Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 1, стр. 95-102

ВВЕДЕНИЕ

Опухоль представляет собой гетерогенную клеточную популяцию, в которой выделяют более дифференцированные клетки, формирующие основную массу, и некоторое количество клеток, обладающих свойствами стволовых [1]. Раковые стволовые клетки (РСК) имеют более высокий опухоль-инициирующий потенциал и большую устойчивость к химиотерапевтическим препаратам, чем остальные клетки опухоли [2‒4]. Попадание РСК в кровеносную систему обуславливает возможность формирования новых опухолевых очагов – метастазирования [5‒7], поэтому сохранение небольшого количества РСК в организме пациента после эрадикации основной опухолевой массы может быть связано с последующим рецидивом онкологического заболевания. Изучение характеристик РСК и расшифровка регуляторных механизмов, лежащих в основе злокачественного фенотипа, вызывает большой интерес [8, 9]. Подобные исследования особенно необходимы в случае высокоагрессивных онкопатологий с низкой общей выживаемостью пациентов. К таким заболеваниям относится трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), который, в отличие от других подтипов рака молочной железы (РМЖ), характеризуется неблагоприятным прогнозом и отсутствием эффективной направленной терапии [10, 11]. Предполагаемое активное участие РСК в агрессивном течении ТНРМЖ и низкой выживаемости пациентов подкреплено рядом наблюдений [12‒14]. Изучение вклада РСК при ТНРМЖ затруднено тем, что традиционные методы идентификации РСК основаны на выделении этих клеток по косвенным признакам [15]. В 2003 году Al-Hajj и соавт. впервые идентифицировали в резекционном материале РМЖ популяцию клеток, которые имели фенотип CD44⁺/CD24^−/low и обладали выраженными опухоль-инициирующими свойствами [16]. Трансплантация всего нескольких сотен таких клеток мышам с иммунодефицитом вызывала развитие опухолей с восстановлением гетерогенности, присущей исходной материнской опухоли. В то же время, введение животным нескольких десятков тысяч опухолевых клеток, не подвергшихся фракционированию, не приводило к формированию новообразований. Чуть позже было установлено, что раковые клетки с повышенной экспрессией гена внутриклеточной альдегид-дегидрогеназы 1 (ALDH1) также обладают способностью к инициации опухолей [17]. В настоящее время повышенный уровень ALDH1 и фенотип CD44⁺/CD24^−/low активно используют в качестве признаков, по которым выделяют популяции РСК при РМЖ. Однако пока нет достаточно убедительных данных о предпочтительности одного из этих методов детекции. При этом по результатам ряда исследований пересечение субпопуляций CD44⁺/CD24^–/low и ALDH1⁺ оказывается довольно низким, что диктует необходимость поиска более точных способов селекции РСК [18‒20]. Кроме того, оба метода позволяют получить лишь обогащенную фракцию РСК, но не чистую популяцию, что также влияет на качество и воспроизводимость результатов исследований [21].

В 2015 году была разработана лентивирусная репортерная система SORE6, позволяющая идентифицировать клетки, в которых активны OCT4 и SOX2 – основные факторы транскрипции, характерные для эмбриональных стволовых клеток [15]. В данной системе шесть повторов элемента, чувствительного к SOX2/OCT4 (SORE6), клонированного из промоторной области NANOG человека, соединены с минимальным цитомегаловирусным промотором (minCMV), контролирующим экспрессию репортерных генов. Последовательность, кодирующая дестабилизированный флуоресцентный белок mCherry (dsmCherry), экспрессируется под контролем OCT4- и SOX2-зависимого промотора, что позволяет визуализировать непосредственно каждую клетку SOX2⁺/OCT4⁺ и наблюдать динамику изменений во времени. С помощью этого метода удалось выделить фракцию клеток SOX2⁺/OCT4⁺ из нескольких линий гормончувствительного РМЖ и первичных культур, полученных из образцов ткани РМЖ. Высокий потенциал образования опухолей и устойчивость к химиотерапевтическим препаратам показан в экспериментах in vitro и in vivo [15]. На сегодняшний день нет данных об использовании репортерной системы SORE6 для выделения и характеристики РСК в линиях ТНРМЖ, что, по-видимому, обусловлено ее относительной новизной.

В предварительном исследовании мы сравнили содержание клеток SORE6⁺ и ALDH1 в линиях ТНРМЖ и обнаружили малую перекрываемость количественных значений этих популяций [22]. В данной работе мы модифицировали репортер для удобства селекции РСК на магнитных микросферах и охарактеризовали отобранные клетки по содержанию NANOG, ключевого фактора транскрипции эмбриональных стволовых клеток, экспрессия которого регулируется активностью OCT4 и SOX2.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные линии. В работе использованы клеточные линии Американской коллекции типовых культур (ATCC^®) HEK293T и линии ТНРМЖ HCC1806 и MDA-MB-453. Клетки культивировали при 37°С и 5% CO₂ в среде RPMI1640 или DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, глутамина и антибиотиков пенициллина и стрептомицина.

Сборка и клонирование репортера SOX2/OCT4. Последовательность SORE6, слитую с minCMV, и PEST-сигнал для дестабилизации mCherry синтезировали de novo с использованием последовательностей, приведенных в [15]. Олигонуклеотиды, использованные для сборки фрагментов SORE6 и dsmCherry, приведены в табл. 1. Конструкцию FLAG-hinge-CD28TМ амплифицировали с плазмиды pLEF1C@CD20-119R, а mCherry – с плазмиды pLCMV-mCherry (табл. 1). Нуклеотидные последовательности праймеров SORE6 CD8 OE rev, FLAG Myc OE dir и CD28 T2A rev кодировали дополнительно сигнал секреции гликопротеина CD8 (CD8s), эпитоп с-Myc и регуляторный пептид Т2А соответственно. Амплифицированные фрагменты разделяли в 1%-ном агарозном геле, вырезали и очищали на колонках Евроген по протоколу CleanUp mini для выделения из гелей. Далее для формирования единой конструкции SORE6-minCMV-MycFLAG-hinge-dsmCherry проводили перекрывающуюся ПЦР. Эту конструкцию клонировали в новую, предварительно расщепленную лентивирусную плазмиду pLSF-RFP, и нарабатывали с использованием набора QIAGEN Plasmid Midi Kit (“QIAGEN”, ФРГ). Последовательность вставки верифицировали секвенированием по Сэнгеру. Олигонуклеотиды, использованные для сборки SORE6 и PEST, подбирали с помощью программы DNAWorks (https://hpcwebapps.cit. nih.gov/dnaworks). Для подбора праймеров и разработки схемы клонирования фрагментов в единую конструкцию использовали программу SnapGene.

Сборка лентивирусных частиц. Сборку лентивируса проводили в культуре клеток HEK293T. В день перед трансфекцией клетки HEK293T рассевали в шестилуночные планшеты в плотности 10⁶ клеток на лунку. Непосредственно перед трансфекцией клетки переводили в среду Opti-MEM (“Gibco”, США) без добавок. В качестве упаковочной плазмиды и плазмиды, кодирующей белки оболочки вируса везикулярного стоматита, использовали psPAX2, безвозмездно предоставленную Didier Trono (Addgene plasmid #12260; http://n2t.net/addgene:12260; RRID:Addgene_12260), и pMD2.G, также безвозмездно предоставленную Didier Trono (Addgene plasmid #12259; http://n2t.net/addgene:12259; RRID:Addgene_12259). Вспомогательные плазмиды и модифицированный вектор SORE6 смешивали в эквимолярном соотношении в среде Opti-MEM так, чтобы на лунку шестилуночного планшета приходилось 3 мкг ДНК. Затем к смеси добавляли раствор полиэтиленимина (PEI 25кДа, “Polysciences”, США) 1 мг/мл, из расчета 3 мкг PEI на 1 мкг ДНК, инкубировали в течение 20 мин и раскапывали на клетки. Клетки инкубировали с плазмидами в течение 3‒4 ч, затем среду меняли на полную DMEM/F12 c 10%-ной сывороткой и антибиотиком. Через 48 ч собирали обогащенную вирусом среду, которую использовали для дальнейшего заражения.

Трансдукция линий ТНРМЖ. Клеточные линии HCC1806 и MDA-MB-453 рассаживали в шестилуночные планшеты с плотностью 50%, вносили среду с лентивирусом и 10 мкг/мл Polybrene (“Sigma”, США). Среду с вирусом перед внесением очищали от дебриса при помощи шприца с одноразовым фильтром с диаметром пор 0.45 мкм (“TPP”, Швейцария). Клетки инкубировали с вирусом в течение 3 ч, затем среду меняли на полную RPMI1640 или DMEM/F12. Для контроля сборки лентивируса и определения чувствительности клеток к трансдукции, каждую клеточную линию инфицировали лентивирусом, кодирующим красный флуоресцентный белок. Результат трансдукции оценивали с использованием флуоресцентного микроскопа ZOE (“Bio-Rad”, США). Количество (%) клеток SORE6⁺ определяли путем подсчета mCherry-флуоресцентных клеток относительно общего количества клеток в поле с помощью программы ImageJ (Wayne Rasband). Анализировали по три поля для каждой линии ТНРМЖ.

Отбор популяции SOX2⁺/OCT4⁺ методом магнитной сепарации. Клетки SOX2⁺/OCT4⁺ отбирали из трансдуцированных линий ТНРМЖ методом позитивной селекции на магнитных частицах. Селекцию проводили с использованием набора EasySep™ Human “Do-It-Yourself” Selection Kit (“STEMCELL™ Technologies”, Канада), предназначенного для отбора клеток человека с помощью моноклональных антител мыши против белка-маркера. Поскольку клетки SOX2⁺/OCT4⁺ экспонировали на своей поверхности пептид FLAG (DYKDDDDK), для обогащения использовали моноклональные антитела против FLAG (“ProteinTech”, 66008-2-Ig, США). Селекцию осуществляли в соответствии с протоколом производителя набора.

Вестерн-блотинг. Клетки, отобранные на магнитных микросферах, лизировали в буфере RIPA (150 мМ NaCl, 1.0% NP-40, 0.1% SDS, 50 мМ Tрис, pH 8.0). Концентрацию белка измеряли при помощи реактива Брэдфорда (“Bio-Rad”, США). Белки разделяли с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали в течение 1 ч в 5%-ном обезжиренном молоке, а затем инкубировали в течение ночи с первичными антителами против NANOG (“PeproTech”, 500-P236, США), разведенными до конечной концентрации 0.1 мкг/мл. На следующий день мембрану отмывали 3 раза от несвязавшихся антител в фосфатно-солевом буфере с добавлением Tween-20 (0.1%) и инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами в разведении 1 : 3000 (“Santa-Cruz”, США). Мембрану проявляли при помощи набора FemtoLUCENT PLUS-HRP (“G-Bioscienses”). С целью контроля нагрузки блот окрашивали антителами к β-актину (AC-15, “Santa-Cruz”).

Анализ результатов. Результаты исследования обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism 5 для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Строение модифицированного лентивирусного репортера SORE6

С применением модифицированного лентивирусного репортера SORE6 нами проведена селекция раковых клеток, обладающих стволовым фенотипом, в линиях ТНРМЖ. Для получения модифицированной репортерной конструкции был использован оригинальный элемент SORE6, содержащий шесть повторов чувствительного к SOX2/OCT4 элемента SORE, клонированного с промотора NANOG человека, а также последовательность, кодирующая дестабилизированный флуоресцентный белок mCherry (dsmCherry) [15]. Для удобства селекции клеток на магнитных частицах в конструкцию, содержащую элемент SORE6 и dsmCherry, дополнительно были введены последовательности, кодирующие пептид FLAG (DYKDDDDK), эпитоп с-Myc (EQKLISEEDL), сигнал секреции гликопротеина CD8 (CD8s), трансмембранный домен гликопротеина CD28 (CD28 TM) и шарнирную последовательность (hinge), представляющую собой фрагмент CH2-CH3 иммуноглобулина IgG4 (рис. 1а). Наличие в клетке стволовых факторов SOX2/OCT4 ведет к активации SORE6 и транскрипции последовательностей под контролем minCMV. CD8s-MycFLAG-hinge-CD28 TM транслируется в виде единого продукта. За счет лидерного сигнала CD8s, который впоследствии отщепляется, полипептид направляется на секрецию к мембране клетки. Встраивание трансмембранного домена CD28 в фосфолипидный бислой обеспечивает заякоривание Myc-FLAG-hinge на поверхности мембраны (рис. 1б). За счет регуляторного элемента Т2А mCherry транслируется в виде отдельного белка. При этом не происходит критической для жизнедеятельности РСК аккумуляции флуоресцентного белка, поскольку сигнал PEST направляет mCherry на путь протеасомной деградации.

Рис. 1.

а – Схема модифицированной лентивирусной конструкции, созданной по итогам клонирования. б – Схематическое расположение белковых продуктов, полученных в результате транскрипции-трансляции лентивирусной репортерной конструкции, активной в раковой стволовой клетке, в области клеточной мембраны. Накопление и деградация белка mCherry позволяет визуализировать в общей популяции клетку, в которой экспрессируются гены стволовых факторов SOX2/OCT4. Заякоривание пептидной последовательности Myc-FLAG-hinge на поверхности мембраны такой клетки за счет трансмембранного домена CD28 позволяет отобрать ее методом магнитной сепарации. LTR (Long Terminal Repeat) – длинный концевой повтор, gag (group antigens) – группоспецифические антигены, env (envelope) – белок оболочки, WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) – посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка.

Линии MDA-MB-453 и HCC1806 содержат популяции клеток, которые экспрессируют SOX2/OCT4 и характеризуются повышенным уровнем NANOG

Содержание популяций SORE6⁺ (%) в линиях ТНРМЖ вычисляли как отношение числа флуоресцентных клеток к общему количеству клеток в поле на микрофотографиях, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа. Анализировали по три поля (микрофотографии) каждой линии клеток. В линии MDA-MB-453 содержание клеток SOX2⁺/OCT4⁺ составило около 48% от общей популяции, в то время как в линии HCC1806 превалировала фракция SOX2⁺/OCT4⁺, которая составила около 78% от общего числа клеток в культуре (рис. 2а, б). Методом вестерн-блотинга показано, что уровень эмбрионального транскрипционного фактора NANOG в селектированных клетках выше, чем в общей популяции (рис. 2в).

Рис. 2.

а – Содержание клеток, экспрессирующих SOX2/OCT4, в линиях MDA-MB-453 и HCC1806, трансдуцированных модифицированным SORE6-репортером. б – Микрофотографии трансдуцированных SORE6-репортером линий HCC1806 и MDA-MB-453, полученные с использованием флуоресцентного микроскопа ZOE (“Bio-Rad”). в – В SORE6⁺-клетках, отобранных с использованием репортера, уровень NANOG повышен по сравнению с неселектированной популяцией.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Концепция существования в опухоли особых клеток, обладающих свойствами стволовых, имеет фундаментальное значение для понимания процессов канцерогенеза, метастазирования и устойчивости к химиотерапии [7, 23]. В последние годы появляется все больше исследований, направленных на поиск и характеристику РСК как в установленных опухолевых клеточных линиях, так и в резекционном материале, полученном от пациентов с различными онкопатологиями [10, 24‒26]. Раковые клетки, обладающие свойствами стволовых, идентифицируют по различным косвенным признакам, например, по экспрессии особых поверхностных антигенов или некоторых внутриклеточных ферментов [6, 13, 18‒20, 24]. Подобные методы не позволяют получить чистую популяцию клеток с повышенным опухоль-инициирующим потенциалом, что ставит под сомнение их точность и может влиять на воспроизводимость результатов исследований. Для идентификации РСК мы использовали сравнительно недавно разработанную лентивирусную конструкцию SORE6, которая позволяет выявлять клетки со стволовыми свойствами по прямым признакам стволовости – активности факторов транскрипции OCT4 и SOX2 [15]. Для удобства обогащения фракции РСК методом иммуномагнитной сепарации репортерную конструкцию модифицировали таким образом, чтобы клетки SOX2⁺/OCT4⁺ с введенным вектором дополнительно экспонировали на своей поверхности пептид FLAG. Модифицированную репортерную конструкцию испытывали на двух линиях ТНРМЖ ‒ HCC1806 и MDA-MB-453. ТНРМЖ характеризуется агрессивностью течения и повышенным метастазированием, что может быть обусловлено наличием выраженной фракции РСК [5, 10, 11, 14, 27, 28]. С использованием модифицированного репортера в обеих линиях удалось визуализировать и отобрать фракцию клеток, экспрессирующих SOX2/OCT4 и экспонирующих на поверхности пептид FLAG. Содержание клеток, обладающих фенотипом SOX2⁺/OCT4⁺, в обеих линиях оказалось весьма высоким и составило около 78% в линии HCC1806 и около 48% – в MDA-MB-453. Подобные значения согласуются с современной тенденцией в области исследования РСК, в рамках которой представления о РСК, как о минорной группе, подвергаются переосмыслению. Согласно последним данным, РСК в общей популяции могут быть представлены в изобилии и активно пролиферировать [29]. Вместе с тем установлено, что введение клеток линии MDA-MB-453 иммуносупрессивным мышам не приводит к формированию опухолей [30]. Таким образом, высокое содержание популяции SOX2⁺/OCT4⁺ в MDA-MB-453 не ассоциировано с туморогенностью этой клеточной линии. Подобное обстоятельство может объясняться как необходимостью вовлечения иных механизмов и факторов в формирование новых опухолевых очагов, так и приобретенными в результате культивирования специфическими особенностями данной клеточной линии [30]. Линия клеток HCC1806 является туморогенной и используется для получения ксенотрансплантатов in vivo, в связи с чем высокое содержание популяции SOX2⁺/OCT4⁺ не вступает в противоречие со свойствами клеточной линии [31].

Транскрипционный фактор NANOG необходим для поддержания плюропотентности эмбриональных стволовых клеток, его ген обычно супрессирован в большинстве тканей взрослого организма. Однако во многих типах раковых клеток, в том числе РМЖ, NANOG гиперэкспрессируется, что приводит к дерегуляции экспрессии многих генов, ассоциированных с онкогенезом и метастазированием [32]. Анализ отобранных клеток SORE6⁺ показал повышение уровня NANOG, экспрессия гена которого регулируется SOX2/OCT4 [33]. В то же время, достаточно высокий уровень NANOG в общей массе клеток в каждой из двух проанализированных клеточных линий согласовывался с высоким содержанием РСК в популяции.

Таким образом, использование модифицированного репортера на SOX2/OCT4 позволяет идентифицировать и отбирать клетки с эмбриональным стволовым фенотипом. Данная модифицированная репортерная конструкция может служить удобным инструментом изучения подобных клеточных популяций.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 18-34-00981/18).

Все процедуры, выполненные в данной работе, соответствуют этическим стандартам институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.