Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 2, стр. 339-348

ПЕПТИДНЫЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРЫ

Пинеалон ‒ нейропротекторный пептид Glu-Asp-Arg с молекулярной массой около 418 Да [5]. В клиническом исследовании 72 пациента 30–74 лет с последствиями черепно-мозговой травмы и церебрастенией в дополнение к стандартной терапии ежедневно в течение 20–30 дней получали перорально пептид EDR. Отмечено улучшение памяти, снижение длительности и интенсивности головных болей, а также появление эмоциональной уравновешенности. У пациентов с последствиями черепно-мозговой травмы наблюдали регресс очаговой симптоматики и улучшение речевой функции при моторной и сенсорной афазии. У пациентов с церебрастенией под влиянием пептида EDR уменьшалось число ошибок при выполнении корректурной работы, повышался интегральный показатель работоспособности [6].

Пероральное применение пептида EDR для коррекции психоэмоционального и функционального состояния ЦНС у 75 лиц пожилого возраста привело к повышению кратковременной и долговременной памяти, а также к снижению индекса тяжести состояния [7].

Влияние пептида EDR на функциональную активность ЦНС изучено также на крысах с экспериментальной пренатальной гипергомоцистеинемией. Известно, что индукция окислительного стресса in vivo сопряжена с повышением содержания гомоцистеина в крови животных, со снижением когнитивных способностей и нарушениями глутаматергической системы мозга. Внутримышечное введение пептида EDR способствовало улучшению пространственной ориентации и обучаемости потомства крыс в тесте “водный лабиринт Морриса”. Можно полагать, что защитное действие трипептида связано с его способностью подавлять накопление активных форм кислорода (АФК) в нейронах, повышая их устойчивость к окислительному стрессу и предотвращая взаимодействие гомоцистеина и его производных с рецепторами глутамата [8]. Оценено также влияние пептида EDR на активацию МАР-киназы в культурах гранулярных клеток мозжечка. Профиль активации МАР-киназы определяет, какие гены, связанные с адаптацией или апоптозом, будут экспрессироваться в данный период времени. Добавление трипептида в культуры клеток приводило к удлинению лаг-периода активации МАР-киназы, что можно рассматривать как защиту от токсического действия гомоцистеина [9, 10].

Обнаружена способность пептида EDR восстанавливать морфологию шипиков в нейронах стриатума мышей, на которых моделировали болезнь Хантингтона [11]. Кроме того, в первичной культуре нейронов гиппокампа мышей в условиях амилоидной синаптотоксичности (модель болезни Альцгеймера) пептид EDR в концентрации 200 нг/мл повышал количество грибовидных шипиков нейронов на 71%, доводя их содержание до нормального уровня [12].

Пептид DS (Asp-Ser) нормализует среднесрочную память и способность мух линии agnts3 Drosophila melanogaster к обучению. У мух этой линии мутирован ген limk1, кодирующий ключевой фермент ремоделирования актина (LIMK1), нарушение синтеза которого приводит к развитию болезни Паркинсона. Таким образом, пептид DS может изучаться на моделях болезни Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваний.

В органотипической культуре ткани сетчатки цыплят и крыс мишенью пептида DS служат белки Brn3 (дифференцировка ганглиозных клеток сетчатки), Pax6 (начальные стадии дифференцировки клеток сетчатки), Math1 (дифференцировка амакриновых нейронов сетчатки), TTR (транс-тиретин – маркер пигментного эпителия сетчатки), Prox1 (дифференцировка амакриновых и ганглиозных нейронов сетчатки), Ki67 (пролиферативный белок). Пептид DS стимулирует синтез белков Brn3, Pax6, Math1, TTR, Prox1, CXCL12, Ki67 и снижает синтез проапоптотического белка р53 в ткани сетчатки. Таким образом, пептид DS стимулирует пролиферацию, дифференцировку, функциональную активность, снижает уровень апоптоза клеток пигментного эпителия и нейронов в органотипической культуре ткани сетчатки.

Данная работа направлена на проверку предположения о возможной связи нейропротекторного действия перечисленных пептидов с их воздействием на экспрессию гена Fkbp1b, продукт которого способствует восстановлению функции кальциевых каналов нейронов головного мозга.

Мы предположили, что пептиды EDR и DS влияют на экспрессию гена Fkbp1b. Показано, что короткие биологически активные пептиды, в том числе EDR, связываются с FITC-мечеными гистонами пшеницы. В случае гистона Н1 пептиды связываются с N-концевыми областями гистонов, которые содержат гомологичные пептидсвязывающие мотивы. Связывание пептидов с гистонами и комплексами гистон-дезоксирибоолигонуклеотид зависит от природы гистона, первичной структуры пептида и олигонуклеотида, т.е. существует сайт-специфическое взаимодействие коротких пептидов с гистонами и комплексами гистон-олигонуклеотид. Гистон Н1 предпочтительно связывается с одноцепочечными олигонуклеотидами через гомологичные участки в С-концевой области белка. В отличие от гистона Н1 коровые гистоны связываются преимущественно с двухцепочечными метилированными олигонуклеотидами и метилированной ДНК. Величины констант Штерна‒Фольмера взаимодействия гистонов Н1 и кор-гистонов с двухцепочечными полуметилированными олигонуклеотидами выше, чем с неметилированными. ДНК или дезоксирибоолигонуклеотиды в составе комплекса с гистонами могут усиливать или препятствовать связыванию пептидов. Предполагается, что сайт-специфические взаимодействия коротких биологически активных пептидов с гистонами в составе хроматина могут служить контрольным механизмом регуляции активности генов и клеточной дифференцировки [13].

Для подтверждения этого предположения с помощью методов молекулярного докинга и минимизации геометрии с использованием программного обеспечения Molecular Operating Environment 2016.08 нами определены специфические сайты связывания гистонов, с которыми взаимодействуют короткие пептиды EDR и DS.

МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА ГИСТОН‒ПЕПТИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

Расчет пространственной конформации ди-, три- и тетрапептидов проводили методом молекулярной механики. Данный подход позволяет вычислять потенциальную энергию заданной системы по закону Гука: атомы в молекуле рассматривали как упругие шарики различных размеров (по типу атома), соединенные пружинками различной длины. Пептиды строили в левовращающей конформации. В расчетах полную энергию минимизировали относительно начала координат:

где E_tot ‒ полная потенциальная энергия макромолекулы; Е_str ‒ энергия деформации связей; E_bend ‒ энергия деформации валентных углов; E_tors ‒ энергия деформации торсионных углов; E_vdw‒ энергия вандерваальсовых взаимодействий; E_elec ‒ энергия электростатического взаимодействия. Полную стерическую энергию системы рассчитывали с учетом силового поля, которое содержит набор подгоночных эмпирических параметров (силовых констант) и стандартных значений длин связей, торсионных и валентных углов. Учитывали также вандерваальсовы взаимодействия в молекуле. Первое слагаемое уравнения описывает изменения энергии при растяжении или сжатии связи относительно своей стандартной длины: где k_b ‒ силовая константа растяжения связей; b₀ ‒ стандартная длина связи; b – текущая длина связи.

Угловые деформации описывали уравнением:

Где k_θ ‒ силовая константа деформации валентных углов; θ₀ ‒ равновесное значение валентного угла; θ ‒ текущее значение валентного угла.

Вклад в потенциальную энергию вращения вокруг двугранных углов рассчитывали с использованием уравнения:

где k_φ ‒ торсионный барьер (барьер вращения); φ ‒ текущее значение торсионного угла; n – период (число минимумов энергии на один полный цикл); φ₀ ‒ стандартное значение торсионного угла.

Вандерваальсовы взаимодействия между непосредственно связанными атомами обычно выражаются потенциалом Леннард-Джонса:

где A_ij ‒ коэффициент вклада отталкивания; B_ij ‒ коэффициент вклада притяжения; d_ij ‒ расстояние между атомами i и j.

Электростатические силы описываются функцией, представляющей собой выражение для кулоновского взаимодействия:

где ε ‒ диэлектрическая проницаемость; Q₁ и Q₂ ‒ заряды на взаимодействующих атомах; d – межатомное расстояние.

При расчете конформаций молекулы важной задачей было правильное определение силового поля [14]. Существует несколько способов задания силового поля: MMFF94x, Amber12EHT, BIO+, OPLS, каждый из которых различается степенью возможных приближений и допущений. При использовании поля MMFF94x учитываются потенциальные поля, формируемые всеми атомами молекулярной системы. Метод обеспечивает достаточно высокую точность и подходит для малых молекул. Amber12EHT – это полноатомное силовое поле, разработанное для расчета конформаций белков, нуклеиновых кислот и малых молекул [15]. В данной работе конформации молекул коротких пептидов рассчитывали с использованием силового поля Amber12EHT. После построения компьютерных моделей пептидов важным этапом была геометрическая оптимизация их структур путем минимизации энергии методами скорейшего спуска и сопряженных градиентов. Метод скорейшего спуска основан на постепенном сдвиге атомов молекулы пептида вдоль координатных осей для нахождения нового положения с более низкой потенциальной энергией. Когда заданное условие энергетического минимума достигнуто, минимизация прекращается. Этот метод используется для структур, находящихся вдали от энергетического минимума. Для более точного расчета используется метод сопряженных градиентов, основная идея которого заключается в постепенном накоплении информации о минимизированной функции от итерации к итерации. Также учитывается градиент энергии на каждой стадии минимизации, который далее используется в качестве дополнительной информации для расчета нового вектора направления процедуры минимизации. Так, каждая последующая стадия непрерывно уточняет направление к минимуму.

Молекула, полученная после геометрической оптимизации, имеет множество изомеров, которым соответствуют различные значения энергии. Важной задачей является поиск наиболее энергетически выгодных изомеров молекулы, которые имеют схожие значения полной потенциальной энергии (E_tot) в пределах определенных минимумов.

В нашей работе конформационный поиск проводили с использованием методов молекулярной динамики, цель которых – воспроизведение движения молекулы в заданный интервал времени, в данном случае 1 фс. Метод основан на классическом уравнении движения Ньютона:

где F_i(t) ‒ сила, действующая на атом i в момент времени t; m_i ‒ масса i-го атома; a_i(t) ‒ ускорение атома i в момент времени t.

На заключительном этапе конформационного поиска оценили физико-химические особенности конформеров пептидов, рассчитали длину пептидной цепи молекулы, заряды и среднюю потенциальную энергию. Поскольку в работе исследовали пептиды, состоящие из четырех аминокислотных остатков, измеряли только три торсионных угла. Число найденных конформаций в пептидах показало насколько молекулы пространственно стабильны или нестабильны. Предполагалось, что энергетически наиболее выгодные стереоизомеры молекул обладают биологической активностью и именно в такой конформации выполняют свои функции.

Для построения компьютерной модели взаимодействия пептидов с гистонами пшеницы необходимо создать их гомологичные модели, так как пространственные структуры гистонов пшеницы ранее не были расшифрованы. Для создания таких моделей гистонов H1, H2b, H3 и H4 использовали их структуры из базы данных белковых структур (Protein Data Bank, PDB) 5NL0, цепь Z; 1KX5 цепь A и цепь H; 1EQZ, цепь D.

В таблице представлены аминокислотные последовательности гистонов пшеницы и соответствующие им последовательности гистонов, полученные из базы данных PDB.

Для построения моделей гистонов использовали метод гомологического моделирования, который позволяет оценивать степень гомологии первичной структуры исследуемых белков с трехмерными структурами из базы данных PDB, расшифрованными с помощью рентгеноструктурного анализа или ядерно-магнитного резонанса.

Активные сайты связывания пептидов в молекулах гистонов находили по методу Edelsbrunner [16]. Этот метод основан на поиске энергетически наиболее предпочтительных участков связывания пептида, выделенных в структуре гистона альфа-сферами. Этот метод позволяет определить регионы жесткой атомной упаковки, но не учитывает сайты, “слишком подверженные” растворителю (сайты, находящиеся на поверхности молекулы). Найденные сайты ранжировали по склонности к связыванию лиганда (PLB), основанной на аминокислотном составе кармана [16, 17].

Докинг ‒ компьютерное моделирование взаимодействий между лигандом (пептидом) и активным сайтом рецептора (гистона). Метод докинга включает подстановку лиганда в различных конформациях в сайт связывания, а также расчет оптимальной взаимной ориентации молекул пептида и гистона при их связывании и энергии связи (ккал/моль). Использовали “полугибкий” докинг, где учитывали конформационную подвижность только пептида, а боковые группы гистонов были жесткими. При расчете оптимальных пространственных конформаций взаимодействия пептидов и гистонов учитывали площадь контакта, число водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. Использовали силовое поле Amber12EHT и генетический алгоритм поиска GBVI/WSA. Решения докинга ранжировали по величинам оценочной функции (∆G), которую рассчитывали по следующей формуле:

где c ‒ значение потери ротационной и трансляционной энтропии комплекса; α, β ‒ экспериментально определенные константы, которые зависят от силового поля; E_coul ‒ значение кулоновской энергии, которая рассчитывается с использованием заряда системы при диэлектрической константе равной 1; E_sol ‒ значение электростатической энергии растворителя; E_vdw – вандерваальсовый вклад в энергию взаимодействия; SA_weighted ‒ вклад молекулярных оболочек в значение энергии.

Решения докинга ранжировали по убыванию от энергетически наиболее выгодного до наименее выгодного. После анализа данных докинга подбирали энергетически наиболее выгодный комплекс пептида и гистона.

Модуль Ligand Interactions, предоставляющий возможность визуализировать активный сайт комплекса в виде диаграммы, реализован в программе Molecular Operating Environment 2016. Аминокислотные остатки в активном сайте идентифицируют в два этапа: (1) аминокислоты рецептора, ионы и молекулы растворителя, которые сильно взаимодействуют с лигандом (взаимодействия при образовании водородной связи); (2) аминокислоты рецептора и ионы, которые близки к лиганду, но их взаимодействия с лигандом слабые или диффузные, такие как коллективные гидрофобные или электростатические взаимодействия.

РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА ГИСТОН-ПЕПТИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

В нашей работе пептиды связывались преимущественно с гистонами H1.1, H1.3 и H1.6 в участке, образованном остатками Tyr, His, Arg и Lys, локализованными в петлях. На рис. 1 и 2 показаны энергетически наиболее выгодные варианты гистон‒пептидных взаимодействий.

Нами показано, что пептиды предпочтительно связываются с гистонами по сайтам, богатым положительно заряженными остатками аргинина и лизина, которые в большом количестве содержатся в N-концевых участках гистонов. Мы предполагаем, что в этих сайтах происходит конкурентное связывание пептидов и других регуляторных факторов с гистонами. В связи с этим предполагается, что связывание пептида с гистонами может служить дополнительным механизмом, через который реализуется биологический эффект.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изменение концентрации ионов кальция в нейронах млекопитающих считается признаком старения головного мозга. Дисрегуляцию функций Са²⁺-зависимых нейронов при старении, во многом связанную с типом клеток и отделом ЦНС, в котором они локализованы, обнаружили еще в прошлом веке [18, 19]. Один из наиболее существенных признаков старения CA1-пирамидных нейронов дорсального гиппокампа, отвечающего за обучение и память, ‒ повышение Ca²⁺-зависимого потенциала с последующей K⁺-зависимой медленной гиперполяризацией (sAHP) [20‒22]. Доказано, что sAHP генерируется гиперполяризующими Ca²⁺-чувствительными K⁺-каналами, которые активируются Ca²⁺-индуцированным потенциалом действия и характеризуются выходом Са²⁺ из рианодинчувствительных (RYR) кальциевых депо [23‒25].

При старении в пирамидных нейронах гиппокампа наблюдается увеличение амплитуды и развитие медленной постгиперполяризации электрофизиологических процессов, связанных с обменом Са²⁺. Более того, выявлены изменения конформации L-образных рианодиновых Са²⁺-каналов, коррелирующие со снижением пластичности нейронов, что сопровождается нарушением процессов обучения и запоминания [26, 27]. Обнаружено также возрастное снижение экспрессии гена, кодирующего FK506-связывающий белок 12.6/1b (FKBP1b, пептидилпролил-цис-транс-изомераза, ингибирующая выход Ca²⁺ из RyR-каналов саркоплазматического и эндоплазматического ретикулума нейронов) [28]. Белки FKBP1a/1b, или FKBP12/12.6 относятся к классу иммунофилинов, связывающих иммунодепрессант рапамицин. В мышечных клетках FKBP1a/1b также взаимодействует с RyR и препятствует выходу Ca²⁺ [22]. При старении в нейронах гиппокампа снижается синтез белка FKBP1b, тогда как синтез RyR2 и FRAP/mTOR (мишень рапамицина) активируется [22]. Нарушение функции белка FKBP1b, дестабилизирующее гомеостаз Ca²⁺ в нейронах гиппокампа, приводит к появлению признаков старения ЦНС у молодых животных. Подавление активности гена Fkbp1b в нейронах гиппокампа молодых крыс усиливает ток Ca²⁺, что нарушает возбудимость клеток, вызывая ускоренное старение нервной системы [29, 30].

Цитоплазматический белок FKBP1a является рецептором иммунодепрессанта рапамицина, применяемого для подавления реакции отторжения при трансплантации. Рапамицин предотвращает активацию T- и B-клеток интерлейкином-2 (IL-2) и широко используется при стентировании [31]. На мышиных моделях показана эффективность рапамицина при аутоиммунных заболеваниях [32]. Рапамицин связывается с белком FKBP1a, после чего комплекс (FKBP1a)/рапамицин распознает домен FRB (Rapamycin Binding domain) mTOR и ингибирует комплекс 1 mTOR (mTORC1). Связывание рапамицина с белком FKBP1a приводит к дестабилизации mTORC1 [33], который регулирует аутофагию, рост и выживание клеток. Рапамицин подавляет также реакцию на IL-2, благодаря чему препятствует развитию иммунного ответа.

Рапамицин вытесняет белок FKBP1b из RyR в миоцитах, увеличивает sAHP, а также повышает высвобождение Ca²⁺. Более того, нокаут FKBP1b in vivo ассоциирован с повышением синтеза RyR2 и mTOR, связанных с регуляцией трансляции белков, отвечающих за пролиферацию. Таким образом, нарушение функции FKBP1b может ускорить процесс старения, влияя на регуляцию работы Са²⁺-каналов в нейронах гиппокампа [29, 30, 34].

Селективное нарушение функции белка FKBP1b в нейронах гиппокампа молодых крыс, вызванное микроинъекцией векторов на основе аденоассоциированных вирусов, экспрессирующих малые интерферирующие РНК к FKBP1b, или введением рапамицина, увеличивает sAHP и способствует Ca²⁺-дисрегуляции гиппокампа. Более того, экспрессия гена Fkbp1b снижена в гиппокампе крыс с ранней стадией болезни Альцгеймера. Все это позволяет предположить, что снижение экспрессии FKBP1b можно рассматривать как ключевой фактор, связанный со старением и развитием нейродегенеративных заболеваний, обусловленных нарушением кальциевой сигнализации в нейронах головного мозга, и как новую терапевтическую мишень [30].

Показано, что cверхэкспрессия белка FKBP1b в гиппокампе предупреждает вызванное старением снижение памяти и дисфункцию Ca²⁺-зависимых нейронов. Чтобы установить это, вставить в гиппокамп 13- и 19-месячных самцов крыс вводили вектор, экспрессирующий Fkbp1b. Когда животные достигали возраста 21 мес., оценивали их работоспособность и состояние памяти в водном лабиринте Морриса [35]. Оказалось, что повышение активности FKBP1b сопровождается улучшением пространственной памяти у старых крыс. Они выбирали более короткий путь для выхода из водного лабиринта и делали это быстрее, чем контрольные крысы, которым вводили ген зеленого флуоресцентного белка. После этого сравнивали изменение экспрессии 2342 генов в клетках гиппокампа старых и молодых животных. Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что старение нервной системы коррелирует со снижением экспрессии гена Fkbp1b. Гены, экспрессия которых снижается при старении и восстанавливается при активации гена Fkbp1b, связаны преимущественно с различными структурами нейронов, включая цитоскелет и мембранные каналы. Напротив, гены, активность которых усиливается при старении и не восстанавливается при активации гена Fkbp1b, связаны прежде всего с нарушением функций рибосом и лизосом глии. Восстановление структуры микротрубочек нейронов подтверждено иммуногистохимическими методами. По-видимому, в гиппокампе и других структурах головного мозга, ответственных за поведение, кратковременную и долговременную память, существует сеть генов, модулирующих функции нейронов. При старении в этой сети развиваются дисрегуляторные процессы, приводящие к нарушениям памяти, которые можно восстановить с помощью сверхэкспрессии Fkbp1b [35].

Согласно нашей гипотезе, пептиды EDR и DS, проникая в ядро и ядрышко [36], способны связываться с гистоном H1.3, что должно привести к изменению конформации гистона и повлечь за собой изменение доступности генов, в частности Fkbp1b, для транскрипции. В свою очередь, активация транскрипции Fkbp1b должна способствовать синтезу белка FKBP1b и активации выхода Ca²⁺ из саркоплазматического и эндоплазматического ретикулума нейронов, что приведет к нормализации функциональной активности нейронов. В пользу этой гипотезы свидетельствуют нейропротекторные эффекты пептидов EDR и DS [1‒3, 5‒13, 36]. Эта гипотеза нуждается в экспериментальном подтверждении, которое мы предполагаем получить в дальнейших исследованиях.

Работа выполнена за счет благотворительных взносов, полученных Санкт-Петербургским институтом биорегуляции и геронтологии.

Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов.