Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 1, стр. 78-86

ВВЕДЕНИЕ

Стабильность РНК в клетке варьирует в широких пределах. Одни РНК очень стабильны – их время жизни составляет десятки часов. К таким относятся рибосомные, транспортные и большинство малых ядерных РНК, а также многие мРНК [1]. Другие РНК распадаются значительно быстрее – иногда за время порядка нескольких минут. Среди таких РНК можно назвать некодирующие РНК, транскрибирующиеся с промоторных или энхансерных областей генов (Cryptic Unstable Transcripts – CUTs, Promoter upstream transcripts – PROMPTs) [2]. Некоторые мРНК также очень нестабильны, например мРНК отдельных онкогенов (c-Fos, c-Jun, c-Myc) и цитокинов (TNF, GM-CSF). Короткое время жизни таких мРНК обусловлено наличием AU-богатых элементов в 3'-нетранслируемых областях (3'-UTR) [3]. Напротив, некоторые другие элементы в составе множества мРНК обусловливают их длительное существование в клетке [4]. Как элементы “стабильности”, так и элементы “ускоренного распада” мРНК функционируют, связываясь со специфическим белками. Часто в регуляции распада мРНК помимо белков участвуют длинные и короткие некодирующие РНК (lnc- и miRNA) [5, 6]. Изменение стабильности РНК относится к важным механизмам, позволяющим клетке регулировать экспрессию многих ключевых генов.

Основным путем распада РНК в клетке является деградация экзонуклеазами с 5'- или с 3'-конца. Нуклеазы Xrn1 и Xrn2 отщепляют нуклеотиды с 5'-конца РНК [7], тогда как нуклеазы Dis3 и PM-Scl 100 (у дрожжей – Rrp44 и Rrp6 соответственно), входящие в состав белкового комплекса, называемого экзосомой, осуществляют деградацию РНК с 3'-конца (Rrp44 также обладает эндонуклеазной активностью) [8]. Матричные РНК и некоторые длинные некодирующие РНК защищены от действия 3'-концевых экзонуклеаз поли(A)-последовательностью длиной до 250 нуклеотидов. Такой “хвост” молекул мРНК синтезируется нематрично канонической поли(А)-полимеразой по завершении формирования 3'-конца транскрипта, генерируемого РНК-полимеразой II [9, 10]. C “хвостом” взаимодействуют поли(A)-связывающие белки (PABPs), которые защищают поли(A) от действия деаденилирующих ферментов (Pan2-Pan3), поэтому его деградация замедляется. По мере укорочения поли(A) до ~110 н. другие деаденилазы (Ccr4-Caf1) начинают действовать активнее, и, в конце концов, такая мРНК становится доступной для действия экзосомы, что приводит к полному разрушению молекулы РНК [11].

У дрожжей хорошо изучена деградация дефектных (с нарушенной вторичной структурой или лишенных некоторых модифицированных оснований) молекул некодирующих РНК. Такие молекулы распознаются комплексом TRAMP, состоящим из трех белков: РНК-связывающего белка Air2p, хеликазы Mtr4p и неканонической поли(А)-полимеразы Trf4p. Этот фермент синтезирует олиго(А)-хвост на 3'-конце РНК, благодаря чему она направляется в экзосому, где претерпевает полную деградацию. Таким образом, в данном случае хвост РНК, состоящий из одних остатков аденозина, не увеличивает время жизни РНК, а напротив, служит сигналом для ее деградации [12–14]. В клетках человека есть два белковых комплекса, схожих с TRAMP, которые направляют РНК в экзосомы, но один из них синтезирует олиго(А)-хвост у РНК, а другой – нет [15].

К малоизученным типам некодирующих РНК относятся транскрипты SINE (short interspersed elements). Сотни тысяч копий этих коротких (100–500 п.н.) мобильных генетических элементов рассеяно по геномам млекопитающих и других высших эукариот [16]. Обычно распространение каждого семейства SINE ограничено одним отрядом или несколькими семействами млекопитающих. Большинство семейств SINE произошло от различных видов тРНК. Много копий SINE находится в интронах генов, а также в UTR, поэтому их последовательности оказываются в составе молекул пре-мРНК, синтезируемых РНК-полимеразой II. Однако автономную транскрипцию SINE осуществляет другой фермент – РНК-полимераза III, которая, как известно, транскрибирует гены тРНК, 5S рРНК и ряда других некодирующих РНК. Небольшие РНК, образующиеся в результате такой транскрипции SINE, могут служить матрицами при обратной транскрипции, приводящей к возникновению в геноме новых копий SINE. Транскрипция SINE РНК-полимеразой III инициируется благодаря наличию в их составе внутреннего промотора этой РНК-полимеразы. Промотор состоит из двух участков (боксы А и В), расположенных в головной части SINE на расстоянии 30–40 п.н. друг от друга (рис. 1). Замечено [17], что в 3'-концевой части многих SINE млекопитающих содержится один или несколько гексамеров ААТААА и терминатор транскрипции (ТТТТ) РНК-полимеразы III (рис. 1). Семейства таких SINE были объединены в класс Т⁺, тогда как семейства SINE, для которых нехарактерно наличие последовательностей ААТААА и ТТТТ, отнесены к классу Т^– [17]. Хорошо известно, что гексамер ААТААА в генах, транскрибируемых РНК-полимеразой II, необходим для формирования 3'-конца мРНК, а именно, разрезания транскрипта и синтеза поли(А) на его конце [10]. Несмотря на то, что свойства РНК-полимераз II и III очень различаются, предполагали [17, 18], а затем экспериментально доказали [19, 20], что РНК, образующиеся при транскрипции РНК-полимеразой III SINE класса Т⁺, полиаденилируются в клетке. Транскрипция таких SINE останавливается на терминаторе, а на 3'-конце образовавшейся РНК синтезируется поли(А) длиной до 250 н. Для такого полиаденилирования необходим гексамер ААТААА, а также два района в SINE, один из которых (β) расположен сразу за промотором (бокс В), тогда как другой (τ) – рядом с хвостовой частью SINE (рис. 1) [20].

Рис. 1.

Схема строения SINE класса T⁺. Головная часть SINE, происходящая от тРНК, содержит боксы A и B, образующие промотор РНК-полимеразы III. Транскрипция завершается на терминаторе в хвостовой части SINE. Образовавшаяся РНК несет сигнал полиаденилирования AAUAAA, который, вместе с последовательностями в районах бета (β) и тау (τ) обеспечивает синтез поли(A) на 3'-конце транскрипта.

Ранее нами показано [19], что полиаденилированные РНК SINE B2 мыши, синтезированные РНК-полимеразой III, значительно более стабильны в клетке, чем неполиаденилированные транскрипты. Теперь мы исследовали, обладают ли такими же свойствами полиаденилированные транскрипты других SINE. A priori нельзя исключить, что ключевую роль в стабильности таких РНК в клетке играет их первичная или вторичная структура, но альтернативой обеспечения их стабильности может быть строение 3'-конца, в частности наличие поли(A)-хвоста.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Плазмидные конструкции. Использованные в работе плазмидные конструкции, несущие SINE c функциональным или инактивированным мутацией сигналом полиаденилирования, описаны ранее: SINE В2, B2_ins80, Dip, Ves, Can, Ere, Tal, Rhin-1B [19, 20] и Rhin-1A [21]. Rhin-1A и Rhin-1B представляют собой сильно отличающиеся варианты одного SINE из генома большого подковоноса (сравнение их нуклеотидных последовательностей приведено на рис. S1 , см. Приложение на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2019/4/ supp_Ustyantsev_rus.pdf). Плазмида, несущая мышиный ген 4.5SI РНК с 5'-фланкирующей последовательностью длиной 32 нуклеотида, описана ранее [22]. Плазмидные ДНК для трансфекции клеток выделяли с помощью набора NucleoBond PC 100 (“Macherey-Nagel”, Германия).

Культивирование клеток, трансфекция, ингибирование транскрипции и выделение РНК. Клетки HeLa растили на чашках Петри (d = 60 мм) в 5 мл среды DMEM с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и трансфицировали ДНК плазмид с помощью реактива TurboFect, согласно протоколу производителя (“Thermo Fisher Scientific”, США). Для трансфекции клеток на одной чашке использовали 5 мкг плазмиды, несущей SINE, 0.5 мкг контрольной плазмиды с геном 4.5SI РНК и 10 мкл TurboFect. Для ингибирования транскрипции через 20 ч после трансфекции к клеткам добавляли актиномицин D до концентрации 5 мкг/мл. Затем, используя гуанидинтиоцианатный метод [23], выделяли суммарную клеточную РНК через разные временные промежутки (от 0 до 180 мин после добавления актиномицина D). После переосаждения этанолом РНК ресуспендировали в буфере: 10 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 2.5 мМ MgCl₂, 0.1 мМ CaCl₂, – содержащем ДНКазу I (100 мкг/мл), в течение 1 ч при 37°C, с последующей экстракцией хлороформом. Переосажденную этанолом РНК растворяли в 60 мкл воды и измеряли концентрацию на спектрофотометре NanoDrop 1000 (“Termo Fisher Scientific”).

Фракционирование клеток и РНК. Клетки HeLa, трансфицированные Rhin-1A или Rhin-1B, снимали с 4 чашек Петри, суспендировали в 2.5 мл буфера HTM-C: 0.1 М NaCl, 50 мM Трис-HCl (pH 8.0), 5 мM MgCl₂, 0.25 M сахароза, – содержащего 1 мМ PMSF. Суспензию разбавляли 2.5 мл буфера HTM-C, содержащего 1% NP-40, инкубировали в течение 5 мин во льду и центрифугировали (10 мин при 1900 × g). Осадок, содержащий ядра клеток, отделяли от цитоплазматической фракции (супернатанта). РНК из ядер выделяли так же, как из целых клеток; цитоплазму экстрагировали смесью фенол (pH 8.0)–хлороформ (1 : 1), после чего РНК осаждали этанолом и обрабатывали ДНКазой I, как описано выше. Для разделения ядерной и цитоплазматической РНК на полиаденилированную, поли(А)⁺, и неполиаденилированную, поли(А)^–, раствор РНК пропускали через колонки с олиго(dT)-целлюлозой в растворе, содержащем 0.5 M LiCl, 10 мM Трис-HCl (pH7.5), 1 мM EDTA, 0.1% SDS. Не связавшийся с колонкой материал представлял собой поли(А)^– РНК. Затем колонку промывали таким же раствором, но с 0.15 M LiCl и, наконец, элюировали поли(А)⁺ РНК, пропуская через колонку H₂O. Полученные фракции РНК анализировали с помощью нозерн-гибридизации.

Гибридизационный анализ РНК. Суммарную РНК (10 мкг), выделенную из клеток на каждой чашке, подвергали элетрофорезу в 6%-ном ПААГ с 6 М мочевиной и переносили на мембрану Hybond-XL с помощью полусухого электроблотинга. Мечение гибридизационных зондов для детекции транскриптов SINE и 4.5SI РНК, описанных ранее [20, 22], проводили, осуществляя ПЦР в присутствии α[³²P]-dATP. Мембрану с иммобилизованной РНК инкубировали с зондом в гибридизационном растворе (50% формамид, 5× раствор Денхардта, 4× SSC, 1% SDS, 0.1 мг ДНК лосося) при 42°C в течение ночи, после чего отмывали в 0.1× SSC с 0.1% SDS при 42°C в течение 1 ч и экспонировали на рентгеновской пленке. Для количественной оценки радиоактивности гибридизационных сигналов мембрану сканировали в фосфоимеджере Cyclone. Величину сигналов транскриптов SINE нормировали по сигналам контрольной 4.5SI РНК. Такое нормирование проводили только для временного промежутка 0–60 мин с момента добавления актиномицина. Для точек 120 и 180 мин к нормированию не прибегали, так как за это время происходил заметный (до 65% от начального уровня) распад 4.5SI РНК (рис. S2 , см. Приложение).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе использовали ранее клонированные в плазмидах копии SINE из геномов различных млекопитающих. Кроме того, были получены те же SINE, но с заменами T на C в сигнале полиаденилирования AATAAA, что приводит к его инактивации. Этими плазмидами, содержащими SINE, а также ген 4.5SI РНК в качестве контроля, трансфицировали выращенные в культуре клетки карциномы человека HeLa. Затем в среду добавляли ингибитор транскрипции актиномицин D и оценивали скорость распада изучаемой РНК, измеряя ее содержание в клетке. РНК, выделенную через определенные промежутки времени после обработки актиномицином D, анализировали электрофорезом в ПААГ с последующим нозерн-блотингом с радиоактивно меченным зондом. Радиавтографы отмытых мембран показаны на рис. 2. Транскрипты SINE с инактивированным сигналом полиаденилирования (C-конструкции) представлены, как правило, одной полосой РНК, соответствующей по длине SINE. РНК SINE с функциональным сигналом полиаденилирования (T-конструкции), помимо первичного транскрипта SINE, представлена полиаденилированной РНК – гетерогенным материалом большей длины. 4.5 SI РНК длиной 98 н., характеризующаяся высокой стабильностью [24], использована как контроль эффективности трансфекции и потерь при выделении РНК; эту РНК также выявляли с помощью радиоавтографии. Как видно из рис. 2, яркость полос, соответствующих первичным транскриптам, быстро снижалась со временем и через 3 ч падала почти до нуля. В то же время интенсивность сигнала от полиаденилированной РНК незначительно снижалась за 3 ч. Это свидетельствует о том, что полиаденилированая РНК SINE значительно стабильней, чем неполиаденилированная.

Рис. 2.

Нозерн-гибридизация РНК из клеток HeLa, трансфицированных различными SINE млекопитающих и обработанных актиномицином D для ингибирования транскрипции. Цифры под дорожками указывают время (мин) после добавления в среду актиномицина D. Для трансфекции использовали SINE c функциональным сигналом полиаденилирования (AATAAA) – Т-конструкции – или без него (ААСААА) – С-конструкции. Полноразмерные первичные транскрипты SINE отмечены черными треугольниками; гетерогенный материал с меньшей подвижностью – полиаденилированные транскрипты SINE; черными кружками отмечены укороченные транскрипты SINE Dip и Ves, не подвергающиеся полиаденилированию [20]. При трансфекции в качестве контроля добавляли ген долгоживущей 4.5SI РНК; его транскрипты отмечены светлыми треугольниками. Исследованные SINE (здесь и на других рисунках): Can – собака, Dip – большой тушканчик Allactaga major, Tal – крот Mogera robusta, Ere – лошадь, Ves – водяная ночница Myotis daubentonii, B2 – домовая мышь, Rhin-1A и Rhin-1B – большой подковонос Rhinolophus ferrumequinum, B2-ins80 – B2 со вставкой длиной 80 п.н.

Для количественной оценки с помощью фосфоимеджера измеряли радиоактивность гибридизационных сигналов и строили графики распада неполиаденилированных и полиаденилированных транскриптов SINE. Они представлены на рис. 3. Из этих графиков видно, что время полужизни (t_1/2) первичных транскриптов C-конструкций большинства SINE составляет 30 мин. Учитывая, что полиаденилирования этих транскриптов не происходит, логично предположить, что снижение их количества со временем – результат деградации. Что касается первичных транскриптов T-конструкций, то их уровень снижается не только вследствие деградации, но и за счет полиаденилирования, поэтому оценка времени полужизни этих РНК, сделанная на основе полученных графиков, на первый взгляд кажется некорректной. Это относится и к полиаденилированным РНК SINE: с одной стороны, они подвергаются деградации (хотя и с малой скоростью, судя по рис. 3); с другой, их количество пополняется за счет полиаденилирования первичного транскрипта.

Рис. 3.

Кинетика деградации транскриптов SINE. Кривые, отображающие распад первичных транскриптов SINE c функциональным сигналом полиаденилирования или без него, обозначены соответственно треугольниками и квадратами, а отображающие распад полиаденилированных транскриптов SINE – кружками. По оси X отложено время в минутах после добавления актиномицина D, по оси Y – содержание транскрипта SINE в процентах от его уровня до добавления актиномицина D. Графики получены на основании трех опытов по трансфекции; показано стандартное отклонение.

Однако возможно, что большинство молекул первичных транскриптов SINE (избежавших полиаденилирования в ядре) выходит в цитоплазму, где они не могут полиаденилироваться и тем самым пополнять фракцию поли(A)-содержащих транскриптов SINE. С целью проверить это мы проанализировали ядерно-цитоплазматическую локализацию транскриптов SINE Rhin-1A и Rhin-1B. Оказалось, что как первичные, так и полиденилированные транскрипты SINE Rhin быстро выходят из ядра в цитоплазму и накапливаются в ней (рис. 4), что согласуется с вышеупомянутым предположением. Таким образом, преимущественно цитоплазматическая локализация транскриптов SINE позволяет не учитывать вклад полиаденилирования в убыль первичных транскриптов Т-конструкций или пополнение пула полиаденилированых РНК SINE. Вследствие этого, по крайней мере в первом приближении, можно определять время полужизни первичных и полиаденилированных транскриптов Т-конструкций по графикам, приведенным на рис. 3.

Рис. 4.

Полиаденилированные и неполиаденилированные транскрипты SINE Rhin-1A и Rhin-1B преимущественно локализуются в цитоплазме. РНК, связывающаяся с олиго(dT)-целлюлозой, – p(A)+, не связывающаяся – p(A)–. Первичные транскрипты SINE отмечены черными треугольниками. М – маркеры длины РНК (число нуклеотидов).

Действительно, в большинстве случаев время полужизни первичных транскриптов T-конструкций и C-конструкций было сходным и составляло около 30 мин. Заметная разница наблюдалась только для SINE Dip: t_1/2 для первичных транскриптов T-конструкций была ~20 мин, в то время как для первичных транскриптов C-конструкций – ~40 мин. Возможно, в данном случае происходит активное полиаденилирование первичного транскрипта T-конструкции Dip, поэтому его уровень быстро снижается (рис. 3). Уровни полиаденилированных транскриптов SINE B2, Can, Dip и Tal практически не изменялись за 3 ч, тогда как транскриптов SINE Ere, Rhin-1A, Rhin-1B и Ves снижались со временем, хотя и медленно – за 3 ч не более чем на 40% от начального.

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы. Во-первых, первичные транскрипты всех исследованных SINE характеризуются коротким временем жизни. Ранее мы наблюдали [24] подобное для 4.5SH РНК (t_1/2 = 20 мин), также синтезируемой РНК-полимеразой III, тогда как другая малая ядерная РНК (4.5SI) оказалась долгоживущей. Такие различия обусловлены тем, что в 4.5SI РНК 5'- и 3'-концевые районы образуют двуспиральную структуру, отсутствующую у 4.5SH РНК [24]. Искусственная замена 3'-концевого района в SINE, ведущая к образованию аналогичной двуспиральной структуре в транскрипте, также многократно увеличивала время жизни РНК [21]. Вероятно, те РНК, которые лишены особых структурных элементов, “защищающих” от действия нуклеаз, быстро деградируют в клетке. По-видимому, это в полной мере относится и к первичным транскриптам SINE.

Во-вторых, полиаденилированные транскрипты SINE проявляют значительно большую стабильность в клетке; при этом от первичных транскриптов они отличаются только наличием длинного поли(A)-хвоста. Такой хвост сам по себе, видимо, не защищает РНК от деградации экзонуклеазами с 3'‑конца. Однако известно, что поли(A)-хвост в мРНК увеличивает время ее жизни в клетке благодаря тому, что он связывается с PABPs, защищающими РНК от действия экзонуклеаз [25]. По-видимому, с поли(A) транскриптов SINE также ассоциированы PABPs, что и приводит к увеличению времени жизни этих РНК (рис. 5).

Рис. 5.

Схема, иллюстрирующая возможный механизм повышения стабильности транскриптов SINE в результате их полиаденилирования. 3'-конец неполиаденилированных транскриптов подвержен деградации экзонуклеазами. Поли(A)-хвост полиаденилированных транскриптов взаимодействует с белком PABP, что защищает его от действия экзонуклеаз.

С целью проверить, будет ли сохраняться замедленная деградация полиаденилированного транскрипта SINE, в состав которого введена дополнительная нуклеотидная последовательность, в SINE B2 между районами β и τ вставили синтетический фрагмент ДНК длиной 80 п.н. Плазмидой, несущей удлиненный В2-элемент, трансфицировали клетки HeLa и оценили стабильность образующегося транскрипта. Надо отметить, что эта вставка сильно изменяла вторичную структуру транскрипта В2 в его центральной части и практически не влияла на укладку РНК в концевых областях (рис. S3 , см. Приложение). Первичные транскрипты SINE со вставкой характеризовались низкой стабильностью, сравнимой с SINE B2 “дикого типа”; в то время как его полиаденилированные транскрипты оказались долгоживущими, хотя и уступали в стабильности нативным (рис. 2 и 3). Таким образом, на время жизни транскриптов SINE мало влияют их длина, первичная и, по-видимому, вторичная структура, тогда как наличие поли(А)-хвоста повышает их стабильность. По всей видимости, в клетке транскрипты SINE в большей степени подвержены действию экзонуклеаз, гидролизующих РНК с 3'-конца, и в меньшей – эндонуклеаз; при этом поли(А)-хвост, ассоциированный с PABP, защищает РНК SINE именно от деградации с 3'-конца.