Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 2, стр. 308-312

ВВЕДЕНИЕ

Повышение тканевой или клеточной специфичности экспрессии генетических конструкций представляет важную задачу, решение которой позволит усилить избирательность экспрессии целевых генов в выбранных клетках-мишенях. Одним из подходов к решению этой задачи может быть использование двух промоторов c перекрывающейся специфичностью, которые обеспечивают синтез двухкомпонентных регуляторов экспрессии целевого гена [1‒7]. Наиболее универсальный подход основан на том, что каждый промотор регулирует синтез одного из компонентов бинарного трансактиватора, в результате сборки которого активируется экспрессия целевого гена. В известных нам работах [4‒7] используется трансактиватор с ДНК-связывающим доменом на основе белка GAL4, который, как известно, в больших количествах может быть токсичным для клеток [8].

Мы решили создать подобную генетическую схему на основе хорошо известной системы TET-ON 3G. Этот трансактиватор имеет ряд преимуществ: он не токсичен, использует другие участки связывания в промоторах, что позволяет применять его совместно с регуляторными цепями на основе белка GAL4. Кроме того, активность трансактиватора можно дополнительно регулировать с помощью доксициклина. На входе разработанной нами генетической цепи мы использовали промоторы генов сурвивина и теломеразы человека. Это хорошо известные онкоспецифичные промоторы, которые ранее по отдельности использовали для специфической транскрипции целевых генов в опухолевых клетках. Теломераза предотвращает укорачивание теломер при делении клеток, что необходимо для неограниченной пролиферации раковых клеток. Повышенный уровень теломеразы, наблюдаемый более чем в 90% опухолей человека, обусловлен активацией транскрипции ее гена [9]. Белок сурвивин относится к семейству белков-ингибиторов апоптоза. Промотор гена сурвивина также активен во многих типах раковых клеток и малоактивен в нормальной дифференцированной ткани [10]. Таким образом, генетическая схема, позволяющая повысить специфичность экспрессии целевых генов в клетках, где активны промоторы генов как сурвивина, так и теломеразы человека, может найти применение в таргетной генотерапии опухолей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Создание плазмид. Плазмида pTERT-luc, любезно предоставленная И. Черновым (ИБХ РАН), представляет собой плазмиду pGL3-Basic (“Promega”, США), в которую перед геном люциферазы светлячка вставлен промотор (240 п.н.) гена теломеразы человека.

Плазмида pSurv-Luc получена из плазмиды pRL-Surv4-SV40, предоставленной И. Черновым (ИБХ РАН), содержащей ген люциферазы Renilla под контролем промотора гена сурвивина длиной 1500 п.н. Для этого фрагмент XbaI‒HindIII плазмиды pRL-Surv4-SV40, содержащий векторную часть и промотор гена сурвивина, лигировали с фрагментом XbaI‒HindIII плазмиды pTERT-luc, содержащим последовательность, кодирующую люциферазу светлячка.

Плазмиды pTERT-Tr1 и pSurv-Tr2 созданы на основе pBSK(+)Simple-Amp-Trans1-2, полученной методом синтеза генов (фирма “BIOMATIC”, Россия). Она содержат фрагменты трансактиватора, соединенные с соответствующими фрагментами разделенного интеина Npu DnaE. Все синтезированные в плазмиде pBSK(+)Simple-Amp-Trans1-2 последовательности были оптимизированы для высокой экспрессии в клетках млекопитающих. Для создания плазмид pTERT-Tr1 и pSurv-Tr2 фрагменты плазмиды pBSK(+)Simple-Amp-Trans1-2, вырезанные с помощью рестриктаз XbaI‒HindIII, перенесли в плазмиды pTERT-luc и pSurv-Luc соответственно.

Плазмида pP_TRE-Tight-Luc получена путем вставки последовательности гена люциферазы светлячка из плазмиды pRL-Surv4-SV40 (фрагмент XbaI‒HindIII) в полилинкер плазмиды pTRE-Tight (“Clontech”, США).

Правильность сборки всех плазмид проверяли с помощью частичного секвенирования.

Линии клеток. Все клеточные линии культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США) и 2 мМ L-глутамина в атмосфере 5% CO₂ при 37°C.

Трансфекция клеточных линий. Трансфекцию клеток проводили с использованием линейного полиэтиленимина (PEI, 25 кДа, “Polysciences”, ФРГ, кат. № 23966). Плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с использованием набора GeneJET Plasmid Maxiprep (“Fermentas”, США, кат. № K0492). Комплексы ДНК с PEI готовили следующим образом: 10 мкг плазмидной ДНК (не более 50 мкл) разбавляли средой DMEM до конечного объема 500 мкл; 5 мкл исходного раствора PEI (5 мг/мл) смешивали с 495 мкл среды DMEM. Разбавленные растворы ДНК и PEI инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, затем раствор PEI добавляли к раствору ДНК и тщательно перемешивали пипетированием (не менее 15 раз). Смесь выдерживали в течение 15‒20 мин при комнатной температуре. В лунки 96-луночных планшетов добавляли 10 мкл комплексов плазмида–PEI. Для уменьшения возможного цитотоксичнеского действия PEI время инкубации было ограничено 4 ч, после чего культуральную среду в лунках заменяли свежей.

Измерение активности промоторов. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 20‒50 × 10³ на лунку в зависимости от скорости пролиферации и размера клеток. На следующий день, когда клетки достигали визуальной плотности 70‒80%, их трансфицировали эквимолярной смесью плазмид pRL-TK (“Promega”)/ pGL3-hTERT для измерения активности промотора гена теломеразы человека или эквимолярной смесью плазмид pRL-TK (“Promega”)/pSurv-Luc для измерения активности промотора гена сурвивина. Плазмида pRL-TK, которая кодирует люциферазу Renilla reniformis под контролем конститутивного промотора гена тимидинкиназы, включена в смесь для трансфекции в качестве внутреннего контроля для нормирования транскрипционной активности промоторов. Через 24 ч после трансфекции клетки промывали буфером PBS, после чего лизировали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 1 × лизирующего буфера (NEB, # B3321S). Две аликвоты клеточного лизата из каждой лунки переносили в лунки 96-луночного черного планшета: одну использовали для измерения активности люциферазы Renilla, другую ‒ для измерения активности люциферазы светлячка. Активность люциферазы измеряли с использованием устройства для считывания микропланшетов Infinite M1000 Pro (“Tecan”, Швейцария) в режиме инъекции. Растворы для инъекций: 100 мМ Трис-HCl (рН 8.0), 15 мМ MgSO₄, 5 мМ EDТА, 150 мкМ АТP, 5 мМ DTT, 250 мкг/мл D-люциферина (“Biotium”, США, # 10101-1) для измерения активности люциферазы светлячка; 15 мМ EDТА, 500 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 1.6 мкг/мл Coelenterazine h (“Biotium”, # 10111-1) ‒ для измерения активности люциферазы Renilla. Активность промотора гена TERT выражали в относительных единицах. Все данные (среднее значение ± стандартное отклонение) получены по результатам не менее трех независимых экспериментов.

Измерение активности интегратора. Активность интегратора определяли, как и активность промоторов. Единственное отличие заключалось в котрансфекции смесью из четырех плазмид: pTERT-Tr1; pSurv-Tr2; pP_TRE-Tight-Luc; и pRL-TK. Плазмиды смешивали в молярном соотношении 1 : 1 : 1 : 1, активности интегратора определяли, как при измерении активности промоторов. Фоновый сигнал определяли с использованием котрансфекции смесью плазмид pEGFPN1, pP_TRE-Tight-Luc и pRL-TK, взятых в соотношении 2 : 1 : 1. Таким образом, количество репортерной плазмиды pP_TRE-Tight-Luc было одинаковым в опытах и в контрольных измерениях фона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В нашей работе проверена возможность создания двухпромоторного интегратора на основе трансактиватора rtTA с дополнительной регуляцией доксициклином. С этой целью получены генетические конструкции, схематически изображенные на рис. 1. Видно, что для активации экспрессии целевого гена, в нашем случае это ген люциферазы светлячка, кодируемый плазмидой pР_TRE-Tight-Luc, требуется связывание трансактиватора rtTA с промотором Р_Tight. Трансактиватор синтезируется из двух неактивных по отдельности фрагментов с помощью интеина Npu DnaE, который отличается высокой эффективностью реакции транс-сплайсинга [11]. Первый фрагмент трансактиватора (кодируемый плазмидой pTERT-Tr1) содержит ДНК-связывающий и димеризационный домены; второй фрагмент (кодируется плазмидой pSurv-Tr2) содержит домен, активирующий транскрипцию. Экспрессия каждого фрагмента трансактиватора контролируется отдельным промотором. С этой целью мы использовали промоторы генов теломеразы человека (в плазмиде pTERT-Tr1) и сурвивина (плазмида pSurv-Tr2) человека, которые могут быть использованы для опухолеспецифичной экспрессии целевого гена. Таким образом, наивысшая активность люциферазы в нашей схеме должна наблюдаться только в клетках с высоким уровнем активности промоторов как гена сурвивина, так и гена теломеразы человека.

Рис. 1.

Схема работы двухпромоторного интегратора (а) и логической схемы, лежащей в ее основе (б). hTERT ‒ промотор гена теломеразы человека, Surv ‒ промотор гена сурвивина человека; rtTApart1 ‒ фрагмент трансактиватора rtTA, содержащий ДНК-связывающий и димеризационный домены; rtTApart2 ‒ фрагмент трансактиватора rtTA, содержащий активирующий транскрипцию домен; intein-N и intein-C ‒ N и C фрагменты разделенного интеина Npu DnaE соответственно; P_Tight ‒ тетрациклин-чувствительный промотор системы TET-ON 3G.

Для тестирования работы интегратора мы измерили активности промоторов генов сурвивина и теломеразы человека на панели клеток млекопитающих. Результаты измерения активности промоторов в выбранных линиях клеток представлены на рис. 2. Среди этих линий клеток есть линии с очень низким уровнем активности обоих промоторов (HEK293T), с низкой активностью одного промотора и высокой другого (линии SKBR3 и MRCV2), а также линии с высокой активностью обоих промоторов (CHO и 3T3). Стоит отметить довольно большое стандартное отклонение при измерении активности промоторов, что, по-видимому, отражает зависимость активности промоторов от незначительных изменений в условиях культивирования клеток. Так, например, недавно показано, что активность промотора гена теломеразы человека зависит от фазы клеточного цикла [12].

Рис. 2.

Активность промоторов генов сурвивина и теломеразы человека в ряде линий клеток млекопитающих.

Работу интегратора тестировали путем котрансфекции в выбранные линии клеток смеси плазмид pTERT-Tr1, pSurvTr2 (плазмиды, кодирующие фрагменты трансактиватора), pP_TRE-Tight-Luc (репортерная плазмида, выходной элемент цепи) и pRL-TK, которая кодирует люциферазу Renilla под контролем промотора гена тимидинкиназы и используется для нормирования результатов эксперимента. Результаты тестирования представлены на рис. 3а. Видно, что в линиях клеток с низкой активностью обоих промоторов (линия 293Т) или одного из промоторов (SKBR3, MRC-V2), выходной сигнал интегратора существенно меньше, чем в линиях с высокой активностью обоих промоторов (CHO, 3T3). Кроме того, активность интегратора зависит от присутствия в культуральной среде доксициклина (рис. 3б).

Рис. 3.

Активность двухпромоторного интегратора: в выбранных линиях клеток (а); в присутствии/отсутствие доксициклина в клетках CHO (б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время опубликовано несколько работ, в которых с использованием нескольких схем сконструированы двухпромоторные интеграторы [3‒7]. Так, в работе [3] использовали плазмиды, кодирующие белок CRISPR и РНК cas9 под контролем промоторов генов теломеразы и уроплакина II человека. Если в клетке активны оба промотора, то образуется комплекс CRISPR/Cas9, который направлен на разрушение РНК репрессора LacI, что, в свою очередь, активирует синтез целевого гена. К недостаткам этого подхода относится необходимость в синтезе репрессора для подавления активности целевого гена. Таким образом, в первое время после трансфекции, пока не синтезировалось достаточное количество репрессора, промотор целевого гена активен, что может приводить к синтезу во всех трансфицированных клетках небольшого количества целевого белка, токсичного для клетки при суицидной генной терапии. В других работах под контролем двух разных промоторов находятся фрагменты трансактиватора, необходимого для активации промотора, регулирующего синтез целевого белка. Первый фрагмент трансактиватора представляет собой ДНК-связывающий домен GAL4, второй ‒ домен VP16 [4‒6] или VP64 [7], активирующий транскрипцию. Узнавание ДНК-связывающего и активирующего транскрипцию доменов достигается за счет добавления к ним адаптерных доменов [4‒6] или разделенного интеина [7].

В нашей работе создан двухпромоторный интегратор на основе системы TET-ON 3G. Трансактиватор из системы TET-ON 3G имеет ряд преимуществ: он не токсичен для клеток, связывается с другми участками в промоторах, что позволяет использовать его вместе с цепями на основе белка GAL4. Кроме того, активность трансактиватора можно дополнительно регулировать с помощью доксициклина. Наш интегратор оказался функционально активным: экспрессия целевого гена зависела от присутствия в составе трансфекционной смеси плазмид, кодирующих фрагменты трансактиватора. Наивысший уровень активности интегратора наблюдали только в клетках с наибольшими уровнями активности промоторов как сурвивина, так и теломеразы человека. Более того, полученный в результате реакции транс-сплайсинга трансактиватор сохранил способность изменять активность в зависимости от присутствия в культуральной среде доксициклина. В ходе работы выявлен и недостаток существующего дизайна интегратора ‒ низкий уровень экспрессии целевого гена. Именно низкий уровень выходного сигнала препятствует более детальному изучению свойств интегратора. И хотя в ряде задач (например, при направленной экспрессии высокотоксичных генов) низкий уровень выходного сигнала может быть желательным, в большинстве случаев такой слабый выходной сигнал может препятствовать использованию данного интегратора. Низкий выходной сигнал обусловлен, очевидно, малым количеством синтезированного трансактиватора. Если при трансфекции вместо плазмид pTERT-Tr1 и pSurv-Tr2 использовать плазмиду, кодирующую полный трансактиватор под контролем сильного цитомегаловирусного промотора (CMV), то выходной сигнал увеличивается более чем в 100 раз. Мы видим два подхода к решению этой проблемы. Первый ‒ использование на входе разработанного нами интегратора очень сильных промоторов. Однако большинство ткане- и онкоспецифичных промоторов довольно слабые, поэтому такой подход сильно ограничивает спектр решаемых задач. Второй подход, который в настоящее время разрабатывается нами, ‒ включение в состав фрагментов трансактиватора сигналов ядерного импорта. Добавление сигналов ядерного импорта может повысить концентрацию трансактиватора в ядре клетки, что должно намного увеличить уровень выходного сигнала интегратора.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта (№ 18-04-00212 А). Работы по созданию генно-инженерных конструкций выполнены при поддержке Российского научного фонда, проект № 19-14-00112.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.