Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 1, стр. 103-113

ВВЕДЕНИЕ

Урокиназная система ‒ ключевое звено процессов морфогенеза, ангио- и нейрогенеза, заживления ран, а также воспаления и канцерогенеза. Эта система регулирует не только внеклеточный протеолиз, но и адгезию клеток к внеклеточному матриксу (ВКМ), миграцию по градиенту урокиназы (uPA) и хемокинов, а также пролиферацию и выживаемость клеток с участием рецепторов факторов роста [1]. Рецептор uPA (uPAR) участвует во всех этих процессах, которые могут осуществляться также в отсутствие протеолитически активной uPA [2]. Помимо варианта uPAR, заякоренного в мембране через гликозилфосфатидилинозит (ГФИ), существует, как минимум, еще одна “активная” форма uPAR – растворимая форма, suPAR, обнаруженная во многих биологических жидкостях организма. Обе формы ‒ и ГФИ-заякоренная, и suPAR, могут подвергаться ограниченному протеолизу с образованием растворимых N-концевых фрагментов [3]. Наличие такого якоря объясняет многие уникальные функции uPAR. Во-первых, ГФИ делает мембранную форму uPAR высокоподвижной в липидных рафтах, где осуществляются многие его сигнальные функции. Во-вторых, отсутствие трансмембранного и цитоплазматического доменов предполагает участие мембранных партнеров в реализации сигнальных эффектов uPAR [4]. И, наконец, уровень экспрессии мембранного uPAR и его растворимых форм может регулироваться не только протеазами, но и специфичными фосфолипазами (C и D) [3].

С тех пор, как в 1995 году uPAR впервые был обнаружен как одноцепочечный трехдоменный пептид, взаимодействующий с интегринами и Src-киназами в липидных рафтах, дальнейшее изучение функций uPAR выявило спектр процессов, в которых uPAR играет важную, если не главную, роль [5, 6]. При изучении мембранных партнеров, вовлеченных в uPAR-зависимые процессы в клетках, особое внимание привлекают интегрины, рецептор fMLP-хемокина FPRL и рецептор эпидермального фактора роста EGFR [4, 7]. Однако мало известно о роли взаимодействия uPAR с другими лигандами в процессах, связанных с аксональным наведением, дифференцировкой и выживаемостью нейронов. С одной стороны, uPAR взаимодействует с интегринами, рецептором FPRL и тирозинкиназой EGFR в различных типах клеток (не в нервной ткани), где такое взаимодействие регулирует направленную миграцию (хемотаксис), пролиферацию и выживаемость/апоптоз [8‒11]. С другой стороны, опубликованы данные о том, что совместное действие uPAR, интегринов, FPRL или EGFR может регулировать как рост и регенерацию, так и дифференцировку и выживаемость нейронов [12‒15]. Однако механизмы реализации uPAR-зависимых эффектов в нейронах с участием этих рецепторов не установлены. Таким образом, в нашей работе изучена навигационная роль урокиназной системы при росте аксонов, а также возможное взаимодействие uPAR c рецептором FPRL1 на мембране конуса растущего аксона при его регенерации. Изучение участия урокиназной системы в этих процессах позволит глубже понять ее роль в морфогенезе нервной ткани, регенерации нервов, а также при развитии патологических состояний.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Лабораторные животные. Мышей содержали в сертифицированном SPF виварии на территории МГУ. Манипуляции с животными проводили в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ “Об утверждении Правил лабораторной практики” (19.06.2003 г. № 4809). Дизайн исследования одобрен местным этическим комитетом в соответствии с внутренними требованиями, утвержденными Комиссией по биоэтике факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова. Использовали мышей-самцов линии C57/Bl6 в возрасте 4‒5 недель, у которых отсутствовали гены uPA (uPA^–/–) и uPAR (uPAR^–/–). Контролем служили мыши дикого типа (WT). Перед выделением спинальных ганглиев (СГ) животных летально анестезировали изофлурановым наркозом IsoFlo® (USP) в газовой камере.

Модель трехмерной эксплантной культуры спинального ганглия мыши в Матригеле. Методика трехмерной эксплантной культуры СГ мыши в Матригеле описана нами ранее [16]. Для выделения СГ мышей летально анестезировали и декапитировали, фиксировали на операционном столике, операционное поле дезинфицировали 70%-ным раствором этанола, вскрывали кожу и удаляли мышцы. СГ извлекали в асептических условиях под стереомикроскопом Olympus SZ Stereo, используя хирургические инструменты для мелких лабораторных животных. Выделенные СГ сразу помещали в чашку Петри, содержащую стерильный буфер Хенкса, и в условиях культурального ламинара переносили в 8-луночные планшеты (Lab-Tek®, cat#155411), покрывали каплей (100 мкл) Матригеля (Matrigel^TM “BD Biosciences”, США). После полимеризации Матригеля образцы покрывали культуральной средой RPMI и культивировали в клеточном инкубаторе при 37°С и 5% СО₂.

В зависимости от условий эксперимента для стимуляции роста нейритов клетки НЕК293, трансфицированные плазмидами, содержащими кДНК uPA или uPAR мыши, или нетрансфицированные HEK293 в качестве контроля, смешивали со 100 мкл Матригеля и помещали в противоположную сторону от СГ для создания градиента концентрации исследуемых белков (рис. 1). Результаты документировали с использованием стереомикроскопа Olympus SZX16 на 7-е сутки после высадки эксплантов. Изображения обрабатывали (определяли площади СГ и площади отрастания нейритов из СГ) с использованием программы автоматического анализа изображений (ImageJ, Research Services Branch). Для подсчета площадь Матригеля с ганглием и нейритами делили на две части так, чтобы в одной части был Матригель с клетками, в другой – контрольная сторона Матригеля без клеток (рис. 2). Для обсчета результатов площадь СГ с регенерирующими от него нейритами нормировали на площадь CГ. Анализировали результаты, полученные на СГ трех мышей каждой группы (uPA^–/– и WT). Представлены результаты трех независимых экспериментов.

Рис. 1.

Трехмерная модель эксплантов спинальных ганглиев мыши в Матригеле для изучения навигационных свойств урокиназной системы ex vivo.

Рис. 2.

Схема определения площади роста нейритов. Площадь Матригеля с ганглием и нейритами условно делили на две части так, чтобы в одной части был Матригель с клетками HEK293, в другой – контрольная сторона Матригеля без клеток.

Хемотактические свойства uPAR и его взаимодействия с FPRL1 при регенерации нейритов изучали с использованием СГ мышей uPAR^–/–, чтобы исключить влияние эндогенного uPAR. СГ культивировали в условиях, описанных выше. В зависимости от условий эксперимента вносили растворимую форму uPAR (suPAR, Кат. № MBS135764) в концентрации 1 нМ, коклюшный токсин (Pertussis toxin, PT, “Sigma Aldrich” США, Кат. № P7208), блокирующий Gα_i-субъединицу G-белка, ассоциированного с FPRL1 [31], в концентрации 100 мкМ или смесь suPAR с PT. Вещества растворяли в дополнительной капле Матригеля и наносили по разные стороны от СГ после его полимеризации в основном Матригеле. Динамику и направление роста нейритов из СГ документировали на 4-е сутки с использованием фазово-контрастного микроскопа Leica AF6000. Среднюю длину нейрита определяли с использованием программы автоматического анализа изображений (ImageJ, Research Services Branch). Для подсчета изображения СГ условно делили на две части в зависимости от внесенных в Матригель добавок; на каждой половине анализировали среднюю длину нейрита (выраженную в условных единицах), растущего в сторону добавок. Измеряли длину не менее 20 нейритов с каждой стороны СГ. Представлены результаты четырех независимых экспериментов.

Трансфекция клеток HEK293 (ATCC®CRL-1573^TM). кДНК uPA трансфицировали c использованием вектора pcDNA3.1 (“Life Technologies”, США), кДНК uPAR ‒ вектора pN1. Получение кДНК и дизайн векторов описаны нами ранее [17]. Клетки культивировали в стандартной среде DMEM с высокой концентрацией глюкозы (“Hyclone”, США) с 10%-ной фетальной бычьей сывороткой FBS (“Hyclone”) и раствором антибиотика-антимикотика (“Gibco”, США). Tрансфекцию проводили с помощью Lipofectamine 2000 (“Life Technologies”) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в селективной среде с антибиотиком G418 не менее 4 недель. Известно, что клетки HEK293 не экспрессируют uPA и uPAR. Более того, uPA мыши не взаимодействует с uPAR человека [18], поэтому можно предполагать, что наблюдаемые в экспериментах эффекты опосредованы именно uPA и uPAR мыши, которые экспрессируются клетками HEK293 и взаимодействуют с нейритами нейронов мыши.

Анализ секреции uPA и uPAR клетками НЕК293 после трансфекции. Мы предполагаем, что uPA и uPAR действуют на нейриты в виде растворимых форм, поэтому содержание uPA и uPAR мыши в среде культивирования НЕК293 до и после трансфекции было проанализировано методом ELISA с использованием коммерческих наборов фирм “Cell Sciences” (Mouse uPA Antigen ELISA Кат. № CS380A) и “R&D Systems” (Mouse uPAR DuoSet ELISA Кат. № DY531) в соответствии с протоколом производителя. Конечная концентрация uPA и uPAR в кондиционированных средах составляла 20 и 80 нг/мл соответственно.

Получение первичной культуры нейронов спинальных ганглиев. Для получения первичной культуры нейронов СГ мыши, выделенные в стерильных условиях, как описано выше, помещали в раствор коллагеназы (1 мг/мл, Collagenase type I, 285 U/mg, 17100-017, “Gibco”, США), приготовленный на буфере Хенкса, и инкубировали в течение 90 мин при 37°С. Образцы гомогенизировали инсулиновым шприцем, центрифугировали, удаляли раствор коллагеназы и добавляли 1 мл укомплектованной среды DMEM. Образцы пипетировали для дезагрегации клеток в суспензии и наносили на стекла, предварительно покрытые раствором L-полилизина в концентрации 10 мкг/мл (Ф069, “Панэко”, Россия). Клетки оставляли на ночь в инкубаторе до полной адгезии и культивировали далее в среде для роста нейронов Neuro Basal Media с добавками B27 (“Gibco”) в течение 7 дней для полноценной адгезии нейронов и роста нейритов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание нейронов и конфокальная микроскопия. Образцы первичной культуры нейронов промывали раствором фосфатно-солевого буфера (PBS). Далее клетки фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида в течение 10 мин, после фиксации клетки отмывали в PBS. Чтобы блокировать неспецифическое связывание, клетки обрабатывали 10%-ным раствором сыворотки донора вторых антител, приготовленном на 5%-ном бычьем сывороточном альбумине (БСА) (“Sigma Аldrich”, США) в PBS в течение 1 ч. После отмывки образцы инкубировали с первичными антителами кролика против uPAR мыши (“Abcam”, Великобритания) и рецептора хемокинов FPRL1 (“Abcam”) в течение ночи. После трех отмывок в PBS образцы инкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромами AlexaFluor®594 или AlexaFluor®488 (разведение 1 : 500, “Molecular Probes”, США) в течение 1 ч. Для визуализации ядер образцы докрашивали DAPI (“Sigma Аldrich”, 1 : 10 000). После отмывки в PBS образцы заключали в нефлуоресцирующую водную среду Aqua Poly Mount (“Polysciences”, США).

Препараты фотографировали с помощью конфокального микроскопа Leica (TCS SP5, Leica “LeicaMicrosystems”, Германия). DAPI, AlexaFluor®488 и AlexaFluor®594 последовательно возбуждали лазерами с длиной волны 405 и 488, 594 нм соответственно. Все изображения получали при одинаковых настройках микроскопа и хранили в виде файлов TIFF в программном обеспечении Leica LAS, а затем обрабатывали в Photoshop (версия CS5, Adobe).

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SigmaPlot 11.0. Нормальность данных анализировали с помощью теста Шапиро‒Вилка. Данные, полученные в каждой экспериментальной группе, сравнивали попарно, используя тест ANOVA и Holm‒Sidak. При сравнении двух групп использовали t-тест Стьюдента. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистически значимым различие считали при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сверхэкспресcия uPAR приводит к увеличению площади роста нейритов

В экспериментах использовали описанную нами ранее трехмерную эксплантную модель СГ мыши в Матригеле ex vivo [16]. СГ мышей uPA^–/– и WT высаживали в каплю Матригеля. Перед полимеризацией Матригеля в противоположную сторону от СГ вносили нетрансфицированные клетки НЕК293 (рис. 2). В качестве контроля использовали Матригель без добавок. Общую площадь ганглия с отросшими из него нейритами нормировали на площадь СГ (относительная площадь).

Площадь нейритов, отрастающих из СГ в Матригель, у мышей uPA^–/– была статистически значимо больше, чем у мышей WT (uPA^–/– 19.5 ± 8.2 отн. ед.; WT 9.32 ± 2.6 отн. ед., р = 0.01). Также обнаружено, что у мышей uPA^–/– при введении в Матригель нетрансфицированных клеток НЕК293 нейриты отрастают лучше, чем у мышей WT: площадь нейритов, отрастающих от СГ uPA^–/– мышей значимо больше площади нейритов, отрастающих от СГ мышей WT (uPA^–/– 22.45 ± 7.2 отн. ед.; WT 12.45 ± 4.1 отн. ед., р < 0.001) (рис. 3, 4).

Рис. 3.

Спинальные ганглии мышей WT и uPA^–/–, помещенные в каплю Матригеля. Белыми стрелками показаны клетки HEK293, предварительно помещенные в Матригель.

Рис. 4.

Относительная площадь роста нейритов из спинальных ганглиев (СГ) мышей WT и uPA^–/–. В отсутствие добавок (Матригель без клеток) площадь роста нейритов из СГ в Матригель у мышей uPA^–/– значимо больше, чем у мышей WT (р = 0.01). При введении нетрансфицированных клеток НЕК293 в Матригель (HEK293) площадь нейритов, отрастающих от СГ мышей uPA^–/–, больше площади нейритов, отрастающих от WT СГ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, р <0.05. Светло серые столбики – WT, темно-серые – uPA^–/–.

uPAR регулирует траекторию роста нейритов в отсутствие uPA

Далее мы оценили направление роста нейритов СГ мышей WT и uPA^–/– в Матригеле, в который дополнительно вводили клетки НЕК293, стабильно экспрессирующие растворимые формы uPA и uPAR. Оказалось, что uPAR проявляет навигационные свойства даже в отсутствие своего лиганда ‒ uPA (рис. 5). Введение клеток HEK293, трансфицированных uPA (НЕК293-uPA), в группы WT и uPA^–/– стимулировало рост нейритов именно в область локализации uPA по градиенту концентрации: площадь роста нейритов в направлении клеток НЕК293-uPA, экспрессирующих uPA, у мышей WT составила 17.5 ± 0.9 отн. ед., а площадь роста нейритов в противоположную сторону ‒ 9.4 ± ± 0.55 отн. ед., р < 0.001. У мышей uPA^–/– площадь роста нейритов в сторону клеток НЕК293-uPA, экспрессирующих uPA, составила 17.7 ± 0.08 отн. ед., в противоположную ‒ 14.2 ± 0.68 отн. ед., р < < 0.05 (рис. 6).

Рис. 5.

Спинальные ганглии мышей WT и uPA^–/–, помещенные в каплю Матригеля. Справа от спинальных ганглиев находятся клетки HEK293, секретирующие uPAR (HEK293-uPAR, верхняя панель) и uPA (HEK293-uPA, нижняя панель).

Рис. 6.

Относительная площадь роста нейритов из спинальных ганглиев мышей WT и uPA^–/– по градиенту концентрации uPA и uPAR. Клетки HEK293, трансфицированные uPA и uPAR, стимулируют рост нейритов в область их локализации по градиенту концентрации. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, р < 0.05.

Введение в Матригель клеток HEK293, трансфицированных uPAR (НЕК293-uPAR), приводило к увеличению площади нейритов, растущих в сторону этих клеток, у мышей WT и uPA^–/– (у WT ‒ 21.9 ± 1.8 отн. ед. к uPAR и 15.8 ± 2.9 отн. ед. от uPAR, р < 0.001; у мышей uPA^–/– ‒ 22.3 ± 0.89 отн. ед. к uPAR и 13 ± 1.1 отн. ед. от uPAR, р < 0.001) (рис. 6).

uPAR солокализуется с хемокиновым рецептором FPRL1 в нейронах

Чтобы выяснить возможный механизм участия uPAR в регуляции направленного роста аксонов, мы выделили первичную культуру нейронов из СГ мышей WT и c помощью иммунофлуоресцентного окрашивания оценили экспрессию uPAR и рецептора хемокинов FPRL1. Методом конфокальной микроскопии обнаружено, что uPAR и FPRL1 экспрессируются на конусе роста аксонов и в телах нейронов, выделенных из СГ. Более того, выявлена солокализация uPAR и рецептора FPRL1 как в конусах роста, так и в телах нейронов (рис. 7).

Рис. 7.

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание первичной культуры нейронов мыши антителами к uPAR (зеленая флуоресценция) и FPRL1 (красная флуоресценция). uPAR и рецептор хемокина FPRL1 экспрессируются в нейронах спинального ганглия, включая конус роста аксонов. Обнаружена значительная солокализация uPAR и FPRL1 (желтая флуоресценция). На врезке справа увеличенное изображение конуса роста аксона.

suPAR обладает хемотактическими свойствами

Способность suPAR стимулировать рост нейритов изучали с использованием рецептора хемокинов FPRL1 и СГ мышей uPAR^–/–, чтобы исключить эффекты эндогенного uPAR. СГ высаживали в Матригель, после полимеризации слева и справа от СГ добавляли капли Матригеля, в который дополнительно вносили suPAR (1 нМ), PT (100 мкМ), сигналинг от FPRL1, смесь PT и suPAR. Опыт проводили в четырех вариантах: группа 1 ‒ Матригель с добавлением suPAR; группа 2 – Матригель с PT; группа 3 – Матригель с PT с одной стороны и suPAR с другой; группа 4 – смесь PT c suPAR с одной стороны и suPAR с другой. Далее сравнивали между собой среднюю длину нейритов, растущих из каждой стороны СГ, в зависимости от вносимой добавки.

Оказалось, что средняя длина нейритов, растущих в сторону suPAR, в группе 1 значимо превышала среднюю длину нейритов, растущих без вносимых добавок: 3.05 ± 0.25 против 1.87 ± 0.57 усл. ед., р < 0.05 (рис. 8).

Рис. 8.

Микрофотография спинального ганглия uPAR^–/–, помещенного в каплю Матригеля (а), и средняя длина нейритов, растущих из спинального ганглия по градиенту концентрации suPAR (б). а ‒ Справа нанесена капля Матригеля с suPAR; слева ‒ контрольная сторона без добавок. Стрелками обозначено направление роста нейритов. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

Средняя длина нейритов, растущих в сторону PT (группа 2), была значительно меньше, чем у нейритов, растущих в сторону Матригеля без добавок: 1.57 ± 0.42 против 2.63 ± 0.49 усл. ед., р < < 0.05 (рис. 9). Эти данные подтверждают ранее высказанное нами предположение об участии рецептора хемокинов FPRL1 в регуляции направленного роста аксонов.

Рис. 9.

Микрофотография спинального ганглия uPAR^–/–, помещенного в каплю Матригеля (а), и средняя длина нейритов, растущих из спинального ганглия по градиенту концентрации коклюшного токсина (PT), по сравнению с контрольной стороной (б). а ‒ Справа от спинального ганглия нанесена капля Матригеля с коклюшным токсином; слева ‒ контрольная сторона без добавок. Стрелками обозначено направление роста нейритов. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, * р < 0.05.

Оказалось, что в группе 3 средняя длина нейритов, растущих в сторону suPAR, была значимо больше, чем нейритов, растущих в сторону PT: 2.5 ± 0.47 против 1.14 ± 0.12 усл. ед., р < 0.05 (рис. 10).

Рис. 10.

Микрофотография спинального ганглия uPAR^–/–, помещенного в каплю Матригеля (а), и средняя длина нейритов, растущих из спинального ганглия по градиенту концентрации suPAR и коклюшного токсина (PT) (б). а ‒ Справа от спинального ганглия нанесена капля Матригеля с suPAR, слева ‒ PT. Стрелками обозначено направление роста нейритов. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

В группе 4 совместное введение suPAR и PT приводит к значимому уменьшению длины нейритов по сравнению с добавлением только suPAR (1.1 ± 0.3 против 2.0 ± 0.22 усл. ед., p < 0.05) (рис. 11). Эти данные свидетельствуют о том, что блокирование рецептора FPRL1 снижает стимулирующее воздействие suPAR на рост нейритов. Так как мы показали совместную локализацию uPAR и FPRL1 на конусе растущего аксона, то в сумме эти данные говорят о том, что хемотактические эффекты suPAR реализуются через рецептор FPRL1.

Рис. 11.

Микрофотография спинального ганглия uPAR^–/–, помещенного в каплю Матригеля (а), и средняя длина нейритов, растущих из спинального ганглия по градиенту концентрации suPAR, по сравнению со смесью коклюшного токсина (PT) и suPAR (б). а ‒ Справа нанесена капля Матригеля с suPAR, слева – смесь PT и suPAR. Стрелками обозначено направление роста нейритов. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Появившиеся за последние несколько лет данные о роли урокиназной системы в процессах морфогенеза и регенерации тканей и органов предполагают ее участие не только в регуляции протеолиза и деградации ВКМ в направлении роста сосудов и нервов, но и в навигационных процессах, регулирующих траекторию роста аксонов и нервов [12‒14, 17, 24]. Известно, что в развивающейся нервной системе uPA и uPAR экспрессируются в эмбриогенезе в мигрирующих клетках нервного гребня, гранулярных клетках мозжечка, астроцитах, симпатических и сенсорных нейронах и регулируют миграцию, пролиферацию, выживаемость нервных клеток [25‒27]. Полученные нами ранее на эксплантной модели CГ данные свидетельствуют о том, что uPAR, не только стимулирует рост аксонов и миграцию нейральных клеток, но также регулирует траекторию роста аксонов и их ветвление. При этом блокирование uPAR специфичными антителами нарушает траекторию роста аксонов и приводит к появлению аберрантных структур [17].

Мы более детально изучили влияние урокиназной системы на направление роста нейритов. Используя эксплантную модель, мы показали, что площадь роста нейритов у мышей uPA^–/– больше, чем у мышей WT. По-видимому, этот эффект объясняется более высоким уровнем экспрессии uPAR в СГ мышей uPA^–/–, который существенно стимулирует рост нейритов даже в отсутствие uPA [17]. Возможно также, что отсутствие uPA в ганглиях мышей uPA^–/– стабилизирует uPAR на мембранах клеток, так как известно, что комплекс uPA/uPAR быстро удаляется с поверхности клеток путем эндоцитоза [19, 20]. В данном исследовании введение в Матригель нетрансфицированных клеток HEK293 стимулирует прорастание аксонов из СГ в Матригель, и этот эффект у мышей uPA^–/– выражен в большей степени, чем у мышей WT. Известно, что клетки HEK293 секретируют факторы роста и цитокины, стимулирующие рост аксонов, пролиферацию и миграцию нейронов. В число этих факторов входят инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), фактор роста гепатоцитов, тромбоцитарный фактор роста. Клетки HEK293 обладают также нейропротекторными свойствами, которые реализуются с участием PI3K-сигнального пути, связывания свободных радикалов, а также путем модуляции экспрессии субъединиц рецепторов каиновой кислоты (каинатный рецептор KAR) в нейронах [28]. Таким образом, для исключения собственных нейропротекторных и стимулирующих нейритогенез свойств клеток HEK293 в качестве контроля мы использовали нетрансфицированные клетки. Данные о способности uPAR стимулировать рост нейритов и о том, что uPAR выполняет некоторые функции без участия uPA, согласуются с результатами, полученными нами ранее на клеточной модели in vitro, согласно которым сверхэкспрессия uPAR в клетках Neuro2a стимулирует рост нейритов даже в отсутствие uPA в среде культивирования [17].

Нами показано, что рекомбинантные uPA и uPAR стимулируют рост нейритов из эксплантов СГ в Матригель по градиенту концентрации. Такой градиент мы создали, вводя в Матригель клетки HEK293, которые стабильно экспрессируют плазмиды, содержащие кДНК uPA и uPAR мыши. Известно, что uPA стимулирует хемотаксис гладкомышечных клеток за счет связывания с uPAR на мембране [29]. Более того, uPA способна стимулировать нейритогенез и миграцию постмитотических нейронов в развивающейся ЦНС куриного эмбриона, причем скорость роста нейритов пропорциональна концентрации uPA в среде. Основным медиатором этого эффекта также было связывание uPA с uPAR. Экспрессия uPAR обнаружена на поверхности нейронов, особенно на конусах роста нейритов. При этом в развивающейся ЦНС максимальная экспрессия uPAR выявлена в мигрирующих постмитотических нейронах, а также в клетках, в которых протекал нейритогенез [14]. Показано, что растворимая форма suPAR стимулирует хемотаксис клеток в отсутствие uPA [19]. Подобный эффект мы наблюдали у мышей uPA^–/– ‒ uPAR стимулировал рост нейритов из СГ в отсутствие uPA. Площадь роста нейритов в обеих группах животных была статистически значимо больше при стимуляции uPAR, нежели uPA.

Известно, что uPAR не имеет трансмембранного и внутриклеточного доменов ‒ его C-конец ковалентно связан с плазматической мембраной за счет ГФИ-якоря. Это делает возможным взаимодействие uPAR с различными трансмембранными рецепторами и передачу сигнала внутриклеточно, а также для потенцирования сигнальных эффектов мембранных партнеров [4]. К наиболее изученным латеральным лигандам, которые могут опосредовать uPAR-зависимый хемотаксис, относятся рецепторы хемокинов – трансмембранные семидоменные рецепторы, ассоциированные с G-белками [9]. К этому семейству рецепторов принадлежит FPRL1, который связывается с N-формилированными пептидными лигандами, например с fMLP [30]. uPAR состоит из трех LU-доменов (DI, DII, DIII), которые соединяются двумя короткими линкерными последовательностями [4]. Эти три внеклеточных домена uPAR образуют глобулярную структуру, формирующую доступные сайты для латеральных взаимодействий. За связывание с FPRL1 в молекуле uPAR отвечает участок линкерной области между доменами D2‒D3 [31]. На клетках моноцитарной линии THP-1 человека показано, что связывание uPAR с FPRL1 активирует этот семидоменный рецептор и стимулирует хемотаксис по градиенту suPAR [30]. Экспрессия этого рецептора хемокинов на нейронах была показана ранее [21]. При латеральном взаимодействии uPAR с FPRL1 запускается мобилизация Ca²⁺ из депо и активация Erk-киназ [31]. Методом иммунофлуоресцентного окрашивания первичной культуры нейронов с последующей конфокальной микроскопией нами показано, что uPAR экспрессируется и колокализуется с рецептором хемокинов FPRL1 как в теле нейронов, так и на конусе роста. Нами впервые показано, что suPAR обладает хемотактическим эффектом при регенерации нейритов. Этот эффект может быть обусловлен взаимодействием suPAR с FPRL1, так как добавление РТ, блокирующего Gα_i-субъединицу G-белка, ассоциированного c FPRL1, снижает стимуляцию роста нейритов.

Таким образом, нами показана навигационная роль урокиназной системы: отрастающие от ганглиев нейриты растут преимущественно в область высокой экспрессии растворимых форм uPA и uPAR. Более того, uPAR обладает собственными навигационными свойствами, которые проявляются в отсутствие в системе протеолитически активной uPA. Мы предполагаем, что навигационный механизм участия uPAR в определении направления роста аксонов обусловлен его взаимодействием с рецептором FPRL1, который экспрессируется на конусах растущих аксонов и колокализуется при этом с uPAR. Эти данные раскрывают новые механизмы участия урокиназной системы в регуляции направленного роста нервов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект номер 17-04-00386).

Все процедуры, выполненные в данной работе, соответствуют этическим стандартам институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.