Микология и фитопатология, 2023, T. 57, № 5, стр. 352-361

ВВЕДЕНИЕ

За последние 50 лет население планеты выросло более чем в два раза. Этот фактор неизбежно привел к сокращению площади земли, доступной для выращивания продовольственных культур. В агропроизводстве на передний план выдвигаются вопросы защиты сельскохозяйственных растений, поскольку уровень развития патогенной микрофлоры в почве и на семенном материале достиг критического значения. Ущерб, причиняемый сельскому хозяйству патогенными микроорганизмами, растет из года в год во всем мире. Более 80% всех известных болезней растений вызываются микромицетами – самой широкой группой возбудителей заболеваний (Titova, Krasnobaeva, 2019).

Фузариозная сухая гниль картофеля, вызываемая микромицетами Fusarium spp., является основным разрушительным заболеванием, вызывающим загнивание клубней при хранении. Потери от Fusarium – ассоциированной сухой гнили, по некоторым оценкам, снижают урожайность до 25% при влиянии на развитие проростков картофеля, и более 60% клубней могут быть поражены при длительном хранении урожая (Lastochkina et al., 2020). Опасным и широко распространенным заболеванием растений во всем мире считается аскохитоз, возбудителем которого являются грибы Ascochyta spp., а потери урожая составляют до 50%. Современные меры борьбы с аскохитозом включают в себя уничтожение зараженных растений и применение химических фунгицидных препаратов (Barbetti et al., 2021). Представители рода Rhizoctonia являются почвенными фитопатогенами, мицелий которых обволакивает корни растений и может проникать в почву на глубину более 25 см. Растения, пораженные данными микроорганизмами, гибнут. Меры борьбы включают в себя агротехничекие и химические приемы (Li et al., 2021). В 2019 году впервые было обнаружено сильнейшее заболевание растений (антракноз) в Китае, возбудителем которого является гриб рода Colletotrichum. Вспышка болезни, вызванная этим возбудителем, привела к 60% гибели сельскохозяйственных культур. В настоящее время для борьбы с фитопатогенными микромицетами используются сильные химические фунгициды, которые вызывают пестицидный стресс у растений и снижают качество сельскохозяйственной продукции (Zhang et al., 2021).

Помимо микромицетов, большой ущерб наносят и фитопатогенные бактерии. Ожог плодовых культур – одно из опаснейших заболеваний, поражающих растения. Его возбудитель Erwinia amylovora вызывает некрозы всех органов растений-хозяев (Ordax et al., 2015). Экономический ущерб от ожога плодовых деревьев выражается как в потерях урожая и гибели плодовых, так и в затратах на выкорчевку и уничтожение больных растений, проведение профилактических химических обработок против возбудителя болезни и его переносчиков, а также карантинных фитосанитарных мероприятий. Методы борьбы с E. amylovora являются предметом многих исследований. Первоначально было показано, что антибиотики, в частности стрептомицин, являются эффективным средством контроля бактериальной инфекции при обработке растений во время цветения (Johnson, 1993). Длительное использование антибиотика привело к появлению устойчивых к стрептомицину популяций E. amylovora, что вызывает беспокойство медицинских сообществ, использующих антибиотик в терапевтических целях (Förster et al., 2015). В мире в качестве агентов биологической борьбы с бактериальным ожогом широко используются штаммы Pantoea vagans C9-1, P. ananatis BRT175, P. agglomerans E325 и P10c, Pseudomonas fluorescens A506, Bacillus subtilis QST713 и BD170 (Walterson, 2014). В нашей стране частные и промышленные сады занимают большие площади, а применяемые меры борьбы не препятствуют акклиматизации возбудителя. Согласно “Списку пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации” в настоящее время в нашей стране не зарегистрировано биопрепаратов для борьбы с возбудителем бактериального ожога плодовых культур.

На современном этапе очевидна важнейшая роль биологических методов повышения урожайности и сохранности сельскохозяйственных культур, в том числе использования почвенных ризосферных микроорганизмов. Полезные ризобактерии можно назвать “растительными пробиотиками”, которые увеличивают рост, урожайность, эффективность использования питательных веществ, устойчивость растений к биотическим и абиотическим стрессам (Rochlani et al., 2022). В свою очередь, коммерциализация биоудобрений на основе бактерий ограничена в связи со сложностью использования лабораторных штаммов в полевых условиях из-за ряда факторов (физико-химические свойства почвы, взаимодействие с другими ризосферными организмами, экологические факторы). Важной стратегией для преодоления этих ограничений является применение автохтонных микроорганизмов, адаптированных к климатическим условиям региона (Etesami et al., 2021). Все большую значимость приобретает применение бактериальных удобрений на основе ассоциативных ризобактерий, стимулирующих рост растений, которые являются неотъемлемой частью ризосферной биоты. В связи с высокой адаптацией к широкому диапазону питательных сред, быстрым темпам роста и биохимической универсальностью метаболизма, ризобактерии рассматривают как необходимый компонент в управлении агрокультурами. Микробиологический способ защиты растений от болезней основан на природном явлении антагонизма бактерий по отношению к фитопатогенам. Он реализуется с использованием таких механизмов, как способность к конкуренции за питательные вещества и пространство, продукция сидерофоров, литических ферментов, антибиотиков (Santoyo et al., 2021).

Ранее нами из почв Республики Татарстан были выделены фитатгидролизующие штаммы, идентифицированные с помощью MLSA-анализа как Pantoea brenneri 3.1, 3.2, 3.5.2 и 3.6.1 (Suleimanova et al., 2015, 2021). В предыдущих исследованиях уже показаны положительные эффекты отдельных штаммов на растения: установлена способность к секреции комплекса гидролитических ферментов (фитазы, протеазы, целлюлазы), деструкции цианидов (HCN), синтезу фитогормонов и сидерофоров (Itkina et al., 2021). Целью данной работы явилось изучение антагонистической активности штаммов P. brenneri 3.1, 3.2, 3.5.2 и 3.6.1 в отношении широкого спектра фитопатогенных микроорганизмов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Исследовалась антибиотическая активность бактериальных штаммов P. brenneri 3.1, 3.2, 3.5.2 и 3.6.1. В качестве тест-культур использовали бактериальный штамм Erwinia amylovora (коллекция микроорганизмов ФГБНУ “Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии”) и штаммы микромицетов Fusarium sambucinum, F. oxysporum, F. solani, Rhizoctonia solani, Alternaria sp., Ascochyta kamchatica, Colletotrichum coccodes (коллекция микроорганизмов НИЛ “Агробиоинженерия” ФГАОУ ВО “Казанский (Приволжский) федеральный университет”).

Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов. Культивирование бактериальных штаммов осуществляли на питательной среде LB (г/л): триптон – 1.0, дрожжевой экстракт – 0.5, NaCl – 0.5. Культивирование штаммов проводили в пробирках при соотношении объема среды к объему пробирки 1 : 5 на лабораторных орбитальных качалках с интенсивностью качания 200 об./мин при температуре 30°С.

Штаммы микромицетов культивировали в лабораторных термостатах при 25–28°С на среде Чапека (г/л): сахароза – 30.0, NaNO₃ – 3.0, KH₂PO₄ – 1.0, MgSO₄ × 7H₂О – 0.5, KCl – 0.5, FeSO₄ × 7H₂O – 0.01, aгар – 20.0.

Совместное культивирование штаммов Pantoea brenneri и Erwinia amylovora проводили на следующих питательных средах (г/л): NAS (сахароза – 50.0, агар – 15.0), King B (пептон – 20.0, глицерин – 10.0, КН₂РO₄ – 1.5, MgSO₄ × 7Н₂O – 1.5, агар – 15.0), LB, R2A (дрожжевой экстракт – 0.5, пептон – 0.5, гидролизат казеина – 0.5, крахмал – 0.5, глюкоза – 0.5, K₂HPO₄ – 0.3, MgSO₄ × H₂O – 0.3, NaCl – 0.3, агар – 15), NAG (глюкоза – 10.0, агар – 15.0), 925 (глюкоза – 5.0, K₂HPO₄ – 3.0, NaH₂PO₄ – 1.0, NH₄Cl – 1.0, MgSO₄ × H₂O – 0.3, агар – 15.0).

Измерение оптической плотности (ОП) суспензии клеток проводили на спектрофотометре (Bio-Rad, США) при длине волны 590 нм.

Получение супернатанта. В работе использовали супернатант культуральной жидкости штаммов Pantoea brenneri. Клетки культивировали на питательной среде LB при температуре 30°С в течение 18 ч. Далее клетки осаждали путем центрифугирования при 10 000 об./мин в течение 15 мин. Полученный супернатант пропускали через мембранный фильтр (Millipore, Германия) с диаметром пор 0.22 мкм и использовали для дальнейшей работы.

Определение антагонистической активности. Антагонистическую активность бактериальных штаммов по отношению к тест-культурам микромицетов определяли методом двойных культур на среде Чапека (Egorov, 2004). Бактериальные штаммы предварительно высевали на чашку Петри газоном, используя 100 мкл 18-часовой культуры. Далее в центр чашки выкладывали агаровый блок с культурой патогена. В контрольном варианте использовали культуру гриба без бактериальных штаммов. Анализ чашек проводили через 10–14 сут, определяя размер зон ингибирования роста мицелия. Степень ингибирования определяли по формуле: И = (1 – А/В) × 100%, где И – ингибирование роста колонии патогена (%), А – диаметр роста гриба в варианте с бактериальным штаммом (см), В – диаметр роста гриба в контроле (см) (Netrusov, 2005).

Антагонистичекую активность бактериальных штаммов по отношению к тест-культуре Erwinia amylovora определяли аналогично путем совместного культивирования на различных питательных средах (NAS, King B, LB, R2A, NAG, 925). Готовили 18-часовые культуры штаммов и доводили оптическую плотность (ОП) суспензии клеток Pantoea brenneri – до 1.0, Erwinia amylovora – до 0.1. Поверхность чашки Петри засевали газоном суспензией E. amylovora, после чего в центр чашки пипеткой вносили по 5 мкл суспензии штамов Pantoea brenneri. В контрольных вариантах использовали культуры Erwinia amylovora и Pantoea brenneri, растущие по-отдельности. Об уровне антагонистической активности штаммов судили по диаметрам зон задержки роста тест-культуры вокруг колоний бактерий-антагонистов. Анализ проводили через 48–72 ч культивирования.

Оценкa жизнеспособности микромицетов. Оценку жизнеспособности микромицетов в присутствии бактериальных штаммов проводили путем окрашивания граничащего с бактериями мицелия гриба красителями [нейтральный красный (Sigma, Германия) в концентрации 0.1 мг/мл или Эванс голубой (Sigma, Германия) в концентрации 0.5 мг/мл] и дальнейшего микроскопирования на световом микроскопе “МС300” (Австрия) (Jiang et al., 2019). В качестве контроля проводили аналогичное окрашивание и микроскопирование мицелия гриба, культивируемого без бактериальных штаммов.

Определение способности исследуемых штаммов подавлять фузариозы клубней картофеля. Для работы использовали выращенные в тепличных условиях здоровые, неповрежденные клубни картофеля сорта “Балтик Роуз”, любезно предоставленные к.б.н. З. Сташевски, ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН. Сорт “Балтик Роуз” восприимчив к основным послеуборочным заболеваниям картофеля, включая фузариозную сухую гниль. Клубни промывали в водопроводной воде для удаления почвы и дезинфицировали путем погружения в 10%-й раствор гипохлорита натрия на 20 мин, после чего трижды промывали стерильной дистиллированной водой и высушивали. В клубнях проделывали отверстия глубиной 1.5–2 см и диаметром 1–1.3 см. В эксперименте использовали следующие контрольные и опытные группы.

Контрольная группа 1 – клубни инокулировали агаровыми дисками со штаммами Fusarium sambucinum и F. oxysporum. Контрольная группа 2 – клубни инокулировали путем внесения пипеткой суспензии каждого из бактериальных штаммов Pantoea brenneri в объеме 200 мкл. Контрольная группа 3 – клубни инокулировали cтерильной водой в объеме 200 мкл.

Для обоих исследуемых патогенов проводили как превентивную обработку штаммами бактерий, так и обработку бактериями после заражения патогеном. Опытная группа 1 – клубни инокулировали суспензиями бактериальных штаммов в объеме 200 мкл, через 24 ч добавляли агаровые диски со штаммами Fusarium oxysporum или F. sambucinum. Опытная группа 2 – клубни инокулировали агаровыми дисками со штаммами F. oxysporum или F. sambucinum, через 24 ч добавляли пипеткой суспензии бактериальных штаммов в объеме 200 мкл. Опытная группа 3 – клубни инокулировали супернатантом культуральной жидкости бактериальных штаммов в объеме 200 мкл, через 24 ч добавляли агаровые диски с F. sambucinum. Опытная группа 4 – клубни инокулировали агаровыми дисками с F. sambucinum, через 24 ч добавляли супернатанты культуральной жидкости бактериальных штаммов в объеме 200 мкл.

Клубни инкубировали при температуре 25°С в течение 21 сут. Далее делали разрез от поверхности вдоль участка инокуляции для измерения ширины и глубины некроза тканей (в мм). Глубину проникновения фузариозной гнили рассчитывали по формуле (Mejdoub-Trabelsi et al., 2017): P = [1/2 + + (p – 6)]/2, где P – проникновение гнили (мм), l – максимальная ширина зоны некроза (мм), p – максимальная глубина зоны некроза (мм). Переводили значения в процентное соотношение относительно контроля. Коэффициент поражения фузариозной гнили рассчитывали по формуле: P = = [(W/2) + D – 5)] × 2, где W – ширина некроза (мм), а D – глубина некроза (мм) (Sellem et al., 2017).

Определение вирулентности, токсичности и токсигенности бактерий. Определение вирулентности, токсичности и токсигенности бактерий проводили на белых мышах обоего пола линии ICR (CD-1) в лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН. Животных содержали в стандартных условиях вивария, для кормления использовали стандартный корм. Для каждой экспериментальной группы были отобраны по пять мышей одного возраста массой 16 ± 0.5 г. Вирулентность штаммов определяли путем однократного перорального, либо внутрибрюшинного введения животным 24-часовой бактериальной культуры в стерильном физиологическом р-ре в дозах 10⁶, 10⁷ и 10⁸ КОЕ на одно животное. Токсичность изучали путем внутрибрюшинного введения мышам взвеси 18-часовой культуры микроорганизмов в стерильном физиологическом р-ре, инактивированной нагреванием при 60°С в течение 90 мин. Токсигенность определяли путем внутрибрюшинного и перорального введения стерильного фильтрата культуральной жидкости трехсуточных и семисуточных культур бактерий. При этом контрольной группе животных вводили стерильную жидкую питательную среду. Наблюдение за животными осуществляли на протяжении 30 суток. Из каждой опытной группы были отобраны случайным образом по три мыши. Животных усыпляли при помощи внутрибрюшинного введения р-ра хлоральгидрата из расчета 8 мг/0.1 мл на 20 г массы животного. В асептических условиях производили забор образцов тканей. Внутренние органы обследовали на выявление патологий. Производили посев крови, взятой из сердца, печени и селезенки на питательную агаризованую среду LB.

Все эксперименты с животными проводились в соответствии с Директивой Европейского парламента и Совета по защите животных, используемых для научных целей (2010/63/ЕС). Протоколы экспериментов одобрены Комитетом по содержанию и использованию животных ФНИЦ “Казанский научный центр РАН” (протокол № 2 от 09.06.2022).

Статистический анализ. Статистический анализ результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel. Для описания и сравнения признаков использовали 95%-й доверительный интервал для средних величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фунгицидная активность штаммов Pantoea brenneri

Изучаемые штаммы P. brenneri обладали способностью ингибировать рост исследуемых фитопатогенных микромицетов (рис. 1, а, б; табл. 1). Максимальный антагонизм отмечен в отношении Fusarium sambucinum, F. solani, Rhizoctonia solani и Ascochyta kamchatica, где степень ингибирования роста фитопатогена находилась в среднем в пределах 70–85%. При этом наиболее высокие показатели коэффициента ингибирования Fusarium sambucinum отмечены у штаммов Pantoea brenneri 3.1 (88.8 ± 4.4%), 3.2 (89.8 ± 4.7%) и 3.6.1 (87.8 ± 4.3%); Fusarium solani – у штаммов Pantoea brenneri 3.5.2 (85.3 ± 4.0%) и 3.6.1 (77.9 ± 3.9%); Ascochyta kamchatica – у штаммов Pantoea brenneri 3.5.2 (82.2 ± ± 3.9%) и 3.6.1 (86.6 ± 3.8%). Все исследуемые штаммы P. brenneri имели схожие значения степени ингибирования роста Rhizoctonia solani (от 85.8 ± 4.2 до 86.8 ± 4.1%) (табл. 1).

Рис. 1.

Антагонистическая активность штаммов Pantoea brenneri в отношении фитопатогенных микромицетов Fusarium sambucinum, F. oxysporum, F. solani (а) и Rhizoctonia solani, Alternaria sp., Ascochyta kamchatica, Colletotrichum coccodes (б).

Таблица 1.

Коэффициент ингибирования роста фитопатогенных микромицетов бактериальными штаммами Pantoea brenneri (%)

Штаммы	Коэффициент ингибирования роста
	Fusarium sambucinum	F. oxysporum	F. solani	Rhizoctonia solani	Alternaria sp.	Ascochyta kamchatica	Colletotrichum coccodes
P. brenneri 3.1	88.8 ± 4.4	38.8 ± 1.9	38.2 ± 2.0	86.8 ± 4.1	37.5 ± 1.2	65.5 ± 3.5	52.3 ± 2.9
P. brenneri 3.2	89.8 ± 4.7	17.7 ± 0.9	75.0 ± 3.3	86.8 ± 3.9	25.0 ± 1.9	66.6 ± 3.5	56.7 ± 3.2
P. brenneri 3.5.2	68.8 ± 3.4	22.2 ± 1.15	85.3 ± 4.0	85.8 ± 4.2	77.5 ± 2.7	82.2 ± 3.9	50.0 ± 3.0
P. brenneri 3.6.1	87.8 ± 4.3	55.5 ± 2.9	77.9 ± 3.9	86.8 ± 3.6	87.5 ± 3.9	86.6 ± 3.8	40.6 ± 1.9

Для изучения природы антагонистической активности почвенных изолятов, оценивали жизнеспособность микромицетов в присутствии бактериальных штаммов. Жизнеспособность мицелия при совместном росте с бактериальными штаммами (опыт) и без (контроль) оценивали путем окрашивания и дальнейшего микроскопирования культур. В качестве красителя, избирательно прокрашивающего лишь жизнеспособные клетки, использовали нейтральный красный. Данный агент ввиду липофильной природы проходит через клеточную мембрану (непротонированная форма), а в кислых компартментах присоединяет протон (протонированная форма) и окрашивает их в малиновый цвет (Dubrovsky et al., 2006). Краситель Эванс голубой был использован для обнаружения поврежденных или мертвых клеток, плазматическая мембрана которых легко пропускает крупные анионы данного красителя и клетки окрашиваются в синий цвет (Evans, Schulemann, 1914).

Совместное культивирование штамма Pantoea brenneri 3.2 с микромицетами Fusarium sambucinum, F. solani, и Colletotrichum сoccodes приводило к окрашиванию мицелия в темно-синий (при использовании красителя Эванс голубого) и светло-красный цвет (при использовании красителя нейтрального красного), тогда как для мицелия с контрольных чашек показана слабая синяя окраска и яркая красная, соответственно (рис. 2). По-видимому, присутствие бактериальных клеток в бинарной культуре вызывало разрушение грибных гиф, указывая на фунгицидную природу антагонистического действия штамма Pantoea brenneri 3.2 в отношении микромицетов Fusarium sambucinum, F. solani и Colletotrichum сoccodes.

Рис. 2.

Эффект взаимодействия штамма Pantoea brenneri 3.2 с фитопатогенными микромицетами Fusarium sambucinum, F. solani и Colletotrichum coccodes. Мицелий окрашивали красителями Эванс голубым (мертвые клетки окрашиваются в синий цвет) и нейтральным красным (жизнеспособные клетки окрашиваются в красный цвет). Опыт – мицелий гриба, растущего совместно с бактериальным штаммом, контроль – мицелий, растущий без бактериального штамма. Световая микроскопия, ×40.

Аналогичная противогрибная активность представителей рода Pantoea установлена в ряде исследований. Так, штамм Pantoea sp. OXWO6B1, выделенный с поверхности семени дикого овса, ингибировал рост возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans в условиях in vitro и in vivo (Town et al., 2016). Показаны эффективные фунгицидные свойства штаммов Pantoea dispersa RO-18, RO-20, RO-21 и SO-13 по отношению к фитопатогену Ceratocystis fimbriata, являющемуся возбудителем черной гнили на сладком картофеле. Суспензия клеток ингибировала рост C. fimbriata в среднем до 70%, а супернатант культуральной жидкости ингибировал прорастание спор на 36%. При этом наблюдались аномальные изменения в морфологии грибных гиф, включая их набухание, лизис клеточной стенки, разрыв, грануляцию и вакуолизацию. С другой стороны, штаммы Pantoea ananatis SH-9 и SH-3 обладали не фунгицидной, а фунгистатической активностью в отношении Ceratocystis fimbriata (Jiang et al., 2019). Полученные нами результаты показали, что штамм Pantoea brenneri 3.2 обладает фунгистатическим механизмом действия в отношении микромицетов Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Alternaria sp. и Ascochyta kamchatica, поскольку существенных различий в окраске мицелия, растущего в контрольных и в опытных чашках, выявлено не было, тогда как ингибирование роста фитопатогенов наблюдалось (рис. 1).

Способность штаммов Pantoea brenneri к подавлению фузариозов на клубнях картофеля

Помимо лабораторных исследований фунгицидной активности штаммов P. brenneri, проводили дополнительные эксперименты на клубнях картофеля. Инфицирование клубней микромицетами Fusarium oxysporum и F. sambucinum привело к обширному некрозу тканей (рис. 3). Бактериальные штаммы, как и контроль со стерильной дистиллированной водой, не вызывали заражение клубней, некроза тканей не наблюдали. Бактериальные штаммы проявили сильную ингибирующую активность: рост фитопатогенных микромицетов был подавлен. Показано, что при профилактической обработке клубней суспензией бактериальных штаммов за 24 ч перед заражением микромицетами F. oxysporum и F. sambucinum ингибирование роста гриба на клубнях составило от 44.7 ± 2.3% до 50.3 ± 2.4% и от 43.6 ± 2.1% до 59.2 ± ± 2.9% соответственно (табл. 2). В случае терапевтической обработки бактериальными суспензиями уже зараженных микромицетами клубней картофеля ингибирование роста F. oxysporum составило от 38.8 ± 1.8% до 50.7 ± 2.5%, а F. sambucinum – от 40.8 ± 1.9% до 50.7 ± 2.5%.

Рис. 3.

Результат обработки клубней картофеля суспензией клеток и супернатантов культуральной жидкости штаммов Pantoea brenneri до и после заражения фитопатогенными микромицетами Fusarium oxysporum и F. sambucinum.

Таблица 2.

Ингибирование роста фитопатогенов Fusarium oxysporum и F. sambucinum при профилактической и терапевтической обработке клубней картофеля суспензией клеток и супернатантом культуральной жидкости бактериальных штаммов Pantoea brenneri (%)

Действие	P. brenneri 3.1	P. brenneri 3.2	P. brenneri 3.5.2
F. oxysporum
Профилактика (суспензия клеток)	44.7 ± 2.3	50.3 ± 2.4	44.7 ± 2.4
Терапия (суспензия клеток)	38.8 ± 1.8	50.7 ± 2.5	40.3 ± 2.0
F. sambucinum
Профилактика (суспензия клеток)	43.6 ± 2.1	59.2 ± 2.9	43.7 ± 2.1
Терапия (суспензия клеток)	42.3 ± 2.4	50.7 ± 2.5	40.8 ± 1.9
Профилактика (супернатант)	54.8 ± 3.6	56.3 ± 2.8	50.7 ± 3.2
Терапия (супернатант)	33.8 ± 3.1	57.3 ± 2.8	51.7 ± 2.8

Эксперименты при использовании супернатанта культуральной жидкости для профилактики и терапии клубней картофеля показали в среднем более высокие значения ингибирования роста фитопатогенов в отличие от использования бактериальной суспензии. В случае профилактической обработки, ингибирование роста патогена F. sambucinum составило от 50.7 ± 3.2 до 56.3 ± 2.8%, в случае терапевтической – от 33.8 ± 3.1% до 57.3 ± ± 2.8% (табл. 2). Во всех случаях максимальное ингибирование отмечено при обработке штаммом Pantoea brenneri 3.2 (табл. 2).

Рассчитывали коэффициент поражения фузариозной гнилью клубней картофеля, с помощью которого оценивали тяжесть заболевания (табл. 3). Установлено, что при профилактической обработке клубней бактериальными штаммами за 24 ч до инфицирования Fusarium oxysporum коэффициент поражения был в среднем ниже по сравнению с обработкой после заражения патогеном. Максимальным фунгицидным действием при всех способах обработки обладал штамм Pantoea brenneri 3.2 (табл. 3).

Таблица 3.

Коэффициент поражения фузариозной гнилью клубней картофеля (мм) при обработке штаммами Pantoea brenneri до и после заражения фитопатогенными микромицетами Fusarium oxysporum и F. sambucinum

Действие	P. brenneri 3.1	P. brenneri 3.2	P. brenneri 3.5.2	F. oxysporum (контроль)
Профилактика (суспензия клеток)	40 ± 1	39 ± 1	41.5 ± 2	44.5 ± 2
Терапия (суспензия клеток)	43 ± 2	42 ± 2	43 ± 2
				F. sambucinum (контроль)
Профилактика (суспензия клеток)	38.5 ± 2	34 ± 1	44 ± 2	71 ± 3
Терапия (суспензия клеток)	39 ± 2	39.5 ± 1	60.5 ± 3
Профилактика (супернатант)	38 ± 2	33.5 ± 1	38 ± 1
Терапия (супернатант)	63 ± 3	38 ± 1	51 ± 3

Более эффективное защитное действие штаммов Pantoea brenneri отмечено при инфицировании картофеля Fusarium sambucinum – пораженность клубней фузариозной гнилью снизилась почти вдвое (табл. 3). Также показано, что при профилактической обработке клубней суспензией клеток и супернатантом за 24 ч перед заражением F. sambucinum интенсивность поражения была ниже, по сравнению с обработкой клубней после инфицирования. Максимальным фунгицидным действием обладал штамм Pantoea brenneri 3.2 – при профилактической обработке клубней этим штаммом коэффициент поражения Fusarium sambucinum был снижен почти вдвое относительно контроля (табл. 3).

Таким образом, из всех изучаемых штаммов Pantoea brenneri наиболее высокой активностью подавления фузариоза клубней картофеля, вызванного фитопатогенными микромицетами Fusarium oxysporum и F. sambucinum, обладал штамм Pantoea brenneri 3.2. При этом наибольший эффект достигался при использовании супернатанта культуральной жидкости. Вероятно, наибольшей фунгицидной активностью обладают именно экзометаболиты P. brenneri, что согласуется с данными литературы. Так, одним из свойств стимулирующих рост растений микроорганизмов является их способность угнетать патогенную флору путем продукции биологически активных соединений, в частности, аммиака, синильной кислоты, множества ферментов (Khan et al., 2018). Имеются данные о продукции бактериями биосурфактантов с выраженными мультифункциональными свойствами. По химическому строению они разнообразны, но имеют общее преимущество – безопасны с экологической точки зрения. Микробные сурфактанты могут изменять физико-химические свойства среды обитания и оказывать влияние на структуру развивающегося микробного сообщества, предотвращая бактериальные эпидемии и грибные заболевания, являясь фактором биоконтроля среды (Chernyavskaya et al., 2016). К синтезу биосурфактантов способен штамм P. ananatis BRT175, в геноме которого идентифицированы гены rhlA и rhlB, участвующие в биосинтезе биосурфактанта рамнолипида, оказывающие цитотоксическое действие (Smith et al., 2016). Бактерии рода Pantoea способны к синтезу бацилломицина и итурина, подавляющих возбудителей коричневой гнили плодов – Monilinia fructigena и M. laxa (Lahlali et al., 2018). Штамм Pantoea sp. продемонстрировал способность к синтезу биосурфактанта гликолипида ананатозида А и рамнолидов, обладающих поверхностно-активными свойствами, низкой токсичностью, высокой стабильностью и биоразлагаемостью (Tan, Li, 2018).