосомной РНК, традиционно являются основной мишенью при определении таксономического положения микроорганизма. Они присутствуют во всех известных организмах, более вариабельны среди близкородственных видов, чем регионы, кодирующие гены рРНК и, наконец, широко представлены в базах данных нуклеотидных последовательностей (в том числе GenBank NCBI). Для генетического анализа спородохии моноспорового изолята собирали стерильной иглой и переносили в картофельно-сахарозный бульон. Через 8 сут инкубации из выросшего мицелия экстрагировали ДНК по модифицированному протоколу CTAB-PVPP (Neuhauser et al., 2009). ITS-регион был амплифицирован с использованием пары праймеров ITS1 (5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3') и ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al., 1990). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в общем объеме 25 мкл и она состояла из следующих стадий: 5-минутная денатурация при 94°С, за которой следовали 35 температурных циклов: 35 с при 95°С, 55 с при 56°С и 45 с при 72°С. Реакция завершалась этапом элонгации в течение 10 мин при 72°C. Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в геле, содержащем 1.0% агарозы. Фрагменты ДНК визуализировали с помощью окрашивания бромистым этидием в УФ-свете. Секвенирование ампликонов проводилось в ООО “Синтол”, г. Москва с использованием тех же праймеров, что и для реакции амплификации.

Для определения сходства полученных последовательностей с депонированными в GenBank NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) использовалась поисковая компьютерная программа BLAST. Таксоны грибов были отнесены к виду и роду, демонстрирующим гомологию, равную или превышающую 99%.

Патогенность обнаруженных изолятов подтверждалась путем инокуляции здоровых трофических побегов туи суспензией описываемого гриба. Всего 15 платикладиев были осторожно повреждены легкими уколами игл для инсулиновых шприцев. Пять из них были оставлены в качестве контроля. Грибную культуру выращивали на КСА в пластиковых чашках Петри в темноте при 25°С. Интенсивное спороношение наблюдалось уже на 15-е сутки. Собранную споровую массу суспендировали в стерильной воде до концентрации 10⁷ спор/мл и наносили на образцы мягкой кистью. Контрольные варианты обрабатывали стерильной водой.

После инокуляции образцы оставляли на влажной фильтровальной бумаге в чашке Петри в течение 14 сут при температуре 17–22°С. Поливали по мере необходимости. Опыт повторяли дважды.

Дизайн праймеров для экспресс-диагностики возбудителей заболеваний растений разрабатывали с помощью программного обеспечения PrimerQuest™Tool. Вероятность формирования вторичных структур (димеры и шпильки) оценивали в той же программе. Проверку специфичности праймеров проводили с помощью алгоритма primer-BLAST (NCBI) in silico и конвенционной ПЦР на амплификаторе ДТ-96 (Москва, ООО “ДНК-Технология”) с использованием ДНК фитопатогенных микромицетов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В проведенных экспериментах 10-дневная инкубация пораженных фрагментов платикладиев во влажной камере спровоцировала развитие спороношения гриба, которое в природных условиях наблюдается осенью, с наступлением влажной и прохладной погоды. Визуально наблюдалось большое количество хаотично рассеянных черных округлых бугорков, выступающих из трещин покровных тканей и представляющих собой группировки конидиеносцев (ацервулы) с обильным конидиальным спороношением (рис. 2).

Рис. 2.

Pestalotiopsis funerea: а – через 10 сут инкубации на среде КСA; б – реверс; в – побег туи с множеством черных спорообразующих тел, ацервул гриба на увеличени 14×; г – септированные конидии гриба с апикальными и базальными придатками на увеличении 200×.

Колонии моноспоровых изолятов, предназначенные для морфологической идентификации, обладали выраженными индивидуальными особенностями. На КСА они сначала были белыми с обильным воздушным мицелием, позднее темнели и становились серо-белыми, серыми или бледно-коричневыми. Росли быстро. Агар на чашке Петри диаметром 90 мм при температуре 25°С зарастал мицелием за 10 сут. Спустя еще 5–7 cут начиналось обильное конидиальное спороношение. Конидии образовывались в плоских черных или коричневых ацервулах, частично погруженных в мицелий и неравномерно в нем распределенных (рис. 2, a, б).

Первичная идентификация культур была выполнена на основе морфологических признаков репродуктивных структур. Конидии анализируемого микромицета представляли собой прямые или слегка изогнутые пятиклеточные объекты веретеновидной и эллипсоидной формы с четырьмя поперечными перегородками. Три центральные клетки пигментированы, апикальные и базальные – прозрачные. Базальная клетка обычно заканчивалась шиповидным придатком. На апикальной насчитывалось от двух до шести нитевидных или ресничковидных придатков. Длина ресничек от 5 до 30 мкм, некоторые из них были разветвленные, большинство простые.

С этими данными хорошо согласуются описанные ранее морфологические характеристики Pestalotiopsis funerea (Ascomycota, Sordariomycetes), изолированного из сосны желтой, или орегонской (Pinus ponderosa), сосны Культера (P. coulteri) и сосны черной (P. nigra). Фитоэкспертизе подвергались деревья с симптомами болезни хвои, фитофтороза и серой гнили в Словакии (Ivanova, 2016).

Генетическая характеристика культуры, выделенной из подмосковной туи, была получена путем секвенирования внутреннего транскрибируемого спейсерного региона рибосомальной РНК (ITS-региона). Полученную в результате последовательность Pestalotiopsis funerea X-001 депонировали в GenBank NCBI под номером ON160928.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ON160928). По результатам BLAST при равном проценте идентичности с Pestalotiopsis hollandica (MH855436.1, NR_147555.1, MH107906.1 и MT374678.1) и Pestalotiopsis monochaeta (KM199329.1, NR_147554.1) наивысшая оценка выравнивания получена между последовательностью изучаемого микромицета и Pestalotiopsis funerea (EF055197.1). На лучшее соответствие между ними указывает и Query Coverage – 100% последовательности запроса покрывается эталонной последовательностью P. funerea.

В тестах на инокуляцию через 30 сут инкубации на всех побегах, обработанных суспензией конидий P.  funerea, наблюдались некротические участки, выходящие за пределы точек инокуляции, частично выраженный хлороз или обесцвечивание. Контрольные образцы оставались либо бессимптомными, либо некроз наблюдался только в точке инокуляции, без дальнейшего распространения. Это говорит о том, что P.  funerea способен колонизировать платикладии туи, вызывая их патологические изменения.

ОБСУЖДЕНИЕ

P.  funerea вызывает некроз побегов хвойных пород, или песталоциоз. В странах Азии заболевание приобрело широкое распространение. Так, в Китае при исследовании эндофитов, ассоциированных с корой и хвоей Pinus armandii, 132 изолята были идентифицированы как виды Pestalotiopsis. Филогенетический анализ проводился на основании сходства ITS-регионов рибосомной ДНК и последовательностей гена β-тубулина (Hongli et al., 2006). В Алжире на 40-летних деревьях кипариса крупноплодного и можжевельника колючего наблюдались язвы на стволах и ветвях с обесцвечиванием коры, трещинами, выделением смолы, ведущими к отмиранию, увяданию кроны и гибели деревьев. При дальнейшем обследовании было выявлено, что данные симптомы вызывал гриб Botryosphaeria iberica совместно с Pestalotiopsis funerea (Azouaoui-Idjer et al., 2012).

В Европе и некоторых штатах США заболевание систематически обнаруживается местными исследователями. Первое сообщение о P. funerea на кипарисе Лейланда в Италии опубликовано в 2001 г. Гриб был выделен из некротизированных веточек и язв с ацервулиями на деревьях с симптомами пожелтения листьев и отмирания ветвей (Gonthier, Nicolotti, 2002). На севере Португалии в 2004 г. было впервые зафиксировано заражение P. funerea хакеи игловидной (Hakea sericea). Поскольку инвазия этого растения становится проблемой для сохранения местного биоразнообразия, Pestalotiopsis в перспективе планируется использовать для биологической борьбы с захватчиком (Sousa et al., 2004). В Словакии гриб поражал сосны Pinus ponderosa и P. nigra (Ivanová, 2016), во Франции – шишечки кипариса (Bouaziz, 2003). При описании тиса ягодного (Taxus baccata), распространенного на меловых склонах Саут-Даунс в Великобритании авторы включили Pestalotiopsis funerea в список сордариомицетов, паразитирующих на его листьях и побегах (Thomas, Polwart, 2003). В США с 2019 по 2022 г. гриб был зафиксирован в штатах Нью-Йорк, Массачусетс, Нью-Джерси и др. (GBIF, 2022).

В Республике Беларусь с P. funerea впервые столкнулись в 2008 г. (Belomesyatseva et al., 2018). Постепенно осваивая территории и новые виды растений, в 2013 г. P. funerea появился в виде единичных очагов на растениях тисса и туи (Belomesyatseva et al., 2013), в 2016 г. на растениях туи западной и можжевельника чешуйчатого (Juniperus squamata) (Golovchenko et al., 2017), и в 2017 г. – на побегах лиственницы европейской (Larix decidua Mill) (Belomesyatseva, Shabashova, 2017). Но уже в 2018 г. в питомнике Минского лесхоза наблюдалось усыхание более чем 50% побегов на одном растении можжевельника, вызванное Pestalotiopsis funerea (Dishuk, Golovchenko, 2018).

Российскими исследователями это заболевание отнесено к опасным малоизученным болезням хвойных пород в лесах России (Zhukov et al., 2013). В экспозициях Переславского дендросада Ярославской обл. и в парках южных пригородов Санкт-Петербурга P.  funerea был обнаружен на отдельных побегах туи западной (Kolganikhina et al., 2011; Vlasov, Sidelnikova, 2014). В Московской обл. оно было впервые зарегистрировано на хвое можжевельника (Juniperus sp.) в 2001 г. (Zhukov et al., 2013).

В процессе проведения лесопатологического мониторинга исследователи повсеместно отмечают расширение видового состава грибов-патогенов хвойных деревьев, в том числе принадлежащих роду Pestalotiopsis. Таксономия этого рода на сегодняшний день не вполне отчетлива, т.к. большинство видов не подтверждено чистыми культурами. Например, до сих пор нет уверенности, что Pestalotia и Pestalotiopsis являются разными родами (Surina, Kopina, 2019). Сам род Pestalotiopsis, описанный впервые в 1949 г., в последнее время был разделен на три рода: Pestalotiopsis, Neopestalotiopsis и Pseudopestalotiopsis (Judith-Hertz, 2017; Gilvana et al., 2021). Более того, на основе собранных данных предлагаются дальнейшие таксономические изменения в пределах этих родов. Может быть, поэтому некоторые исследователи предпочитают термин “песталоциоидные виды” (Gilvana et al., 2021).

Основой для дифференциации “песталоциоидных видов” служат незначительные морфологические различия в описании конидиальных перегородок и количестве придатков на конидиях. В этой связи становятся очевидными преимущества методов, лишенных субъективного подхода и основанных на сравнении структуры грибных геномов. При выполнении настоящей работы, мы попробовали решить задачу идентификации комплекса песталотиоидных видов посредством амплификации фрагмента их геномов в полимеразной цепной реакции (ПЦР). С этой целью нами были сконструированы праймеры, специфичные ITS региону P. funerea: PestF1 5'-GCGGAGGGATCATTATAGAGTTT-3' и 5'-PestR1 CAGATCCGCCGTTGTATTTCA-3'. Выбранный целевой участок обладал большим количеством эквивалентных характеристик среди песталоциоидных видов, поэтому продукт ожидаемого размера (390–440 п.н.) амплифицировался in silico на других песталоциоидных грибах из родов Pestalotiopsis и Neopestalotiopsis. В процессе скрининга небольшого количества образцов хвойных деревьев из разных регионов СНГ, хорошо детектируемые продукты ПЦР получены только на туе из Подмосковья. На рис. 3 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами PestR1 и PestF1. Размер полученных ампликонов соответствовал расчетному, неспецифические продукты отсутствовали. Метод чувствителен к присутствию гриба в ткани растения даже без видимых симптомов поражения (см. рис. 3, дорожка 5). Контаминация препаратов растительной ДНК не ухудшает специфичность и чувствительность реакции. В ходе дальнейшего исследования было показано, что на остальных образцах к инфекционному усыханию листового аппарата привела инвазия других фитопатогенов. Изоляты этих грибов были выделены в чистую культуру и охарактеризованы морфологическими и генетическими методами (табл. 1).

Рис. 3.

Подбор и оценка качества праймеров для видовой диагностики Pestalotiopsis funerea: А – положение специфических олигонуклеотидных праймеров в ITS-регионе гриба P.  funerea штамм ML4DY; Б – результаты амплификации ITS-региона. Условные обозначения треков: 1–2 – ДНК из хвои сосны черной из Волгоградской обл.; 3 – сосна обыкновенная из Московской обл.; 4 – можжевельник из г. Самарканда; 5 – туя из Московской обл. без видимых симптомов некроза; 6–9 – туя из Московской обл. с симптомами некроза; 10 – положительный контроль (ДНК P.  funerea из чистой культуры); 11 – отрицательный контроль (вода); М – ДНК маркер молекулярного веса (M100bp).

В результате коллекция грибов биологической лаборатории АО “Щелково Агрохим” пополнилась следующими патогенами хвойных: Microsphaeropsis olivacea (можжевельник, Самарканд), Neosetophoma iranianum (ель, г. Самарканд), Sydowia рolyspora (сосна черная, Волгоград), Lophodermium sp. (сосна обыкновенная, г. Москва), Fusarium acuminatum (сосна обыкновенная, г. Щелково) и Dothistroma septosporum (кедр, Республика Алтай). Таким образом, отсутствие репрезентативной выборки изолятов Neopestalotiopsis sp., Pestalotiopsis sp. и Pseudopestalotiopsis sp. пока не позволяет предлагать метод для объемного скрининга соответствующих микромицетов. Поэтому формирование коллекции чистых культур песталоциоидных видов грибов, патогенных для растений, остается нашей приоритетной задачей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Естественные леса и искусственные древесные насаждения в силу своих средообразующей и средозащитной функций имеют огромное значение для жизни человека. Эффективность лесозащитных и лесовосстановительных мероприятий, рентабельность лесозаготовок и состоятельность программ по озеленению населенных пунктов невозможны без знаний о грибном сообществе древесных растений. В том числе без идентификации потенциально вредных патогенов для предотвращения их интродукции в новые зоны обитания. Но пока соответствующие исследования значительно отстают от исследований сельскохозяйственных культур. Представленная работа посвящена идентификации одного из потенциальных патогенов хвойных деревьев – Pestalotiopsis funerea. Возможно, это первое обнаружение гриба на туе, растущей в Подмосковье.

Изучение структуры биоценозов древесных пород в целом можно облегчить внедрением ПЦР-тестов, рассчитанных на идентификацию той или иной таксономической группы в рамках соответствующего биоценоза. В настоящем исследовании были разработаны праймеры для первичного скрининга песталоциоидных видов грибов в растительной ткани. Но для реализации замысла по их мониторингу необходимо формирование коллекции песталоциоидных грибов для тестирования праймеров и отработки методики ПЦР-идентификации их изолятов.