Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 1, стр. 142-153

ВВЕДЕНИЕ

Микросателлиты, называемые также простыми повторяющимися последовательностями (Simple Sequence Repeats, SSRs), представляют собой тандемно организованные фрагменты ДНК (мотивы, “коровые” единицы), содержащие от 1 до 6 пар нуклеотидов (п.н.) [1]. Доступность полногеномных последовательностей в сочетании с разработанными и программноимплементированными алгоритмами поиска периодических структур в ДНК позволили выявить микросателлиты в геномах всех известных организмов – от вирусов до эукариот [2–6]. Показано, что SSRs распределены в геномах неслучайно [7, 8] и могут влиять не только на транскрипционную активность генов [9], но и выполнять функциональную роль в эволюции их регуляции [10–12]. Однако в большинстве работ изучались главным образом совершенные (невырожденные) повторы. Изменение копий мотива при замене исходных нуклеотидов, а также при вставках и делециях, как единичных, так и нескольких нуклеотидов, ведет к образованию вырожденных и сложных микросателлитов. Вероятно, именно такие, деградировавшие, повторы рекрутируются для различных биологических функций, включая регуляцию транскрипции и репликации, структурные модификации белков и т.д. [13].

Сложные микросателлиты, или компаунды, представляют собой блоки из мотивов одного или разных типов, разделенные не более чем 100 п.н. Компаунды выявлены в геномах человека [14, 15], ряда эукариотических организмов [16, 17], а также некоторых видах бактерий, [18, 19] и вирусов [20–22]. Сложные микросателлиты предположительно участвуют в регуляции экспрессии генов и функциональной активности белков у ряда видов [12, 18]. Компаунды отражают динамичное изменение и свидетельствуют о более сложной эволюции SSRs, чем предложенная некоторыми авторами концепция жизненного цикла микросателлита от его “рождения” до полной деградации (“смерти”) [16].

Изучение вырожденных микросателлитов и компаундов в геномах патогенных микроорганизмов c высоким уровнем SSRs, таких как Burkholderia pseudomallei, возбудителя мелиоидоза (опасного и потенциально смертельного заболевания людей и животных), необходимо для понимания механизмов адаптационной пластичности их геномов. Структурно-функциональная неоднородность генома B. pseudomallei, включающего две двухцепочечные кольцевые хромосомы, определяет необходимость выявления взаимосвязей между количественной представленностью вырожденных и сложных микросателлитов и особенностями структурной организации каждой из хромосом. Цель представленной работы заключалась в идентификации с последующим изучением строения и локализации вырожденных и сложных микросателлитных повторов в геномах B. pseudomallei.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектами исследования служили полногеномные последовательности 10 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome). Выбор штаммов определяли с учетом популяционной структуры вида B. pseudomallei, состоящей из двух субпопуляций разных географических регионов: Австралии и Юго-Восточной Азии. Различия между субпопуляциями определялись не только географическим распределением, но и частотой рекомбинационных событий. Ранее выявлено, что уровень рекомбинации выше в таиландских штаммах по сравнению с австралийскими изолятами [23]. Результатом высокой скорости рекомбинации может быть гомоплазия, приводящая к единообразию сиквенс-типов изолятов B. pseudomallei, несмотря на их генетическую и географическую гетерогенность. В связи с этим в работу были включены австралийские и таиландские штаммы B. pseudomallei разных сиквенс-типов, принадлежащие к разным клональным комплексам, а также штамм из Китая с сиквенс-типом, идентичным одному из таинландских штаммов (табл. 1).

Определение аллельного профиля и соответствующего ему сиквенс-типа штамма проводили с использованием базы данных https://pubmlst.org/ bpseudomallei [33]. Информация о структурных особенностях хромосом каждого из штаммов приведена в табл. 2.

Поиск вырожденных и сложных микросателлитов. Для идентификации SSRs и компаундов использовали модуль Advanced Mode web-версии программы Imperfect Microsatellite Extractor (IMEx) [34]. Входными данными служили нуклеотидные последовательности в формате FASTA и соответствующие им файлы формата .ptt, содержащие информацию о белоккодирующих регионах. Поиск проводили при следующих параметрах: минимальное число повторов для мононуклеотидных микросателлитов – 12, для динуклеотидных – 6, для тринуклеотидных – 4, для тетра-/пента-/гексануклеотидных – 3; макcимальное расстояние между любыми двумя блоками микросателлитов (dMAX) при поиске компаундов – 10 п.н. Остальные параметры оставляли заданными по умолчанию.

Cтатистический анализ полученных данных. Для описания и статистического исследования выявленных SSRs и компаундов использовали следующие термины: cSSRs – микросателлиты, входящие в состав компаундов; С – сложность компаунда, определяемая числом cSSRs в его составе; CM – число микросателлитов в каждом геноме/хромосоме; CCM – число компаундов в каждом геноме/хромосоме; CcSSR – число cSSRs в каждом геноме/хромосоме; cSSR% – доля микросателлитов, входящих в состав компаундов, от общего числа всех обнаруженных микросателлитов в каждом геноме/хромосоме (cSSR% = CcSSR/CM).

Взаимосвязь таких параметров как размер и GC-содержание (%) генома/хромосомы с количественной представленностью в их составе вырожденных и сложных микросателлитов оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (r). С целью обеспечения возможности межштаммового сравнения результатов поиска повторов найденные SSRs и компаунды были стандартизированы относительно их содержания (relative abundance, RA) в каждом геноме/хромосоме: RA_CM – число микросателлитов на 1 млн.п.н., или плотность микросателлитов; RA_CCM – число компаундов на 1 млн.п.н., или плотность компаундов.

В качестве показателя статистической значимости различий между наблюдаемым (CCM_obs) и ожидаемым (CCM_exp) числом компаундов в каждом геноме использовали значение Z-критерия, определяемого по формуле: $\frac{{{\text{O}} - {\text{E}}}}{{\sqrt {\text{E}} }}$, где O – наблюдаемое число компаундов в каждом геноме (CCM_obs), а E – ожидаемое число компаундов в каждом геноме (CCM_exp). Значение Z-критерия рассчитывали на основании следующих уравнений:

где n – общее число геномов (n = 10), i – порядковый номер каждого генома, ${\bar {C}}$ – средняя сложность n геномов. CCM_obs > CCMexp при Z > 0 и CCM_obs < CCMexp при Z < 0; чем больше значение |Z|, тем более значима разница между CCM_obs и CCM_exp [22, 35].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Простые повторяющиеся последовательности ДНК, состоящие из тандемных итераций коротких олигонуклеотидов, представляют собой гипермутируемые локусы и способны к обратимому изменению длины [12]. В ряде работ показано [36–38], что в геноме патогенных микроорганизмов сильному положительному отбору подвергаются высоко изменчивые микросателлитные локусы в составе генов, как правило, кодирующих поверхностные антигены возбудителей. Динамичное изменение числа повторов в структуре таких генов вносит существенный вклад в антигенные вариации бактерий и обеспечивает им ускользание от иммунного надзора организма-хозяина; при этом полиморфизм генов обусловлен протяженными участками SSRs с числом вхождения “коровой” единицы не менее 8 раз [39, 40]. Согласно существующей гипотезе, изменение числа повторов в составе микросателлитного локуса направляется проскальзыванием полимеразы при репликационных, репарационных и других процессах [41]. Однако мало что известно о механизмах проскальзывания полимеразы при чрезвычайно коротких локусах SSRs, включающих от двух до пяти тандемно повторяющихся мотивов и широко представленных в бактериальных геномах. В подобных коротких локусах SSRs некоторых микроорганизмов выявлен высокий уровень мутаций [42, 43]. Накопление точечных мутаций в составе микросателлитного кластера приводит к образованию несовершенных повторов и компаундов, которые могут прерывать рост тандемов и, тем самым, стабилизировать их в результате нарушения процесса проскальзывания полимеразы.

На широком круге разнообразных видов прокариотических организмов было показано, что протяженные SSR-локусы характерны для бактерий, адаптированных к экологической нише своего хозяина; причем для большинства таких бактерий размер генома и GC-содержание не превышали соответственно 2 млн.п.н. и 40%. По-видимому, подобная взаимосвязь между уникальными условиями средовой ниши и структурными особенностями генома поддерживается отбором и обеспечивает антигенную вариативность как часть защитных реакций бактерий, узко адаптированых к биотопам организма хозяина [3]. Однако для бактериальных видов c крупными геномами, в качестве среды обитания которых характерны разнообразные и сложные по структуре экосистемы с широким диапазоном условий, выявлена низкая представленность протяженных SSR-локусов. К числу таких видов относится возбудитель мелиоидоза, адаптировавшийся к возможностям как сапрофитного, так и паразитического существования. Геном B. pseudomallei представлен двумя хромосомами с размерами около 4 млн.п.н. и 3 млн.п.н., каждая из которых несет гены рибосомальных и транспортных РНК. Нуклеотидный состав генома обогащен GC-парами, доля которых в среднем составляет около 68%, а плотность белоккодирующих генов превышает 90%. С целью прояснить возможную функциональную роль SSRs в механизмах адаптационной пластичности возбудителя мелиоидоза мы проанализировали вырожденные и сложные микросателлиты в геномах 10 штаммов B. pseudomallei.

Проведен сравнительный анализ полученных результатов с опубликованными данными исследований SSRs и компаундов в геномах видов Lactobacillus spp. [19] и Escherichia coli [18]. В качестве общей характеристики, присущей геномам B. pseudomallei, Lactobacillus spp. и E. coli, нужно отметить экологическую пластичность, что позволяет этим патогенам существовать в различных экологических нишах, включая объекты окружающей среды и различные биотопы организма человека и животных. Вместе с тем, структурная организация геномов Lactobacillus spp. и E. coli заметно отличается от генома B. pseudomallei – прежде всего, это меньший размер их геномов и более низкое содержание GC-пар (2 млн.п.н и 42% для Lactobacillus spp. и 5 млн.п.н и 50% для E. coli).

При количественном сопоставлении результатов оказалось, что диапазон плотности микросателлитов (2922.7–3022.6/млн.п.н.) и компаундов (144.7–150.6/млн.п.н.) в геномах проанализированных штаммов B. pseudomallei значительно превосходил соответствущие показатели для Lactobacillus spp. (506.7–1040.9 микросателлитов/млн.п.н.; 3.3–16.4 компаундов/млн.п.н.) и E. coli (644.6–675.7 микросателлитов/млн.п.н.; 5.5–9.4 компаундов/млн.п.н.). Различную плотность SSRs и компаундов в геномах B. pseudomallei, Lactobacillus spp. и E. coli нельзя объяснить исключительно вариативностью размеров их геномов. При анализе представленности вырожденных и сложных микросателлитов в каждой из хромосом B. pseudomallei обнаружен сходный с полногеномным диапазон плотности: 2844.7–2928 микросателлитов/млн.п.н. и 130.6–145.4 компаундов/млн.п.н. для хромосомы 1; 2969.8–3157.3 микросателлитов/млн.п.н. и 149.7–165.3 компаундов/млн.п.н. для хромосомы 2. Размер каждой из хромосом B. pseudomallei не превосходит размера генома сравниваемых штаммов E. coli, что может свидетельствовать о вероятной видоспецифичности плотности микросателлитов, определяемой структурными особенностями генома.

Для установления характера структуры взаимосвязей между показателями количественного содержания SSRs и компаундов с такими параметрами генома B. pseudomallei, как его размер и GC-содержание, был проведен корреляционный анализ. Нами выявлено сопряженное увеличение плотности SSRs с GC-содержанием, а также обратная взаимосвязь плотности SSRs с размером, как для генома в целом, так и для каждой из хромосом. Однако в случае сложных микросателлитов достоверную корреляционную связь между плотностью компаундов и структурными сособенностями генома удалось установить только для хромосомы 2.

Определение закономерностей взаимосвязи плотности вырожденных и сложных микросателлитов позволяет предполагать возможный механизм образования компаундов. Так, Kofler с соавт. [16], при исследовании кластеризации микросателлитов в геномах 8 разных эукариотических видов, в качестве возможного механизма образования компаундов предложили процесс замещения нуклеотидов в концевых мотивах микросателлитного тракта с последующей экспансией таких несовершенных повторов. Подобный механизм формирования сложных микросателлитов должен приводить к тесной прямой корреляционной связи между плотностями SSRs и компаундов, что и было показано авторами [16]. Однако Chen и др. [18] при исследовании содержания сложных микросателлитов в геномах штаммов E. coli выявили очень слабую корреляцию между плотностями SSRs и компаундов, а разный характер ассоциации плотностей микросателлитов и компаундов в эукариотических и прокариотических геномах объяснили функционированием различных ДНК-полимераз и механизмов репликации. В дальнейшем Basharat & Yasmin [19] при анализе представленности компаундов в геномах Lactobacillus spp. пришли к заключению о зависимости ассоциации плотностей SSRs и компаундов у прокариот от видовой принадлежности и рекомбинационного потенциала. При анализе штаммов B. pseudomallei мы выявили статистически значимую взаимосвязь между плотностью вырожденных и сложных микросателлитов только для хромосомы 2. Эти результаты вполне согласуются с выводами Basharat & Yasmin [19] о видоспецифичности и структурных особенностях генома как факторов, определяющих плотности SSRs и компаундов. Более того, нами показано, что даже в рамках одного вида структурная организация каждой из хромосом может быть ассоциирована с разной плотностью SSRs и компаундов.

В результате анализа размера и нуклеотидного состава мотивов в структуре выявленных SSRs обнаружено преобладание GC-богатых ди- и тринуклеотидных повторов в геноме B. pseudomallei. Показано почти полное отсутствие мононуклеотидных треков и AT/TA-микросателлитов. Особенно интересным оказалось обнаружение перепредставленности определенной копийности мотива для ди- и тринуклеотидных микросателлитных последовательностей. Так, выявлено преимущественное шести- и семикратное вхождение “коровой” единицы в состав динуклеотидных микросателлитных локусов, в то время как размер тринуклеотидных повторов соответствовал в основном четырехкратной копийности мотива. Именно возможность формирования стабильных шпилечных структур некоторыми тринуклеотидными повторами: (CGG)n, (CTG)n, (CAG)n, (CСG)n и др., – которые способствуют проскальзыванию ДНК-полимеразы в ходе репликации, считается основой для исключительной нестабильности микросателлитов, что проявляется в изменении числа “коровых” единиц в их составе [44]. Однако при анализе геномов штаммов B. pseudomallei нами выявлена широкая представленность тринуклеотидных микросателлитных повторов и малая копийность мотивов в их составе, что свидетельствут скорее о низком уровне проскальзывания полимеразой этих участков генома в процессе репликации. Согласно существующей теории [41], при возникновении микросателлиты не содержат ошибок (замен, делеций и вставок), но появляющиеся в процессе биологической эволюции точечные мутации приводят к их накоплению, что становится препятствием для проскальзывания полимеразы и для дальнейшей экспансии повторов в составе микросателлитного локуса. Возможно, именно вырожденность большинства SSRs, составившая около 98% от всех обнаруженных микросателлитов в геномах B. pseudomallei, способствовала дестабилизации образуемых ими шпилечных структур и ограничивала увеличение длины блока микросателлитов.

При исследовании сложности компаундов, выявленных в геномах B. pseudomallei, продемонстрирована преимущественная представленность 2-SSR- и 3-SSR-компаундов в обеих хромосомах; лишь незначительная часть сложных микросателлитов оказалась представленной 4-SSR-компаундами. За исключением штамма B. pseudomallei MSHR305, компаунды со сложностью C ≥ 5 в исследованных штаммах возбудителя мелиоидоза представлены исключительно в составе хромосомы 2. Такой характер распределения сложноструктурированных компаундов в геноме B. pseudomallei может быть обусловлен более высокой плотностью SSRs в составе хромосомы 2, что повышает вероятность их вовлечения в формирование сложных микросателлитов. Оказалось, что большинство сложных микросателлитов составлено из разных мотивов, отличающихся как по размеру, так и по нуклеотидному составу, и это вполне согласуется с данными по структуре компаундов в геноме E. coli [18] и у видов рода Lactobacillus [19]. В то же время у эукариот, по меньшей мере в 90% всех обнаруженных 2-SSR-компаундов, выявленные мотивы имели очень схожую структуру [16]. Подобные различия в структурной организации сложных микросателлитов прокариот и эукариот, возможно, определяются разными механизмах их возникновения: фиксация полиморфизмов в составе разных SSR-локусов с последующим их вовлечением в формирование сложных микросателлитов у прокариот и последовательная экспансия вырожденных повторов в составе одного SSR-локуса у эукариот.

Таким образом, нами обнаружена вырожденность и малая копийность мотивов в составе большинства выявленных в геномах B. pseudomallei микросателлитов. Эти результаты можно рассматривать как подтверждение гипотезы, согласно которой протяженные локусы SSRs подвержены отрицательному отбору в геномах большинства прокариот, способных выживать как в организме хозяина, так и во внешней среде, наряду с увеличением размера и GC-обогащенностью их геномов [3]. Несмотря на значительный диапазон вариативности размера и GC-содержания геномов B. pseudomallei, Lactobacillus spp. и E. coli, единый характер направленности изменений в содержании микросателлитов может быть отражением экологических особенностей этих бактерий. Возможно, в основе выявленных тенденций, вырожденности и низкой копийности мотивов в составе микросателлитов, лежит механизм накопления точечных мутаций в локусах SSRs, что приводит к прерыванию блока повторов в результате формирования легко преодолимых в процессе репликации вторичных структур, стабилизирующих длину микросателлитного локуса.